微熱助吹掃捕集-超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定蔬菜中12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留

陳正毅, 李運(yùn)達(dá), 張卓旻, 李攻科

(中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 廣東 廣州 510275)

農(nóng)藥殘留一直是食品安全領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)問題,尤以蔬菜水果類食品中的農(nóng)藥殘留問題備受關(guān)注[1,2]。近年來,我國(guó)發(fā)布了農(nóng)藥最大殘留限量的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[3],該國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)433種農(nóng)藥在農(nóng)作物食品中的最大殘留限量做出了明確規(guī)定。但是隨著農(nóng)藥品種越來越多和農(nóng)藥使用量、使用時(shí)間的不確定性,近年來農(nóng)產(chǎn)品尤其是蔬菜中的農(nóng)藥殘留時(shí)有超標(biāo)現(xiàn)象發(fā)生。這些農(nóng)藥殘留不僅會(huì)污染環(huán)境[4],還會(huì)通過食物鏈的富集作用[5],對(duì)人體健康造成重大威脅。食品安全日常監(jiān)測(cè)任務(wù)繁雜,樣品量大,時(shí)效性強(qiáng),發(fā)展農(nóng)藥殘留快速準(zhǔn)確分析方法對(duì)食品安全分析具有重要意義[6]。

由于蔬菜樣品基質(zhì)復(fù)雜,農(nóng)藥殘留的分析過程中樣品前處理步驟最為關(guān)鍵[7]。目前,蔬菜水果中農(nóng)藥殘留分析的前處理方法主要有固相萃取[8-10]、固相微萃取[11-13]、分散液液微萃取[14-16]、QuEChERS[17-19]、頂空萃取[20-22]和吹掃捕集技術(shù)[23,24]等。頂空萃取和吹掃捕集技術(shù)雖然基質(zhì)消除能力好,靈敏度高,但耗時(shí)較長(zhǎng),不適于農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場(chǎng)快速分析檢測(cè),而微型化則有助于提高吹掃捕集的效率,可有效縮短樣品前處理時(shí)間。本課題組[25]構(gòu)建了一種微型熱助吹掃捕集技術(shù),其基體消除能力效果好,樣品前處理耗時(shí)短,結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼檢測(cè)技術(shù),已將其用于復(fù)雜樣品中甲醛、苯硫酚、硫離子和甲醇的快速分析[25]。本文將微熱助吹掃捕集技術(shù)與超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra high pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UHPLC-MS/MS)結(jié)合,建立了蔬菜中12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留同時(shí)快速分析的方法。該方法極大地縮短了農(nóng)藥殘留分析過程樣品前處理的時(shí)間,并有效提高了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑、與材料

超高壓液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS-8050,日本島津公司);超純水儀(UNIQUE-R20,廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司);高純氮?dú)?99.9%,大連大特氣體有限公司);超聲波清洗器(KQ-300DE,昆山超聲儀器有限公司);離心機(jī)(H1805,湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司);可控電壓直流電源器(MS305D,東莞邁盛電源科技有限公司)。

西維因、禾草敵、三唑酮、二甲戊樂靈、乙草胺、甲霜靈、毒死蜱、硫線磷、抗蚜威、西瑪津、撲草凈標(biāo)準(zhǔn)甲醇溶液均購(gòu)自上海阿拉丁試劑公司(100 mg/L);甲基立枯磷標(biāo)準(zhǔn)甲醇溶液購(gòu)自北京百靈威試劑公司(100 mg/L)。色譜純甲醇、乙腈購(gòu)自北京迪馬科技有限公司;甲酸(色譜純)購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑公司。油菜、生菜、黃瓜3種實(shí)際蔬菜樣品購(gòu)自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。

實(shí)驗(yàn)所用微熱助吹掃捕集裝置在基于前期工作[25]的基礎(chǔ)上稍有改進(jìn),裝置包含載氣系統(tǒng)、加熱腔、氣化池和接收管;氣化池設(shè)置于加熱腔內(nèi),用于放置樣品,加熱腔為一腔體,其兩端設(shè)置有進(jìn)氣口和出氣口,在腔體上方與氣化池對(duì)應(yīng)的位置設(shè)置有進(jìn)樣口;載氣系統(tǒng)通過進(jìn)氣口與加熱腔相連;接收管通過出氣口與加熱腔相連,接收管內(nèi)置有吸收氣化樣品的溶液。該裝置對(duì)樣品的需求量少,加熱效率高,可以實(shí)現(xiàn)300 ℃以內(nèi)的控溫加熱。

1.2 樣品前處理

稱取研磨過的蔬菜樣品2.0 g,置于離心管中,加入5.0 mL乙腈振蕩1 min,最后用熱吹掃捕集裝置進(jìn)行凈化和富集。具體步驟如下:首先在吸收管中加入5.0 mL甲醇吸收液,氮?dú)饬魉僬{(diào)至0.10 L/min,然后向揮發(fā)池中加入200 μL樣品提取液,最后調(diào)節(jié)加熱電壓至25 V,使加熱溫度達(dá)到200 ℃。加熱5 min后停止加熱,持續(xù)通氮?dú)? min。凈化結(jié)束后用1.0 mL甲醇清洗加熱腔內(nèi)壁,并轉(zhuǎn)移至裝有接收液的比色管中,用甲醇定容至10.0 mL容量瓶中,取1.0 mL樣品液,過0.22 μm尼龍66濾膜后待測(cè)。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[3]規(guī)定,蔬菜樣品中的農(nóng)藥殘留含量最終以μg/kg表示。

1.3 UHPLC-MS/MS條件

UHPLC條件:色譜柱為Shim-pack xr-ODS C18柱(75 mm×2.0 mm, 2.2 μm,日本島津公司);柱溫:40 ℃;樣品室溫度:4 ℃;流動(dòng)相A為0.1%(v/v)甲酸水溶液;流動(dòng)相B為乙腈;流速:0.40 mL/min。梯度洗脫程序:0～2.0 min, 30%B～60%B; 2.0～4.0 min, 60%B～80%B; 4.0～6.0 min, 80%B～90%B; 6.0～6.1 min, 90%B～30%B; 6.1～8.0, 30%B。進(jìn)樣量:5.0 μL。

MS/MS條件:離子源為ESI源,正離子模式;霧化氣、加熱氣和干燥氣流速分別為3、10和10 L/min;離子源、脫溶劑和加熱塊溫度分別為400、250和400 ℃。監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)

Q1/Q3 pre bias: Q1/Q3 prerod bias; CE: collision energy; * quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 分析條件的優(yōu)化

12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留的定量和定性離子對(duì)根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 23200.14-2016進(jìn)行優(yōu)化選取[26],經(jīng)過優(yōu)化后各個(gè)離子對(duì)的MS/MS參數(shù)見表1。

在保證分離度的前提下,為了提高分析速度,提高了梯度洗脫程序中有機(jī)相的初始比例和上升速率,使得12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留在7.0 min內(nèi)分離完全(見圖1),整個(gè)UHPLC-MS/MS檢測(cè)過程可在8 min內(nèi)快速完成。

圖 1 加標(biāo)青瓜樣品中12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留(8.0 μg/kg)的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of the 12 semi-volatile pesticide residues (8.0 μg/kg) in a spiked cucumber sample Peaks. 1-12 were the same as that in Table 1.

圖 2 加熱溫度對(duì)12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留(10 μg/kg)回收率的影響(n=3)Fig. 2 Effect of heating temperatures on the recoveries of the 12 semi-volatile pesticide residues (10.0 μg/kg)(n=3)

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1加熱溫度

半揮發(fā)性農(nóng)藥的沸點(diǎn)較高,加熱溫度決定了待測(cè)物從基體揮發(fā)后被富集的效率。本文研究對(duì)比了加熱溫度分別為140、170、200和230 ℃時(shí)半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留的回收率,結(jié)果見圖2。當(dāng)加熱溫度低于200 ℃時(shí),12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留的回收率為15.7%～80.2%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.0%～11.5%。加熱溫度升高至200 ℃時(shí),12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留的回收率為91.0%～105.0%, RSD為3.1%～6.1%。而當(dāng)加熱溫度進(jìn)一步升至230 ℃時(shí),部分待測(cè)物的回收率降低,如硫線磷的回收率從107.0%降至84.3%, 12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留的RSD增大至7.0%～16.9%。結(jié)果表明,適當(dāng)提高加熱溫度有利于半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留揮發(fā)完全,而過高的加熱溫度會(huì)導(dǎo)致某些半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留分解從而影響熱吹掃捕集的回收率和穩(wěn)定性。因此,實(shí)驗(yàn)最終選擇200 ℃作為最優(yōu)加熱溫度。

圖 3 加熱時(shí)間對(duì)12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留(10 μg/kg)回收率的影響(n=3)Fig. 3 Effect of heating time on the recoveries of the 12 semi-volatile pesticide residues (10 μg/kg) (n=3)

圖 4 氮?dú)饬魉賹?duì)12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留(10 μg/kg)回收率的影響(n=3)Fig. 4 Effect of nitrogen flow speeds on the recoveries of the 12 semi-volatile pesticide residues (10 μg/kg) (n=3)

2.2.2加熱時(shí)間

加熱時(shí)間是影響回收率的另一重要因素。加熱時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致樣品基質(zhì)分解出揮發(fā)性雜質(zhì),從而干擾測(cè)定結(jié)果;加熱時(shí)間過短,待測(cè)物揮發(fā)不完全,會(huì)使回收率偏低。本文對(duì)比了加熱時(shí)間分別為2、5和10 min時(shí)半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留的回收率,結(jié)果見圖3。當(dāng)加熱時(shí)間為2 min時(shí),12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留的回收率為67.0%～83.6%, RSD為6.2%～11.2%。當(dāng)加熱時(shí)間延長(zhǎng)至5 min時(shí),12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留的回收率為90.5%～106%, RSD為2.9%～5.3%。而當(dāng)加熱時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)至10 min時(shí),部分待測(cè)物的回收率明顯降低,例如西維因的回收率從98.0%降至48.6%, 12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留的RSD增大至5.6%～13.3%。適當(dāng)延長(zhǎng)加熱時(shí)間有利于半揮發(fā)性農(nóng)殘揮發(fā)完全,而加熱時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)影響熱吹掃捕集的回收率和穩(wěn)定性。因此,實(shí)驗(yàn)最終選擇5 min作為最優(yōu)加熱時(shí)間。

2.2.3氮?dú)饬魉?/p>

氮?dú)饬魉贂?huì)影響半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留被吹掃出樣品基質(zhì)的效率。本文對(duì)比了氮?dú)饬魉俜謩e為0.05、0.10和0.50 L/min時(shí)半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留的回收率,結(jié)果見圖4。當(dāng)?shù)獨(dú)饬魉贋?.05 L/min時(shí),12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留的回收率為45.0%～80.3%, RSD為7.6%～13.2%。當(dāng)?shù)獨(dú)饬魉偬岣咧?.10 L/min時(shí),12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留的回收率為92.0%～105.0%, RSD為3.4%～5.6%。而當(dāng)?shù)獨(dú)饬魉龠M(jìn)一步提高至0.50 L/min時(shí),部分待測(cè)物的回收率明顯降低,例如乙草胺的回收率從104.0%降低至64.0%, 12種農(nóng)藥殘留的RSD增至7.1%～15.4%。結(jié)果表明,流速過小會(huì)使加熱腔體內(nèi)產(chǎn)生渦旋氣流,導(dǎo)致待測(cè)物吹掃不完全；而流速過大會(huì)導(dǎo)致待測(cè)物吸收不完全,從而影響熱吹掃捕集的回收率和穩(wěn)定性。因此,實(shí)驗(yàn)最終選擇0.10 L/min作為最優(yōu)氮?dú)饬魉佟?/p>

2.3 方法學(xué)考察

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,建立了微熱助吹掃捕集-超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速同時(shí)分析蔬菜中12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留的方法。取12種半揮發(fā)性農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,按1.2節(jié)前處理方法處理,以各半揮發(fā)性農(nóng)藥對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(y),經(jīng)換算后得到的最終待測(cè)樣品的農(nóng)藥殘留含量為橫坐標(biāo)(x, μg/kg)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,12種半揮發(fā)性農(nóng)藥的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99(見表2)。以信噪比(S/N)為3和10時(shí)的含量定義檢出限和定量限。結(jié)果表明,12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留的檢出限為0.3～1.3 μg/kg,定量限為1.0～4.3 μg/kg(見表2)。

表 2 12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

y: peak area;x: content, μg/kg.

配制高、中、低3個(gè)水平的12種半揮發(fā)性農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按相應(yīng)的加標(biāo)量加入空白生菜樣品中,每個(gè)水平做3個(gè)平行樣品,分別做3批,分3 d進(jìn)樣,測(cè)定加標(biāo)后生菜樣品中12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留的含量。結(jié)果表明,12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留回收率為80.0%～120.0%,日內(nèi)精密度為3.0%～9.0%,日間精密度為3.2%～9.3%(見表3)。該方法的靈敏度、檢出限和精密度與目前蔬菜農(nóng)殘的檢測(cè)方法[27-29]相比無顯著差異,說明所建方法完全滿足蔬菜中痕量農(nóng)藥殘留的定量分析要求。

2.4 實(shí)際樣品分析

將所建立的方法用于油菜、生菜、黃瓜3種蔬菜樣品的分析,并且與傳統(tǒng)的QuEChERS方法[3]進(jìn)行對(duì)比。采用兩種方法時(shí)12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留分析結(jié)果的相對(duì)誤差為-13.6～16.8%,說明本方法與傳統(tǒng)QuEChERS方法無明顯差異。同時(shí)對(duì)比了微熱助吹掃捕集前處理方法與QuEChERS法基體消除的效果,結(jié)果見圖5。經(jīng)過微熱助吹掃捕集前處理后的樣品基線比QuEChERS方法平穩(wěn),說明微熱助吹掃捕集的前處理方法對(duì)半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留更加有優(yōu)勢(shì)。此外,QuEChERS方法檢測(cè)一個(gè)樣品至少耗時(shí)2 h,而本方法的整個(gè)分析過程小于20 min。說明該方法適用于蔬菜中多種痕量半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留的快速同時(shí)分析。

圖 5 采用(a)微型熱助吹掃捕集前處理方法和(b)QuEChERS方法時(shí)加標(biāo)生菜樣品(50 μg/kg)的質(zhì)譜圖 Fig. 5 Mass spectra of the spiked cole samples (50 μg/kg) by (a) miniaturized thermal-assisted purge and (b) QuEChERS methods Nos. 1-12 were the same as that in Table 1.

3 結(jié)論

本文將微熱助吹掃捕集技術(shù)與超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合,測(cè)定蔬菜中12種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留。該方法使用有機(jī)溶劑少,樣品前處理耗時(shí)短,基質(zhì)凈化效果好,有良好的靈敏度和穩(wěn)定性。該方法提高了檢測(cè)速率,為蔬菜中多種半揮發(fā)性農(nóng)藥殘留的快速篩查提供了高效的前處理方法和分析檢測(cè)技術(shù)。