解毒祛瘀滋腎方對(duì)MRL/lpr狼瘡小鼠皮膚組織JAK1/STAT3信號(hào)通路的影響

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 杭州 310005

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種慢性自身免疫性疾病，其免疫異常與細(xì)胞因子密切相關(guān)。在疾病活動(dòng)期及組織損傷時(shí)常表現(xiàn)出細(xì)胞因子水平異常，如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、干擾素（interferon，IFN）及白介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13和IL-15等水平上調(diào)，而上述細(xì)胞因子均可通過酪氨酸蛋白激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子家族（Janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）信號(hào)通路發(fā)揮其生物學(xué)作用[1]。該通路上的關(guān)鍵信號(hào)分子包括酪氨酸蛋白激酶1（Janus kinase 1，JAK1）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducers and activators of transcription 1，STAT1）、STAT3、STAT4、STAT6等。研究表明，JAK/STAT信號(hào)通路的異常激活與SLE的皮膚損害、腎臟炎癥及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)[2]。

目前臨床上SLE的治療仍以糖皮質(zhì)激素加免疫抑制劑為主，雖然能夠有效控制疾病活動(dòng)、改善病情，提高SLE患者的存活率，但也帶來了嚴(yán)重的不良反應(yīng)。實(shí)踐證明，中醫(yī)藥在自身免疫性疾病的治療中有著較大的潛力。解毒祛瘀滋腎方是范永升教授經(jīng)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐總結(jié)出的治療SLE的經(jīng)驗(yàn)方[3-4]，臨床和實(shí)驗(yàn)研究證明該方具有明顯的抗炎、調(diào)節(jié)免疫、改善代謝紊亂、降低西藥毒副作用及減少感染等作用，并且能顯著改善皮膚損害（面部紅斑、口腔潰瘍、脫發(fā)、光過敏等）[5-7]，但目前具體機(jī)制尚不明確。因此，本研究擬探討解毒祛瘀滋腎方對(duì)MRL/lpr狼瘡小鼠皮膚組織JAK1/STAT3信號(hào)通路的影響，為闡明解毒祛瘀滋腎方治療SLE的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑及藥品 JAK1抗體購于美國(guó)Abcam公司（批號(hào)：ab133666）；STAT3和β-actin單克隆抗體均購于武漢賽維爾生物公司（批號(hào)：GB11176、GB12001）；IL-6、IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒均購于美國(guó)e-Bioscience公司（批號(hào)：109409011、107275015）；蛋白定量檢測(cè)試劑盒、放射免疫沉淀法緩沖液、苯甲基磺酰氟化物（phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF）、過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠抗體、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒均購自武漢賽維爾生物公司（批號(hào)：G2026、G2002、G2008、GB23301、G2014）。解毒祛瘀滋腎方由生地黃15g、炙鱉甲12g、青蒿12g、升麻9g、積雪草15g、赤芍12g、炒薏苡仁15g、佛手片9g、生甘草6g、白花蛇舌草15g組成，以上中藥由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院中藥房提供，并制成生藥濃度為0.5g·mL-1的濃縮液；強(qiáng)的松片購于浙江仙琚制藥股份有限公司（批號(hào)：150428），以蒸餾水溶解，制備成濃度為0.5mg·mL-1的混懸液。

1.2 主要儀器 ISO9001型電子天平購于德國(guó)Sartorius公司；Eppendorf 5417R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；V300型掃描儀購于EPSON公司；Thermo Multiskan MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀購于芬蘭雷勃公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和干預(yù) 8周齡雌性無特殊病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)MRL/lpr小鼠30只和C57BL/6小鼠10只，均由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2012-0005]。所有動(dòng)物均于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心實(shí)驗(yàn)室全封閉SPF狀態(tài)下飼養(yǎng)[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2018-0012]，自由采食飲水。 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將MRL/lpr小鼠隨機(jī)分為西藥組（強(qiáng)的松組）、中藥組（解毒祛瘀滋腎方組）和模型組，每組10只；另將C57BL/6小鼠作為對(duì)照組。中藥組予解毒祛瘀滋腎方水煎劑灌胃，西藥組予強(qiáng)的松片混懸液灌胃，模型組和對(duì)照組予0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組均每次灌胃體積均為0.01mL/g，1次/d，共8周。連續(xù)干預(yù)8周后，從眼眶靜脈采血，室溫靜置4h，3 000r/min離心10min，分離血清樣本，-80℃保存待用。采血后處死小鼠，選取皮損組織分成2份，一份用甲醛固定，另一份-80°C保存，以備蛋白表達(dá)檢測(cè)。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 一般情況觀察 觀察各組小鼠的毛色光澤、脫毛情況、活動(dòng)狀態(tài)及頸部、腋下、腹股溝淋巴結(jié)腫大的情況。

1.4.2 血清免疫指標(biāo)檢測(cè) 采用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)小鼠血清IL-6、IL-10含量，具體操作依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的含量及對(duì)應(yīng)的光密度（optical density，OD）值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品含量。

1.4.3 皮膚組織病理學(xué)觀察 將甲醛固定的小鼠皮損組織制成石蠟塊，4μm切片后依次脫蠟脫水，蘇木精-伊紅（hema toxylin-eosin，HE）染色，分別在200、400倍光鏡下觀察各組皮膚病理改變情況。

1.4.4 皮膚組織JAK1和STAT3蛋白表達(dá)檢測(cè) 取-80℃保存的小鼠皮損組織，采用Western blot法檢測(cè)。皮膚組織塊稱重，利用液氮、研缽粉碎組織塊，加入細(xì)胞裂解液，按說明書進(jìn)行操作，提取的蛋白-20℃保存?zhèn)溆?。取等量的蛋白提取?0μg（體積×蛋白質(zhì)濃度），十二烷基硫酸鈉-SDS經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳后轉(zhuǎn)膜；分別加入JAK1、STAT3單克隆抗體 （稀釋比例：1:1 000），4℃孵育過夜，以三乙醇胺吐溫緩沖液（triethanolamine buffered saline solution-tween，TBS-T）洗滌3次，每次10min，加入二抗，4℃緩慢搖動(dòng)孵育1h，洗滌后以ECL試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，暗室曝光4min顯像。將膠片進(jìn)行掃描存檔，Photoshop整理去色，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況結(jié)果比較 對(duì)照組小鼠皮毛和活動(dòng)正常，頸部、腋下、腹股溝未見明顯腫大的淋巴結(jié)；模型組小鼠皮毛晦暗枯槁、缺乏光澤，頭部皮膚毛發(fā)缺損，腫大淋巴結(jié)數(shù)量明顯增多；與模型組比較，中藥組和西藥組小鼠毛色、皮損明顯減輕，均未見毛發(fā)缺損，中藥組小鼠腫大淋巴結(jié)的數(shù)量明顯減少，西藥組未見明顯腫大的淋巴結(jié)。

2.2 各組小鼠血清IL-6、IL-10含量比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清IL-6、IL-10含量均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，中藥組、西藥組血清IL-6、IL-10含量均明顯下降（P＜0.01）。與西藥組比較，中藥組血清IL-6含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；血清IL-10含量明顯升高（P＜0.05）。見表1。表明解毒祛瘀滋腎方和強(qiáng)的松均能有效降低小鼠血清IL-6、IL-10含量，但解毒祛瘀滋腎方降低血清IL-10的能力弱于強(qiáng)的松。

2.3 皮膚組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 對(duì)照組小鼠基底細(xì)胞未見明顯液化變性，真皮層無明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1A1～2。與對(duì)照組比較，鏡下可見模型組小鼠真皮層被增生的結(jié)締組織取代，可見大量成纖維細(xì)胞與纖維細(xì)胞，并有較多淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；皮膚表皮層基底細(xì)胞液化變性。見圖1B1～2。中藥組表皮層少見基底細(xì)胞液化變性，真皮層可見少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1C1～2。與模型組比較，中藥組小鼠皮膚組織基底細(xì)胞液化變性明顯減輕，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。西藥組表皮層可見少量基底細(xì)胞液化變性，真皮層可見極少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1D1～2。

表1 各組小鼠血清IL-6、IL-10含量比較（μg·mL-1，±s）Tab.1 Comparison of serum contents of IL-6 and IL-10 in each group（μg·mL-1，±s）

表1 各組小鼠血清IL-6、IL-10含量比較（μg·mL-1，±s）Tab.1 Comparison of serum contents of IL-6 and IL-10 in each group（μg·mL-1，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與西藥組比較，#P＜0.05Note:Compared with control group， *P＜0.05， **P＜0.01;compared with model group，△△P＜0.01;compared with western medicine group，#P＜0.05

組別 n IL-6 IL-10對(duì)照組 10 9.46±1.99 20.36±3.48模型組 10 39.28±8.73** 113.85±25.07**中藥組 10 18.65±5.02**△△ 39.20±10.60**△△#西藥組 10 15.79±5.18*△△ 28.01±7.25△△

2.4 各組小鼠皮膚組織JAK1和STAT3蛋白表達(dá)比較與對(duì)照組比較，模型組JAK1、STAT3蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組、西藥組JAK1、STAT3蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01）；與西藥組比較，中藥組JAK1、STAT3蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表2。

3 討論

SLE作為一種典型的自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)差異較大，通常包括皮疹、關(guān)節(jié)炎和腎炎等[8-9]。皮膚損害如頰部紅斑、脫發(fā)、黏膜潰瘍、盤狀病變等是SLE最常見的臨床癥狀之一，發(fā)生率80%～90%[10]。因其出現(xiàn)較早，且與病情密切相關(guān)，因此在SLE的診斷及治療中有著重要的意義[11]。

SLE在中醫(yī)學(xué)中屬 “日曬瘡”“蝴蝶斑”“陰陽毒”等范疇。實(shí)踐證明，中醫(yī)藥在SLE的臨床治療中表現(xiàn)出較大的潛力，解毒祛瘀滋腎方是范永升教授臨床治療該疾病的經(jīng)驗(yàn)方。SLE以肝腎陰虛為本，熱毒血瘀為標(biāo)，解毒祛瘀滋腎方以生地黃為君，清熱涼血益陰；臣以白花蛇舌草、升麻清熱解毒消斑，鱉甲補(bǔ)陰益腎退熱；佐以赤芍、積雪草活血散血，青蒿退熱開胃醒脾、疏理少陽氣機(jī)；佛手、生甘草為使藥疏理氣機(jī)、調(diào)和諸藥，諸藥合用，標(biāo)本兼治，共奏清熱解毒、活血化瘀、益腎養(yǎng)陰之功。研究發(fā)現(xiàn)，解毒祛瘀滋腎方具有明顯的抗炎、調(diào)節(jié)免疫、改善代謝紊亂、降低西藥毒副作用及減少感染等作用，并且能顯著改善SLE引起的皮膚損害[4，7，12]。 本研究中，與模型組比較，解毒祛瘀滋腎方干預(yù)后的MRL/lpr小鼠脫毛現(xiàn)象及皮膚病理損害均得到一定程度的改善，再一次驗(yàn)證了解毒祛瘀滋腎方對(duì)SLE皮膚損害的治療作用。

圖1 各組小鼠皮膚組織病理切片（HE染色）Fig.1 Pathological sections of skin tissue in each group （HE staining）

圖2 各組小鼠皮膚組織JAK1、STAT3蛋白表達(dá)比較Fig.2 Comparison of protein expression of JAK1 and STAT3 in skin tissue in each group

表2 各組小鼠皮膚組織JAK1、STAT3蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.2 Comparison of protein expression of JAK1 and STAT3 in skin tissue in each group（±s）

表2 各組小鼠皮膚組織JAK1、STAT3蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.2 Comparison of protein expression of JAK1 and STAT3 in skin tissue in each group（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01Note:Compared with control group， *P＜0.05， **P＜0.01;compared with model group，△△P＜0.01

組別 n JAK1相對(duì)表達(dá)量 STAT3相對(duì)表達(dá)量對(duì)照組 10 0.076±0.040 0.092±0.065模型組 10 0.596±0.186** 0.629±0.215**中藥組 10 0.197±0.486*△△ 0.230±0.106*△△西藥組 10 0.235±0.087**△△ 0.336±0.141**△△

SLE疾病活動(dòng)期表現(xiàn)出T、B淋巴細(xì)胞的過度活化、細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡。IL-6、IL-10是輔助性T細(xì)胞2（helper T lymphocyte 2，Th2）分泌的細(xì)胞因子，在SLE活動(dòng)期血清IL-6、IL-10含量上調(diào)，能夠促進(jìn)B細(xì)胞的增殖分化，并可通過JAK1/STAT3通路刺激自身抗體產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致循環(huán)免疫復(fù)合物堆積，引起組織和器官損傷[13-15]。JAK/STAT是一種多效聯(lián)級(jí)信號(hào)通路，主要傳導(dǎo)細(xì)胞增殖凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等信號(hào)，是大量細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)的主要途徑，其中也包括IL-6、IL-10。IL-6、IL-10分別通過與白介素-6受體（interleukin-6 receptor，IL-6R）、白介素-10受體（interleukin-10 receptor，IL-10R） 結(jié)合， 啟動(dòng)JAK1/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。IL-6、IL-10分別與相應(yīng)受體結(jié)合后，產(chǎn)生IL-6/IL-6R、IL-10/IL-10R復(fù)合體，促使JAK1活化，進(jìn)而促進(jìn)STAT3的酪氨酸殘基磷酸化，使STAT3與其受體分離，形成同源或者異源二聚體，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中并與靶基因結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[16]。研究表明在SLE疾病過程中，調(diào)節(jié)血清細(xì)胞因子水平和抑制JAK/STAT3信號(hào)通路均可抑制自身抗體的產(chǎn)生[17]，緩解疾病狀態(tài)。本研究中，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清IL-6、IL-10含量明顯增高，皮損組織中JAK1、STAT3蛋白表達(dá)水平也明顯增高。經(jīng)強(qiáng)的松、解毒祛瘀滋腎方治療后血清IL-6、IL-10含量明顯降低，皮膚組織JAK1、STAT3蛋白表達(dá)亦明顯降低。與西藥組比較，中藥組血清IL-6含量及皮損組織中JAK1、STAT3蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但血清IL-10含量明顯升高。以上研究結(jié)果表明，解毒祛瘀滋腎方、強(qiáng)的松均能有效降低小鼠血清IL-6、IL-10含量，并能有效抑制皮膚組織JAK1、STAT3蛋白表達(dá)，但解毒祛瘀滋腎方降低血清IL-10的能力弱于強(qiáng)的松。

綜上所述，本研究在前期臨床觀察基礎(chǔ)上探討了解毒祛瘀滋腎方對(duì)SLE皮損組織JAK/STAT信號(hào)通路的影響。結(jié)果表明，解毒祛瘀滋腎方有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多方面的作用，其作用機(jī)制可能與抑制JAK/STAT信號(hào)通路的過度激活有關(guān)。后續(xù)研究將進(jìn)行其他信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，以進(jìn)一步明確解毒祛瘀滋腎方對(duì)SLE的多靶點(diǎn)作用機(jī)制。