實時熒光定量PCR 技術(shù)在畜禽肉類檢測中的應(yīng)用

□ 夏 瀾 嵊州市食品藥品檢驗檢測中心

肉類是人類獲取蛋白質(zhì)的主要來源之一，其中的營養(yǎng)物質(zhì)是維持人類生命活動所必需的。從蛋白質(zhì)水平和核酸水平上對肉類成分進行分析已經(jīng)成為解決肉類摻假問題的主要手段。在蛋白水平上，常常通過液相色譜、ELISA（酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)）以及高效液相色譜等對樣品的成分進行分析。但這類方法在檢測加工樣品時的特異性、準確性較差，且對檢測樣品的處理和儀器的要求較高。在核酸水平上進行檢測時，由于DNA 的穩(wěn)定性和特異性可以較為準確的對待測樣品的成分進行分析。目前這類檢測方法中的DNA探針雜交、普通PCR、限制性片段長度多態(tài)性擴增以及熒光定量PCR 在肉類來源的檢測中應(yīng)用的較多[1—4]。

1 熒光定量PCR 技術(shù)的檢測原理

聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）最早是KaryMullis 在分析疾病基因時發(fā)明的[5]。而熒光定量PCR 技術(shù)是在普通PCR 的基礎(chǔ)上，將能夠發(fā)出熒光信號的探針或染料與引物一起加入到反應(yīng)體系中，根據(jù)堿基互補配對原則進行半保留復(fù)制，通過對熒光信號的收集達到實時監(jiān)控PCR 過程的目的[6]。該方法在封閉的體系中進行擴增和實時監(jiān)測，無需電泳就能得出結(jié)果，且在一定程度上避免了檢測樣品之間的交叉污染。同時，熒光定量PCR 的模板序列較短，可以縮短檢測時間，快速得到檢測結(jié)果。而根據(jù)產(chǎn)生熒光信號方式的不同，熒光定量PCR 技術(shù)可分為Taq Man 探針法和SYBR Green I 熒光染料法。

2 熒光定量PCR 技術(shù)在肉制品檢測過程中的應(yīng)用

使用實時熒光定量PCR 技術(shù)對肉制品肉源的檢測主要是檢測動物細胞中線粒體相關(guān)基因。眾所周知，線粒體DNA 是細胞質(zhì)遺傳的，具有含量多、分裂快等優(yōu)點，同時不同組織部位中線粒體DNA 的含量具有很大的差異。因此對肉制品中肉種類以及數(shù)量的檢測通常選用線粒體基因。此外，相比較核基因，線粒體基因的檢測具有較高的靈敏度和穩(wěn)定性。常用作檢測肉類來源的線粒體基因主要是細胞色素b 基因、細胞色素c 氧化酶亞基基因和線粒體D—loop 區(qū)域的基因[4，7]。

2.1 TaqMan 探針實時熒光定量PCR 技術(shù)

肉制品的鑒定主要依靠蛋白質(zhì)檢測和基因檢測這兩種方法，相比較基因，蛋白質(zhì)在食品的加工過程中易受到高溫、高壓等加工條件的影響，而脫氧核糖核酸具有更好的熱穩(wěn)定性。另一方面，食品中動物性成分的DNA序列的保守性更強，且其在提取過程中基本不受外界環(huán)境以及加工過程的影響。在混雜著牛肉、雞肉以及豬肉的混合肉類中，使用TaqMan 探針能夠有效檢測到豬肉成分，且最低的極限為0.1 pg。除了單一食品的檢測，在摻雜其他原料的混合肉制品檢測過程中，這種方法也具有較強的檢測效率。研究人員對市場上銷售的包括牛肉干、火腿、香腸在內(nèi)的22 種常見的肉類加工產(chǎn)品進行檢測，發(fā)現(xiàn)這些肉制品中均能夠檢測到豬肉特異基因的熒光信號，這表明這些肉類商品中均含有豬肉的成分，可能存在摻假。同一種肉制品不同批次的檢測結(jié)果也存在著較大的差異，這可能是由于不同組織肉中核酸的提取量不同[3—4]。

2.2 熒光染料實時熒光定量PCR技術(shù)

與設(shè)計引物探針相比，DNA 復(fù)制過程中熒光染料嵌入到DNA 分子中具有更強的優(yōu)勢。使用SYBR Green I 染料對市場上售賣的豬肉樣品的最低檢測極限在0.1 ng 左右。相似的結(jié)果也被其他的研究人員發(fā)現(xiàn)，如使用Eva Green 染料對加工肉制品中是否存在豬肉進行分析，檢測結(jié)果顯示這種方法也能夠準確檢測出生肉制品和熟肉制品中豬肉的含量。除了對檢測樣品中摻雜的肉類進行定量的檢測外，該方法還能進行定性檢測。如研究人員使用熒光染料對市售牛肉中是否含有馬肉進行定量和定性的分析，結(jié)果顯示使用熒光染料能夠檢測到的最低值為0.1 pg。這些結(jié)果表明熒光染料熒光定量PCR 技術(shù)在定量和定性檢測肉類來源方面發(fā)揮重要作用[4，8—9]。

3 展望

雖然熒光定量PCR 技術(shù)在肉制品種類以及食品安全檢測方面有著不可替代的優(yōu)勢，但該技術(shù)目前在應(yīng)用上仍然存在一些問題。如肉制品的加工過程可能會導(dǎo)致DNA 鏈的斷裂，并在擴增過程中產(chǎn)生交叉污染，熒光探針或染料的價格較高等都會影響其應(yīng)用及檢測效果。因此，應(yīng)進一步研究熒光定量PCR 技術(shù)與其他技術(shù)的結(jié)合，將其更好地應(yīng)用到肉制品的檢測工作中。