重組葡激酶對(duì)小型豬冠脈血栓的溶栓作用研究*

李 光，方曉蘭，任 仲，李克強(qiáng)，周松輝，胡道奇，吳剛強(qiáng)，王太林，李衛(wèi)平△

(1.岳陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，岳陽 414000; 2.湖南康潤藥業(yè)股份有限公司，岳陽 414000)

心、腦血管病的血栓形成及合并癥是引起老年人死亡和致殘的一個(gè)主要原因，溶栓治療對(duì)諸如急性心肌梗塞、腦栓塞及靜脈栓塞等嚴(yán)重威脅生命的疾病會(huì)產(chǎn)生有益的影響。目前臨床使用的溶栓藥如重組鏈激酶(recombinant streptokinase, r-SK)、重組組織型纖溶酶原激活劑(recombinant ateplase，rt-Pa)均為纖溶酶原激活劑，它們能轉(zhuǎn)化血液纖溶系統(tǒng)中無活性纖溶酶原為纖溶酶，纖溶酶溶解血栓中的纖維蛋白，產(chǎn)生溶栓作用。但纖維蛋白非特異性溶栓藥溶解纖維蛋白同時(shí)，也可以激活凝血系統(tǒng)中正常成分如纖維蛋白原、凝血因子V及凝血因子VII等其它血漿蛋白，引起出血傾向，因此具有強(qiáng)效及纖維蛋白特異性的纖溶酶原激活劑是較理想的溶栓藥。葡激酶具有此特點(diǎn)，它以間接作用方式激活纖溶酶原，比常用的溶栓劑鏈激酶溶栓速度快、效力強(qiáng)，出血副反應(yīng)較少[1]。但是葡激酶為異源蛋白，故其免疫原性比rt-Pa強(qiáng)。本研究基于自主研發(fā)的重組葡激酶，考察重組葡激酶對(duì)于小型豬冠脈血栓形成模型的溶栓效果，為重組葡激酶應(yīng)用于心肌梗死的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑、樣品與儀器

受試藥：注射用重組葡激酶(recombinant staphylokinase，r-SAK)，湖南康潤藥業(yè)股份有限公司實(shí)驗(yàn)室制備。白色絮狀固體，純度 98.36%，規(guī)格為每瓶 5、10、30 mg(106IU)，比活性為4.6×104AU·mg-1。臨用前用無菌注射用水溶解，并用生理鹽水稀釋至所需濃度。陽性對(duì)照藥：重組鏈激酶(recombinant streptokinase，r-SK)，上海實(shí)業(yè)醫(yī)大生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。無菌、白色凍干粉末，每瓶5 mg(5×105IU)。臨用前用無菌注射用水溶解，并用生理鹽水稀釋至所需濃度。溶劑對(duì)照：本研究室提供，白色絮狀固體。不含重組葡激酶，其組分(甘露醇1.2%，0.1 mol·L-1NaCl，0.02 moL·L-1PB，pH=7.6)與制劑相同。臨用前用無菌注射用水溶解，并用生理鹽水稀釋至所需濃度。金黃色葡萄球菌，湖南康潤藥業(yè)股份有限公司質(zhì)量部保存。實(shí)驗(yàn)前用新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，70℃滅活，稀釋成每毫升約含 50 億個(gè)細(xì)菌的菌液，4℃冷藏保存?zhèn)溆谩Ｑ獫{纖維蛋白原定量試劑盒，上海美旋生物科技有限公司。其它試劑均為市售。RM-6300多導(dǎo)生理記錄儀，日本光電公司產(chǎn)品，RTA-1100M四導(dǎo)熱陣記錄儀，日本光電公司產(chǎn)品，MFV-3200電磁血液流量計(jì)，日本光電公司產(chǎn)品，SC-3電動(dòng)呼吸機(jī)，上海醫(yī)療器械廠生產(chǎn)，722-2光柵分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠生產(chǎn)，DDB-300多通道電子蠕動(dòng)泵，浙江象山石浦海天電子儀器廠。

1.2 手術(shù)過程及模型制備

實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食12 h，自由飲水，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天靜脈注射3%戊巴比妥鈉(20 mg·kg-1)和肌注氯氨酮(10 mg·kg-1)混和麻醉，并靜注戊巴比妥鈉維持麻醉。動(dòng)物仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，氣管插管，連接SC-3型電動(dòng)呼吸機(jī)，行人工正壓呼吸；分離右頸總動(dòng)脈，插入充滿 0.5% 肝素的塑料管，連于TP-400T壓力換能器上，經(jīng)AP-641G血壓放大器，測量收縮壓(stolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)及平均動(dòng)脈壓(mean arterial blood pressure，MABP)；分離左股靜脈，插管作給藥、補(bǔ)液及取血用。

于第4肋間開胸，暴露心臟，剪開心包，做心包床；分離左冠狀動(dòng)脈前降支下1/3部位一段血管，約 1 cm，將彎曲成 90° 的4#皮下注射針頭刺入上述冠脈，進(jìn)入血管腔約4 mm，并保持與血管內(nèi)膜接觸，固定，經(jīng)連線接9 V干電池的正極，負(fù)極置于動(dòng)物皮下，以便形成環(huán)路，為了最大限度地減少漏電，除與冠脈接觸部位的電極外，電極其他部分及連線均進(jìn)行絕緣處理；左心室擬缺血區(qū)心外膜表面放置20個(gè)標(biāo)測點(diǎn)心外膜電極，經(jīng)AB-621G生物電放大器標(biāo)測心外膜心電圖；四肢插入針狀電極，經(jīng)AC-601G心電放大器，測量Ⅱ?qū)?lián)心電圖(ECGⅡ)。

上述諸指標(biāo)同步記錄于RM-6300多導(dǎo)生理記錄儀上。手術(shù)完畢待各項(xiàng)指標(biāo)穩(wěn)定后，記錄一次，作為血栓形成前的正常值。而后開始接通直流電，電流強(qiáng)度為150 μA，一般于通電后約40 min，心外膜電圖ST段開始抬高，再刺激5 min，若心外膜電圖ST段不降低，即切斷電源，認(rèn)為冠脈血栓已形成。

為了防止血栓形成或再通后的室顫，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中輸注0.02%鹽酸利多卡因生理鹽水溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方案

30只小型豬分成5組(溶劑對(duì)照組、陽性藥物對(duì)照組(r-SK,4 mg·kg-1)、受試藥物高劑量組(r-SAK,4 mg·kg-1)、受試藥物中劑量組(r-SAK,2 mg·kg-1)、受試藥物低劑量組(r-SAK,1 mg·kg-1))，每組6只，在冠脈血栓形成30 min后開始靜脈給藥，采用先推注，隨后用蠕動(dòng)泵恒速輸注的方式給予不同的藥物。溶劑對(duì)照組靜脈溶劑對(duì)照液，陽性藥對(duì)照組靜脈給予重組鏈激酶，受試物各組分別靜脈給予不同劑量的重組葡激酶。靜脈推注體積為5 ml，1 min內(nèi)注畢，輸注速度為0.5 ml·min-1，60 min內(nèi)輸畢。120 min后放血處死動(dòng)物。于給藥前及給藥后30、60、120 min取靜脈血，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取血栓形成部位的冠脈血管段，分別檢測優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間、血纖維蛋白原含量、纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物和傷口出血量，檢測冠脈血栓溶解率、心肌缺血程度及缺血范圍。

1.4 冠脈血栓溶解測定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取血栓形成部位的冠脈血管段，10%福爾馬林液固定后，石蠟包埋，以電極刺入點(diǎn)為起點(diǎn)，間隔 1 mm，橫向連續(xù)切成5片，HE染色，顯微鏡下采用落點(diǎn)求積法計(jì)算血栓占管腔百分?jǐn)?shù)。

1.5 心肌缺血程度及缺血范圍的測定

記錄冠脈血栓形成前，給藥前及給藥后15、30、45、60、90、120 min時(shí)20個(gè)標(biāo)測點(diǎn)的心外膜電圖。計(jì)算20個(gè)點(diǎn)的ST段抬高之和(ΣST)，作為心肌缺血程度；以ST段升高2 mV以上作為缺血標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算缺血點(diǎn)數(shù)(NST)，作為心肌缺血范圍。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取出心臟，用生理鹽水洗去血液。主動(dòng)脈及血栓形成處以下左前支冠脈插管，主動(dòng)脈用伊文斯藍(lán)(1 mg·ml-1)進(jìn)行逆行冠脈灌注，LDA 冠脈用磷酸鹽緩沖液同時(shí)進(jìn)行灌注，上述雙向灌注的壓力均為 80 mmHg，5 min后，停止灌注，將血栓形成部位以下的左室，垂直于前降支均勻切成 5 片，將染色心肌投射描記在透明膠片上，以確定心肌的危險(xiǎn)區(qū)；然后，常溫下1%TTC 染色15 min，投射描記在透明膠片上，以確定梗死區(qū)；計(jì)算梗死區(qū)占心肌百分?jǐn)?shù)及梗死區(qū)占危險(xiǎn)區(qū)百分?jǐn)?shù)。

1.6 優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間的測定

用3.8% 檸檬酸鈉按1∶9抗凝，3 000 r/min冷凍離心10 min，分離血漿。取0.5 ml血漿加入9 ml冰凍蒸餾水中，用1%醋酸調(diào) pH 值至4.5，3 000 r/min冷凍離心5 min，棄去上清液，沉淀用0.5 ml硼砂緩沖液(pH 8.0)溶解后，37℃溫育 2 min 后，再加入 1/40 mol·L-1CaCl20.5 ml，凝固后，置37℃水浴中觀察并記錄優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間。

1.7 纖維蛋白原含量測定

于給藥前及給藥后30、60、120 min(實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí))取 0.1 ml按1.6中描述的方法制備的血漿，加入4 ml的血漿纖維蛋白原測定試劑，混勻后置室溫15 min，按單一試劑比濁法，于370 nm處測定其光密度，以纖維蛋白原標(biāo)準(zhǔn)管制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血漿纖維蛋白原含量。

1.8 纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物測定

同時(shí)于上述各時(shí)間點(diǎn)取血1 ml，37℃下溫育2 h，4 000 r/min離心分離血清，取血清0.1 ml用生理鹽水等倍連續(xù)稀釋4～5管，然后各管中加入金黃色葡萄球菌液0.05 ml，振蕩器上振蕩(180～200 次·min-1)2 min，每管再加入0.5 ml生理鹽水，室溫靜置30 min 后，手術(shù)燈下觀察，找出產(chǎn)生猬集現(xiàn)象的最高稀釋管，根據(jù)纖維蛋白原標(biāo)準(zhǔn)管的滴度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物含量。

1.9 傷口出血量的測定

分別于給藥前及開始給藥后30、60、120 min，于腹前外側(cè)部沿肌肉方向切開腹外斜肌，長4 cm，用預(yù)先稱重的紗布吸取自傷口流出的血液，5 min后稱重，計(jì)算出血量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對(duì)電刺激引起的冠脈血栓的溶解作用

給藥后，溶劑對(duì)照組殘存血栓基本堵塞整個(gè)血管。與溶劑對(duì)照組相比，r-SK組殘存血栓平均減少34.5%；r-SAK高、中、低3個(gè)劑量組分別減少 71.9%、56.6%、34.0%(P<0.05)。與r-SK組相比，r-SAK高、中2個(gè)劑量組，最大血栓面積分別減少 34.3%、15.4%(P<0.05)。SAK高劑量組比中劑量組殘存血栓平均減少37.1%，SAK中劑量組又比低劑量組減少32.5%(P<0.05)。上述結(jié)果表明r-SAK對(duì)電刺激引起的冠脈血栓較r-SK具有更強(qiáng)的溶栓作用(表1)。

溶劑對(duì)照組6只動(dòng)物中，殘存血栓最大面積占血管腔面積的比值小于70%的動(dòng)物數(shù)為 0/6，r-SK 組為4/6，r-SAK高、中、低3個(gè)劑量組分別為6/6、5/6、3/6，結(jié)果未列表。

Tab. 1 Effects of recombinant staphylokinase on electrical stimulation induced coronary thrombosis in miniature n=6)

2.2 對(duì)心肌梗塞程度及范圍的影響

溶劑對(duì)照組6只動(dòng)物在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中心肌缺血程度(∑ST)及缺血范圍(NST)有逐步減輕的趨勢，但與給藥前比較無明顯差異。r-SK組在給藥后30～60 min間有3/6只動(dòng)物抬高的心外膜電圖ST段突然迅速增加，可能是由于血栓溶解后，心肌缺血/再灌注所致心肌再損傷引起的，而后∑ST及NST的降低較溶劑對(duì)照組更明顯，與給藥前比較有明顯差異。r-SAK高、中及低劑量組分別有5/6、4/6和2/6只動(dòng)物于給藥后20～60 min出現(xiàn)上述現(xiàn)象。之后∑ST及NST較給藥前明顯降低，表明r-SAK能減輕心肌缺血程度，縮小缺血范圍，結(jié)果未列表。

心臟TTC染色結(jié)果表明，溶劑對(duì)照組其梗死區(qū)占左室的11.4%。r-SK組及r-SAK高、中、低3個(gè)劑量組梗死范圍均明顯減輕(P<0.01～0.001)，分別較對(duì)照組降低66.7%、70.2%、59.0%、31.6%(P<0.05)。SAK高劑量組比中劑量組梗死范圍平均減少30.6%，SAK中劑量組又比低劑量組減少 37.2%(P<0.05)r-SAK與等劑量的r-SK作用相似(表2)。

Tab. 2 Effects of recombinant staphylokinase on the extent of myocardial infarction induced by electrical stimulation in miniature pigs n=6)

2.3 對(duì)小型豬生化參數(shù)的影響

2.3.1 對(duì)優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間(ELT)的影響 溶劑對(duì)照組給藥后 ELT波動(dòng)不大。r-SK 組給藥后 ELT 明顯縮短，給藥后30、60、120 min分別縮短26.1%(P<0.01)、29.3%(P<0.05)、38.8%(P<0.05)。r-SAK高、中、低3個(gè)劑量組給藥后ELT均明顯縮短，高、中、低3個(gè)劑量組給藥后 30 min分別縮短 66.7%(P<0.01)、51.0%(P<0.01)、27.8%(P< 0.05)，60 min分別縮短76.9%(P<0.01)、56.3%(P<0.01)、24.7%(P>0.05)，120 min分別縮短 62.0%(P<0.01)、52.2%(P<0.01)、21.1%(P> 0.05)。與等劑量的r-SK相比，r-SAK組 ELT 縮短更明顯(表3)。

Tab. 3 Effects of recombinant staphylokinase on the dissolution time of euglobulin in n=6)

2.3.2 對(duì)纖維蛋白原(Fbg)及纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(FDP)的影響 溶劑對(duì)照組整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中Fbg波動(dòng)不大。r-SK組給藥后4/6只動(dòng)物Fbg降解超過20%。r-SAK高、中、低3個(gè)劑量組給藥后6只動(dòng)物中分別有1/6、2/6、0/6只Fbg降解超過20%，其它動(dòng)物未見明顯下降，表明r-SAK較r-SK具有更高的纖維蛋白專一性(表4)。

溶劑對(duì)照組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，其 FDP 無明顯變化。與溶劑對(duì)照組相比，r-SK組及r-SAK 高、中、低3個(gè)劑量組給藥后 FDP 均明顯升高；而r-SK組比r-SAK高劑量(4 mg·kg-1)組 FDP 增加更明顯，可能因血漿纖維蛋白原降解而引起(表5)。

Tab. 4 Effects of recombinant staphylokinase on plasma fibrinogen content in miniature n=6)

Tab. 5 Effects of recombinant staphylokinase on degradation products of fibrin(proto)in miniature n=6)

2.4 對(duì)傷口失血量的影響

溶劑對(duì)照組整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中出血量無明顯改變。r-SK組6只動(dòng)物給藥后出血量均有不同程度增加，其中有4只動(dòng)物出血量增加超過給藥前1倍以上；而r-SAK高、中、低劑量組給藥后6只動(dòng)物中分別有1/6、2/6、1/6只傷口出血量增加超過給藥前1倍以上；表明r-SAK較r-SK引起的出血副反應(yīng)少(表6)。

Tab. 6 Effects of recombinant staphylokinase on the amount of wound bleeding in miniature n=6)

2.5 對(duì)小型豬血壓及心率的影響

靜脈給予上述劑量的r-SAk及重組鏈激酶對(duì)小型豬血壓及心率無明顯影響。結(jié)果未附表。

3 討論

目前公認(rèn)的血栓形成有三個(gè)條件: 即血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血流狀態(tài)的改變以及血液凝固性的增加。可以用注射角叉菜膠誘發(fā)血栓形成或者手術(shù)結(jié)扎等方式形成血栓[2-3]，正常循環(huán)血液中的血小板表面帶凈負(fù)電荷，而完整血管內(nèi)皮細(xì)胞層亦帶負(fù)電荷，因此血小板被內(nèi)皮層排斥，在血管內(nèi)壁沒有血小板附著。本試驗(yàn)應(yīng)用陽性電流作用于血管，在直流電作用下引起血管內(nèi)皮損傷，使血管內(nèi)皮層下膠原及其它致血栓原成分(如組織因子)暴露，引起血小板大量激活及粘附，釋放凝血酶等物質(zhì)，使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致紅細(xì)胞沉積，形成與臨床上急性心肌梗塞患者血栓組成相似的冠脈血栓。試驗(yàn)動(dòng)物于給藥后20～60 min出現(xiàn)心外膜電圖ST段在給藥后某一時(shí)間段進(jìn)一步升高，可能是由于栓塞的冠脈血管恢復(fù)再灌注后，大量氧自由基釋放，導(dǎo)致心肌出現(xiàn)短暫進(jìn)一步再損傷所致，這和臨床上AMI經(jīng)溶栓后出現(xiàn)的暫時(shí)心律失常和ECG改變一致，說明豬冠脈實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為可靠，一定程度上能反映溶栓藥的臨床療效。

本研究利用上述原理形成冠脈血栓模型，溶劑對(duì)照組6只動(dòng)物經(jīng)組織學(xué)觀察證明經(jīng)熱損傷的冠脈均充滿血栓，靜脈給予重組葡激酶后血栓明顯縮小，數(shù)據(jù)表明r-SAK對(duì)電刺激引起的冠脈血栓較r-SK具有更強(qiáng)的溶栓作用。r-SAK高、中及低劑量組分別有5/6、4/6和2/6只動(dòng)物心肌缺血程度(ST)及缺血范圍(NST)較給藥前明顯降低，表明r-SAK能減輕心肌缺血程度，縮小缺血范圍。優(yōu)球蛋白部分含有纖維蛋白原，血漿素原及活化素，優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間縮短表示活化素增高，纖溶活性增強(qiáng)，數(shù)據(jù)表明r-SAK的優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間比r-SK更短。r-SAK高、中、低3個(gè)劑量組給藥后6只動(dòng)物中分別有1/6、2/6、0/6只動(dòng)物的纖維蛋白原降解超過20%，其它動(dòng)物未見明顯下降，而r-SK有4/6只超過而r-SK組比r-SAK高劑量(4 mg·kg-1)組 纖維蛋白原降解產(chǎn)物增加更明顯，可能因血漿纖維蛋白原降解而引起，表明r-SAK比r-SK具有更高的纖維蛋白專一性，動(dòng)物給藥后出血量的比較也證明了這一點(diǎn)。

葡激酶(staphylokinase，SAK)是溶原性金黃色葡萄球菌分泌的一種蛋白，具有較強(qiáng)的纖溶酶原激活作用。與鏈激酶結(jié)合纖溶酶原不同，當(dāng)葡激酶被加至含有血纖維蛋白凝塊的人血漿中時(shí)，同血漿中血纖溶酶原反應(yīng)很弱，只同血塊表面痕量存在的血纖溶酶發(fā)生高親和力反應(yīng)，變成血纖溶酶·葡激酶復(fù)合物，有效地在血塊表面激活血纖溶酶原成血纖溶酶，因而不受α2-抗血纖溶酶的抑制。然而，血纖溶酶·葡激酶復(fù)合物或血纖溶酶，從血塊釋放出來或在血漿中產(chǎn)生時(shí)，則被α2-抗纖溶酶迅速抑制。因而，限制了纖溶酶原對(duì)血栓的激活過程，防止血漿中血纖溶酶過量產(chǎn)生以及α2-抗血纖溶酶的耗竭乃至纖維蛋白原的降解[4]。國外的臨床研究表明與溶栓藥物t-PA相比，葡激酶療效相當(dāng)，對(duì)纖維蛋白的選擇性高于t-PA，出血傾向更低[5-6]。另外SAK對(duì)溶解富含血小板的血栓同樣有效，這也是優(yōu)于t-PA和SK的方面。而且SAK的溶栓作用并不影響循環(huán)中纖維蛋白原和纖溶酶原及α2抗纖溶酶的水平。葡激酶、纖溶酶原、纖溶酶、α2-抗纖溶酶以及纖維蛋白之間的這些分子的相互作用，賦予葡激酶分子在血漿環(huán)境中一種獨(dú)特的纖維蛋白選擇性機(jī)制即纖維蛋白特異性。因此SAK是一個(gè)血纖維蛋白專一性的纖溶酶原激活劑，應(yīng)用于臨床減少了系統(tǒng)激活和出血副作用，是一個(gè)比較理想的纖溶酶原激活劑。文獻(xiàn)報(bào)道r-SAK與t-PA聯(lián)合使用溶栓效果優(yōu)于兩者單獨(dú)使用[7-8]，r-SAK與中藥益活凊胰湯聯(lián)用具有協(xié)同效應(yīng)[7]。通過基因工程手段改造[9-11]，降低r-SAK的免疫原性，或者改造其制劑[12]，可以進(jìn)一步提升其溶栓效率和安全性，未來重組葡激酶可能在急性心肌梗死，肺栓塞，深部靜脈血栓等疾病的臨床治療中發(fā)揮重要作用。