加味逍遙散對LPS誘導的抑郁模型大鼠海馬小膠質(zhì)細胞TLR4/NF-κB通路的影響*

郭 銳，秦衛(wèi)帥，張雙勇，張淑玲

(1.鄭州市中醫(yī)院腦病一科，河南 鄭州 450007；2.鄭州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450003)

抑郁癥是嚴重威脅人類身心健康的重大疾病，目前全球約有9億人口患有不同程度的抑郁癥，且發(fā)病率逐年升高，預測到2020年，將成為世界第二大疾病[1]。越來越多的證據(jù)表明，腦內(nèi)免疫失衡是導致抑郁癥發(fā)生的關鍵原因[2-3]。小膠質(zhì)細胞作為腦內(nèi)的巨噬細胞，扮演著神經(jīng)系統(tǒng)“清道夫”的角色，可通過固有和適應性免疫反應參與神經(jīng)免疫調(diào)控[4]。那么，在抑郁癥狀態(tài)下，小膠質(zhì)細胞是否呈現(xiàn)過度激活態(tài)，其涉及的相關分子機制如何，尚鮮有深入報道。加味逍遙散是在經(jīng)方逍遙散基礎上增加姜黃、香附、酸棗仁等藥物，能增強原方的疏肝健脾、寧心安神功效，臨床療效明顯[5]。本研究以海馬小膠質(zhì)細胞為靶區(qū)，從免疫調(diào)節(jié)相關的TLR4/NF-κB信號通路為切入點，探討加味逍遙散對LPS誘導的免疫損傷抑郁模型大鼠的保護作用及其機制，以期為該方在臨床上進一步推廣應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠，60只，體質(zhì)量為180～220 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司。實驗期間大鼠均飼養(yǎng)在室溫(24±2)℃、相對濕度(50±5)%、光/暗周期12 h/12 h的標準環(huán)境中，自由攝食飲水。

1.2 藥物

加味逍遙散由柴胡、白芍、當歸、川芎、白術、茯苓、姜黃、香附、酸棗仁、郁金、甘草組成，藥材均購自鄭州市中醫(yī)院。該方提取兩次，第一次加入10倍量水浸泡30 min后武火煎煮至沸騰，轉為文火慢煎 1.5 h～2 h，倒出煎液，加入8倍量水再煎煮一次，合并兩次水煎液，濃縮至生藥量為2 g/ml后保存?zhèn)溆?。鹽酸氟西汀分散片購于禮來蘇州制藥有限公司，批號為0934A。

1.3 試劑與主要儀器

LPS購自美國Sigma公司；ELISA試劑盒購自南京建成生物公司；RIPA裂解液購自美國Thermo公司；兔抗大鼠Iba-1單克隆抗體購自美國Sigma公司；兔抗大鼠TLR4、NF-κB多克隆抗體購自英國Abcam公司；山羊抗兔二抗購自武漢博士德公司；超微量核酸蛋白測定儀購自英國BioDrop公司；凝膠成像分析儀購自美國Bio-Rad公司；組織切片機購自美國Thermo公司，顯微鏡購自德國Zeiss公司。

1.4 動物分組、造模與給藥

大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，進行曠場實驗，剔除掉自主活動次數(shù)明顯偏離平均值的大鼠，并依照該指標將動物隨機分為5組，包括對照組、模型組、氟西汀組、加味逍遙散低、高劑量組，每組11只。除對照組外，其余組均參照文獻方法[6]，采用慢性LPS注射誘導抑郁大鼠模型，每天腹腔注射LPS 0.5 mg·kg-1，共14 d，對照組注射等量生理鹽水。于造模同時灌胃給藥，氟西汀組給藥劑量為10.8 mg·kg-1，加味逍遙散低、高劑量組分別給予臨床等效1、2倍劑量(3.64、7.28 g·kg-1)，正常組與模型組均給予等量蒸餾水，灌胃體積為10 ml·kg-1。末次給藥結束后1 h，對所有大鼠進行行為學測試，完成后立即取材。

1.5 行為學測試

1.5.1 曠場測試 將大鼠放入底部及四周均為黑色的敞箱中，底部均勻劃分為25個小格。大鼠于敞箱中自由活動1 min后，記錄其接下來4 min內(nèi)的水平活動次數(shù)(四爪均落在小格內(nèi))和垂直站立次數(shù)(兩前爪抬離底部)。

1.5.2 強迫游泳實驗 將大鼠放入高50 cm、直徑20 cm、水深35 cm的透明圓柱形筒中，待大鼠適應1 min后，記錄接下來4 min內(nèi)的不動時間(以兩前爪停止游動，身體漂浮為不動)。

1.6 免疫組化法檢測小膠質(zhì)細胞標志蛋白Iba-1的表達

取固定于4%多聚甲醛溶液中的腦組織，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后，以5 μm厚連續(xù)切片；分別用75%、95%、100%梯度乙醇脫水，浸蠟，水化，沖洗，滴加山羊血清封閉液，37℃孵育30 min，加Iba-1一抗孵育過夜；PBS洗3次，反應增強液孵10 min，二抗孵10 min；沖洗，DAB染色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，封片。將切片置于顯微鏡下進行拍攝，并采用Image-Pro Plus軟件分析積分光密度值(integrated optical density, IOD)。

1.7 ELISA試劑盒檢測海馬勻漿液TNF-α、IL-6的含量

取冷凍保存的海馬組織，稱重，加入3倍量的生理鹽水，冰上勻漿，4℃、12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，ELISA法檢測TNF-α、IL-6的含量，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.8 Western blot法檢測TLR4、NF-κB蛋白的表達

取冷凍保存的海馬組織，加入一定量RIPA裂解液，冰上勻漿，在4℃、12 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液制備組織蛋白提取液，BCA試劑盒法測定總蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠，蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳至溴酚藍跑出分離膠后，將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，根據(jù)目的蛋白分子量裁剪條帶，分別加入稀釋后的一抗，4℃孵育過夜。次日用TBST液洗滌條帶4次，每次10 min，加入二抗室溫下孵育4 h，TBST液洗4次，每次10 min，之后進行ECL顯影。應用Image J軟件分析條帶灰度值，根據(jù)目的蛋白和內(nèi)參蛋白對應灰度值的比值計算蛋白相對表達水平。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 加味逍遙散對大鼠行為學的影響

與對照組比較，模型組大鼠水平及垂直運動能力均顯著下降(P<0.01，表1)，強迫游泳不動時間顯著增加(P<0.01)，抑郁樣行為顯著；與模型組比較，施加氟西汀及高劑量加味逍遙散干預后均能提高抑郁大鼠的自主活動能力(P<0.01或P<0.05)，降低大鼠的不動時間(P<0.01)，改善抑郁樣行為；與氟西汀組比較，加味逍遙散低劑量組不動時間顯著增加(P<0.01)，但高劑量組各行為學均與氟西汀無明顯差異(P>0.05)。

Tab. 1 Effects of modified Xiaoyao San on behavior of rats n=10)

2.2 加味逍遙散對大鼠海馬小膠質(zhì)細胞標志蛋白Iba-1表達量的影響

與對照組比較，模型組大鼠海馬Iba-1表達顯著增加(P<0.01，圖1，表2)，小膠質(zhì)細胞呈激活態(tài)；與模型組比較，施加氟西汀或高劑量加味逍遙散干預后，Iba-1表達水平明顯降低(P<0.01)且基本恢復正常水平，小膠質(zhì)細胞逐漸恢復成靜息態(tài)；與氟西汀組比較，加味逍遙散高、低劑量組Iba-1表達均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

Fig. 1 Immunohistochemical detection of hippocampal Iba-1 expression in rats(×200)

Tab. 2 Effect of modified Xiaoyao San on the expression of Iba-1 in hippocampus of rats n=5)

2.3 加味逍遙散對大鼠海馬勻漿液中TNF-α、IL-6含量的影響

LPS注射建立抑郁模型成功后，與對照組比較，模型組大鼠海馬炎癥因子TNF-α、IL-6含量顯著升高(P<0.01，表3)；與模型組比較，施加氟西汀或高劑量加味逍遙散組后，海馬中TNF-α、IL-6含量顯著下降(P<0.01)，同時，低劑量的加味逍遙散也能降低海馬TNF-α的水平(P<0.05)；與氟西汀組比較，高劑量加味逍遙散組TNF-α、IL-6含量無明顯差異(P>0.05)，低劑量加味逍遙散組IL-6含量升高(P<0.05)。

Tab. 3 Effects of modified Xiaoyao San on TNF-α and IL-6 in hippocampal homogenate of rats(pg/ml, n=5)

2.4 加味逍遙散對大鼠海馬TLR4、NF-κB蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠海馬TLR4、NF-κB表達均顯著升高(P<0.01，圖2，表4)；施加氟西汀或高劑量加味逍遙散干預后，TLR4、NF-κB蛋白表達水平均得到明顯逆轉(P<0.01或P<0.05)，同時低劑量加味逍遙散也能下調(diào)TLR4表達；與氟西汀組比較，高、低劑量的加味逍遙散對TLR4、NF-κB表達的影響均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

Fig. 2 The protein expressions of hippocampal TLR4 and NF-κB in rats detected by Western blot

Tab. 4 Effects of modified Xiaoyao San on TLR4 and NF-κB expressions in hippocampus of rats n=4)

3 討論

抑郁癥動物模型主要包括物理應激和藥物誘導兩大類。近年來，免疫紊亂在抑郁癥發(fā)生過程中的作用日益受到重視，采用LPS腹腔注射的方法能建立抑郁癥神經(jīng)免疫損傷模型。本研究中，模型大鼠自主活動能力下降，強迫游泳不動時間增加，抑郁樣行為顯著；而在給予陽性藥氟西汀及中藥復方加味逍遙散后，動物的抑郁樣行為明顯緩解。

海馬是負責機體學習、記憶的關鍵腦區(qū)，與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展密切相關。海馬主要由神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞組成，其中，小膠質(zhì)細胞被認為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫監(jiān)督的關鍵細胞，具有巨噬細胞的特征，約占膠質(zhì)細胞總數(shù)的20%[7]。小膠質(zhì)細胞具有靜息和活化兩種狀態(tài)，在健康狀態(tài)下，MG呈靜息狀態(tài)；當受到病理因素的刺激時，其被激活，由分枝狀變?yōu)榘⒚装蜖?，并釋放大量的氧自由基、促炎性因子等神?jīng)毒性物質(zhì)，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應[8-9]。過度的炎癥反應會刺激并損傷神經(jīng)元，進而導致抑郁癥、阿爾茲海默癥、帕金森癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生[10]。因此，如何抑制小膠質(zhì)細胞的過度活化，從而減輕炎癥反應所引起的損傷顯得尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)，抑郁模型大鼠小膠質(zhì)細胞標志蛋白Iba-1表達顯著增加，炎癥因子TNF-α、IL-6含量顯著上升，而加味逍遙散能抑制小膠質(zhì)細胞的過度激活，減輕腦內(nèi)的炎癥反應。

TLR4/NF-κB信號通路是調(diào)節(jié)TNF-α和IL-6等炎癥因子表達的重要途徑[11-12]。TLR4屬于I型跨膜受體蛋白，是一種模式識別受體，識別包括LPS在內(nèi)的多種配體。當TLR4與相應配體結合后，能進一步激活NF-κB通路，從而促進各種炎性細胞因子基因表達的激活、炎性因子產(chǎn)生和釋放[13]。在腦內(nèi)，TLR-4和NF-κB主要在小膠質(zhì)細胞中表達，小膠質(zhì)細胞的活性受到TLR4/NF-κB通路的調(diào)控，以往研究發(fā)現(xiàn)，抑制TLR4的表達能夠降低小膠質(zhì)細胞的活化，并減少神經(jīng)元凋亡[14]。因而，本研究認為TLR4/NF-κB通路參與LPS抑郁大鼠小膠質(zhì)細胞激活的過程。實驗結果表明，模型組大鼠海馬TLR4、NF-κB表達均明顯升高，施加加味逍遙散治療后能逆轉該表達，說明該藥物是通過調(diào)控該通路而抑制小膠質(zhì)細胞的激活，并降低炎癥因子的表達水平，進而保護海馬組織。

抑郁癥屬于中醫(yī)郁證范疇，多由于肝氣郁結、脾失健運而致腦失神明，表現(xiàn)為胸脅脹滿、納呆、疲乏、燥渴等，病機屬本虛標實，肝脾虧虛為本，氣機阻滯、心神不寧為標，治宜健脾疏肝、寧心安神[15]。加味逍遙散是以《太平惠民和劑局方》中疏肝健脾經(jīng)典方劑逍遙散為基礎，根據(jù)臨床實踐，增加姜黃、香附、酸棗仁、郁金等藥物，組成加味逍遙散，以增強其疏肝解郁、寧心安神功效，臨床效果顯著[16]。綜上，加味逍遙散能明顯改善LPS誘導抑郁模型大鼠的抑郁樣行為，其作用機制可能與抑制海馬小膠質(zhì)細胞TLR4/NF-κB通路，進而下調(diào)炎癥因子的表達有關。本文結果為臨床治療抑郁癥提供實驗依據(jù)。