蜂蜜多酚提取物對大鼠急性酒精性肝損傷的保護作用

黃 穎，譚書明,*，陳 萍，陳小敏，宋長軍

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

酒精性肝損傷（alcoholic liver disease，ALD）是由于過量攝入酒精引起的，對全球肝病發(fā)病率和死亡率有重大影響，已成為世界關注的主要健康問題之一[1]。一次性過量飲酒容易引起急性ALD，進而發(fā)展為脂肪肝、肝纖維化以及肝硬化[2]。目前，我國預防和治療急性ALD大多采用藥物進行干預，但長期使用藥物會對身體產(chǎn)生較大的毒副作用，越來越受到人們的排斥。因此，尋找具有護肝功效的天然來源化合物已成為國內學者的研究熱點之一[3]。

蜂蜜，又名石蜜，是蜜蜂將采集得到的花蜜與自身分泌物結合后制成的天然物質[4]。研究表明，蜂蜜中含有180多種物質，包括糖、多酚、維生素、礦物質、氨基酸等[5]，具有解酒、抗氧化、抑菌以及抗癌等功效[6-8]。因此，蜂蜜被廣泛應用于食品和藥品領域。多酚作為蜂蜜中的主要活性成分之一[9]，已有文獻報道其不僅能清除自由基，還能抑制促炎基因的表達，具有很強的體外抗氧化和抗炎特性[10]。Pan等[11]證實天然物質的抗氧化和抗炎功效可改善酒精引起的肝臟損傷。然而，目前國內還沒有蜂蜜多酚提取物能干預酒精誘導肝損傷的報道。因此，本研究通過建立急性ALD大鼠模型，初步探討蜂蜜多酚提取物對ALD的保護作用，為進一步開發(fā)護肝功能性食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性Sprague-Dawley大鼠，體質量180～200 g，由長沙市天勤生物技術有限公司提供。生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0014。將所有大鼠圈養(yǎng)在12 h光暗循環(huán)中，溫度保持在（22±2）℃，室內相對濕度為（55±5）%，飼料充足，飲水不限。

冬蜂蜜 貴州涼都蜂業(yè)有限公司提供；體積分數(shù)56%二鍋頭 北京紅星股份有限公司；牡蠣粉 深圳市海王健康科技發(fā)展有限公司；谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒、蘇木精-伊紅染色液南京建成生物工程研究所；Amberlite XAD-2樹脂 美國西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；TRIzol試劑盒 武漢賽維爾生物科技有限公司；cDNA合成試劑盒 美國Thermo公司。

1.2 儀器與設備

SpectraMax190連續(xù)波長多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司；H1-16KR高速冷凍離心機湖南可成儀器設備有限公司；DY89-II電動玻璃勻漿機寧波新芝生物科技股份有限公司；YD-202組織切片機浙江金華益迪醫(yī)療設備廠；D M 3 0 0 0 熒光顯微鏡徠卡儀器（德國）有限公司；CTFD-12S真空冷凍干燥機青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司；Stepone plus型熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂蜜多酚提取物的制備

參考梁馨文等[10]的方法并略有修改。稱取一定量的蜂蜜，以1∶9（m/V）的比例加入醋酸溶液，攪拌溶解后超聲提取40 min，離心過濾，收集濾液待用。將純化后的Amberlite XAD-2大孔樹脂填充到玻璃柱中，以1 mL/min的流速加入濾液，并用蒸餾水和醋酸溶液洗滌，以保留濾液中的多酚物質并除去蜂蜜中的糖和其他極性化合物，再用體積分數(shù)70%的乙醇溶液洗脫多酚并收集洗脫液，經(jīng)旋轉蒸發(fā)去除乙醇后，于-50 ℃真空冷凍干燥，得到蜂蜜多酚提取物（honey polyphenol extract，HPE）。采用Folin-Ciocalteu法[12]測得HPE中多酚質量分數(shù)為71.45%。

1.3.2 動物分組與處理

適應性喂養(yǎng)1 周后，將50 只大鼠隨機分為空白對照組、模型組、藥物對照組、HPE低劑量組和HPE高劑量組，每組10 只。低、高劑量組分別按100、200 mg/（kg mb·d）的劑量灌胃，藥物對照組每天灌胃100 mg/（kg mb·d）的牡蠣粉，空白對照組和模型組給予同體積生理鹽水灌胃，連續(xù)30 d。于末次給藥30 min后，除空白對照組給予生理鹽水外，其他4 組均給予15 mL/kg mb體積分數(shù)56%白酒。12 h后，各組大鼠摘眼球取血，4 ℃、3 000 r/min離心15 min后分離血清，待測。脫頸處死大鼠后，迅速解剖取出肝臟，剪下肝左葉用于組織病理學觀察，其余肝組織加入9 倍體積的生理鹽水并研磨成漿，離心后取上清液待測。

1.3.3 生化指標測定

參照試劑盒說明書，分別檢測肝損傷指標（ALT、AST活力）、抗氧化指標（SOD、GSH-Px、CAT、GSH、MDA水平）、炎癥指標（TNF-α質量濃度）。

1.3.4 肝臟病理學檢查

將肝臟左葉樣品保存在體積分數(shù)10%福爾馬林溶液中固定，經(jīng)過乙醇脫水和石蠟包埋后，每片肝組織制成5 μm的超薄切片，用蘇木精和伊紅染色樣品。最后，通過光學顯微鏡觀察肝臟中央的圖像。

1.3.5 實時定量聚合酶鏈式反應

采用TRIzol試劑提取各組大鼠肝組織的RNA，并檢測其濃度。按照cDNA試劑盒說明書操作合成cDNA后，PCR擴增基因，具體反應條件如下進行：94 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸15 s，40 個循環(huán)。使用ΔΔCt方法計算mRNA相對表達量。檢測的目的基因及引物序列見表1。

表1 目的基因的引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR amplification of target genes

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學顯著性檢驗，多組間比較用單因素方差分析法，兩兩比較采用最小顯著性差異法檢驗，結果以平均值±標準差表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 HPE對急性肝損傷大鼠血清ALT和AST活力的影響

表2 HPE對大鼠血清ALT和AST活力的影響（n＝ 10）Table 2 Effect of HPE on ALT and AST activities in serum of rats (n= 10)

由表2可知，模型組大鼠血清中ALT和AST活力均顯著高于空白對照組（P＜0.05），表明一次過量飲酒會導致肝功能出現(xiàn)異常。而相比于模型組，HPE各劑量組和藥物對照組大鼠血清ALT及AST的活力均顯著下降（P＜0.05），其中，HPE高劑量組大鼠血清ALT和AST活力下降到藥物對照組水平，表明給予蜂蜜多酚可以有效減輕酒精對肝臟造成的損害。

2.2 HPE對急性肝損傷大鼠肝臟SOD、GSH-Px、CAT活力和GSH、MDA水平的影響

表3 HPE對大鼠肝臟SOD、GSH-Px、CAT活力和GSH、MDA含量的影響（n＝10）Table 3 Effect of HPE on SOD, GSH-Px and CAT activities, and GSH and MDA levels in liver tissues of rats (n= 10)

由表3可知，與空白對照組相比，模型組大鼠肝臟SOD、GSH-Px、CAT活力和GSH含量均顯著降低（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05），表明酒精暴露引起大鼠肝臟抗氧化能力下降，脂質水平增加，誘導氧化應激產(chǎn)生。與模型組相比，HPE低、高劑量組SOD和GSH-Px活力顯著升高（P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）；此外，HPE各劑量組還增加了CAT活力和GSH含量，盡管僅在高劑量組中顯示出統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。結果表明HPE能提高肝臟的抗氧化能力，降低脂質過氧化水平，有效預防氧化應激的發(fā)生。

2.3 HPE對急性肝損傷大鼠肝臟TNF-α水平的影響

圖1 HPE對大鼠肝臟TNF-α質量濃度的影響Fig. 1 Effect of HPE on TNF-α level in liver of rats

如圖1所示，與空白對照組相比，模型組大鼠肝臟TNF-α水平顯著上升（P＜0.05），表明急性酒精攝入會引起肝臟發(fā)生嚴重的炎癥反應。與模型組相比，HPE低、高劑量組以及藥物對照組TNF-α水平均顯著降低（P＜0.05），且HPE高劑量組TNF-α水平低于藥物對照組，表明HPE能改善酒精引起的肝臟炎癥。

2.4 HPE對急性肝損傷大鼠ERK、JNK和p38 mRNA相對表達量的影響

圖2 HPE對大鼠ERK、JNK和p38 mRNA相對表達量的影響Fig. 2 Effect of HPE on mRNA expression of ERK, JNK and p38 in rats

如圖2 所示，與空白對照組相比，模型組大鼠肝臟ERK、JNK、p38 mRNA相對表達量均顯著上調（P＜0.05），表明酒精激活了MAPK信號通路。與模型組相比，低劑量HPE能顯著下調JNK mRNA相對表達量（P＜0.05），但對ERK、p38 mRNA表達無顯著影響（P＞0.05）；高劑量HPE處理后能顯著下調ERK、JNK、p38 mRNA相對表達量（P＜0.05），表明HPE能抑制MAPK通路的激活，尤其以高劑量HPE效果最為顯著。

2.5 HPE對急性肝損傷大鼠肝臟的組織病理學影響

由圖3可知，空白對照組肝細胞排列整齊，胞漿內無脂質液泡分布，肝組織無異常改變；而模型組中觀察到肝細胞有明顯的結構紊亂，并且胞漿內有大量的脂質液泡出現(xiàn)，表明急性酒精暴露對肝組織造成明顯的損傷；在藥物對照組中，觀察到肝細胞較完整，胞漿內的脂質液泡明顯減少；HPE低劑量組肝細胞結構基本完整，胞漿內有部分脂質液泡出現(xiàn)，但明顯少于模型組；高劑量組肝細胞結構排列整齊，肝細胞內僅有極少的脂質液泡，肝損傷明顯減輕。

圖3 大鼠肝臟組織病理學變化（200×）Fig. 3 Histopathological changes of rat liver tissues (200 ×)

3 討 論

肝臟不僅是乙醇代謝的主要器官，也是乙醇毒性的目標，短時間內過量飲酒通常會導致急性ALD[13]。ALD的發(fā)病機制復雜，包括氧化應激、脂質代謝紊亂、炎癥等因素[14]，其中，氧化應激和炎癥反應在ALD中的作用日益受到重視[15]。大量研究表明，乙醇代謝產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）及炎癥細胞因子能夠引起肝細胞的變性和壞死，進而出現(xiàn)肝功能損害的臨床表現(xiàn)[16]。Qu Linlin等[17]研究發(fā)現(xiàn)，具有抗氧化和抗炎作用的生物活性物質能夠降低ROS和炎癥細胞因子的水平，從而有效預防酒精所致肝損傷。因此，本研究以HPE為干預物，探討其對急性ALD的保護作用及其可能機制。

本實驗采用體積分數(shù)56%白酒一次性灌胃建立大鼠急性ALD模型，通過測定血清生化指標和觀察肝組織病理學變化研究HPE對肝損傷的保護作用。ALT和AST是存在于肝細胞內的酶，當肝臟受到酒精損害時，肝細胞被破壞，ALT和AST就會分散到血液中[18]。因此，血清ALT和AST的活性常作為判斷肝損傷的指標[19]。肝臟組織病理學觀察是評價肝臟損傷程度的金標準，在各類動物肝損傷模型中廣泛應用[20]。實驗結果顯示，與空白對照組相比，模型組大鼠血清ALT和AST活力顯著升高，肝細胞結構損傷，胞漿脂質過度積累，表明急性酒精攝入引起大鼠肝細胞發(fā)生脂肪變性，肝細胞膜通透性增加，提示ALD模型建立成功；相比于模型組，補充不同劑量的HPE能顯著降低大鼠ALT和AST活力，有效改善肝組織病變情況，表明HPE對急性ALD具有一定的保護作用。

研究表明氧化應激是導致ALD的主要機制之一[21]。酒精在肝臟中代謝會產(chǎn)生ROS并消耗抗氧化劑，破壞機體氧化-抗氧化平衡，從而產(chǎn)生氧化應激，促進ALD的發(fā)生[22]。GSH作為體內重要的抗氧化劑，可以清除大量自由基，對肝臟抗氧化系統(tǒng)具有重要意義[23]。除GSH外，抗氧化物酶如SOD、GSH-Px和CAT在肝臟抗氧化系統(tǒng)中也起著重要作用。SOD通過催化超氧陰離子轉化為氧和過氧化氫來清除ROS[24]。GSH-Px可以在GSH存在下減少脂肪酸氫過氧化物和過氧化氫[25]。CAT可催化過氧化氫分解為水和氧[26]。這些抗氧化劑均能保護肝臟免受氧化應激的損害，但很容易被脂質過氧化物清除[27]。MDA是脂質過氧化的最終產(chǎn)物，肝臟中MDA水平升高可干擾抗氧化防御并引起肝細胞損傷，使血液中ALT和AST活力升高[28]。實驗結果表明，酒精攝入會造成肝臟抗氧化劑水平降低，脂質過氧化物含量升高，引起肝細胞發(fā)生氧化損傷，進一步提示本實驗建模成功，這與Mir[29]和Kim[30]等的實驗結論一致。給藥HPE后，肝臟中SOD、GSH-Px、CAT和GSH水平較模型組均升高，MDA含量顯著降低，表明蜂蜜多酚具有抗氧化活性，可通過抑制氧化應激改善酒精對肝臟造成的損傷。

除氧化應激外，炎癥反應也是引起ALD的重要原因[31]。酒精攝入會損傷腸道黏膜，導致腸道內大量有毒物質進入肝臟后激活MAPK信號通路，誘導細胞活化并釋放炎癥因子，引起肝臟炎癥[32]。TNF-α是機體內主要的炎癥因子，它的過量產(chǎn)生能夠刺激肝臟發(fā)生炎癥反應，進而導致ALD[33]。有研究顯示，巨噬細胞是產(chǎn)生TNF-α最主要的細胞，而MAPK通路影響著巨噬細胞的激活[34]。MAPK信號通路是近年來新發(fā)現(xiàn)的介導胞內信號傳導和防治ALD的重要通路，主要調節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡、壞死等多種生理病理過程[35]。MAPK家族主要包括細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK），c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38激酶（p38 kinase，p38），它們均能調節(jié)巨噬細胞活化并產(chǎn)生TNF-α，促進肝臟炎癥的發(fā)生[17]。Wang Xiaodong等[36]研究發(fā)現(xiàn)，在酒精干預期間，抑制MAPK途徑可以降低TNF-α活性，有效保護ALD。本研究結果顯示，酒精處理顯著上調ERK、JNK和p38 mRNA的表達量，并增加TNF-α水平，促使肝臟發(fā)生炎癥反應；而給予不同劑量的HPE可不同程度地下調ERK、p38和JNK mRNA的表達，并明顯減少肝臟TNF-α的含量，說明HPE可通過抑制MAPK通路而降低TNF-α的水平，從而緩解肝臟炎癥反應。這些發(fā)現(xiàn)表明蜂蜜多酚具有很強的抗炎活性，可通過抑制肝臟發(fā)炎從而降低酒精對肝造成的損傷。

綜上所述，一次過量攝入酒精會導致大鼠肝臟受損，而補充HPE能明顯降低大鼠血清ALT和AST活力，改善肝組織病變情況，通過提高肝臟中SOD、GSH-Px、CAT活力和GSH水平并降低MDA含量緩解酒精所致氧化應激損傷，并通過抑制MAPK信號通路的激活降低TNF-α水平調節(jié)炎癥反應，最終改善酒精誘導的急性ALD。因此，HPE可以作為功能保健食品在急性ALD的治療中具有重要的意義。