從酸棗仁中分離酸棗仁皂苷B并測(cè)定其含量*

王婷宇

(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300052)

酸棗仁為鼠李科(Rhamnaceae)植物酸棗[ZizphusjujubaMill var spinosus(Bunge) Hu ex H F Chou]的干燥成熟種子[1]。其味甘、酸，歸肝、膽、心經(jīng)，主要用于治療虛煩不眠，驚悸多夢(mèng)，體虛多汗，津傷口濕等癥?，F(xiàn)代研究表明：酸棗仁具有鎮(zhèn)靜催眠、鎮(zhèn)痛、抗驚厥、降血脂、抗血小板聚集、增強(qiáng)免疫功能、降壓、抗缺氧、抗心肌缺血、抗心律失常、抗衰老和抗輻射作用[2]。酸棗仁總皂苷(主要為酸棗仁皂苷A和B)為其主要化學(xué)成分之一，具有顯著的鎮(zhèn)靜催眠活性[3]。為了進(jìn)一步研究其應(yīng)用價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)用多種色譜分離技術(shù)，對(duì)酸棗仁總皂苷中的酸棗仁皂苷B進(jìn)行了分離，并通過波譜學(xué)手段來確定其結(jié)構(gòu)，并測(cè)定其含量。

1 材料

1.1儀器 X-4型熔點(diǎn)測(cè)定儀；Brucher AV 400型核磁共振波譜儀；ESI-MS用QUATTROTM API型儀器測(cè)定；FREEZONE 4.5型Labconc凍干機(jī)；Water 515型液相色譜儀；Alltech 2000型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。

1.2試藥 柱層析硅膠(200-300目，00300，青島海洋化工廠)；硅膠(80-100目，040815，青島海洋化工廠)；硅膠G預(yù)制板(040725，青島海洋化工廠)；反相硅膠板(040913，Merck公司)；反相硅膠材料(50μm, C18，5409，三菱重工)；大孔樹脂(D-101,040823，天津市南開化工廠);實(shí)驗(yàn)用水為自制重蒸水;甲醇(色譜純)為天津康科德科技有限公司產(chǎn)；其他試劑為天津康科德科技有限公司產(chǎn)分析純；硅膠薄層板顯色劑為：濃硫酸-香草醛(120 ℃加熱)。酸棗仁11 kg，(亳州飲片廠)，對(duì)照品酸棗仁皂苷B(成都思科華生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1總皂苷的提取 稱取酸棗仁藥材11 kg,粉碎后加8 L 70%乙醇熱提取3次，回流提取液，濃縮至無醇味，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，減壓回收正丁醇部分至干，得干品252 g。取2 kg大孔樹脂，以純水濕法裝柱。用水500 ml混溶回收所得干品(252 g)，直接濕法上柱。常壓下用50%乙醇洗脫3BV(一個(gè)BV約為4 L)，得總黃酮部分。常壓下再用80%乙醇洗脫3BV，回收試劑得總皂苷部分10.14 g。

2.2酸棗仁皂苷B的分離和純化 總皂苷部分反復(fù)經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿-甲醇-水進(jìn)行梯度洗脫。洗脫液以酸棗仁皂苷B為對(duì)照品作TLC(氯仿-甲醇-水=7∶3∶0.5，取下層，硫酸-香草醛顯色)檢查，合并斑點(diǎn)與酸棗仁皂苷B對(duì)照品Rf值一致的流分，得到粗品800 mg。 以反相硅膠(50 μm,C18)進(jìn)一步純化所得粗品，以甲醇-水進(jìn)行梯度洗脫。洗脫液以酸棗仁皂苷B為對(duì)照品作RP-TLC(70%甲醇展開，254 nm下觀察暗斑)檢查流分，合并斑點(diǎn)與酸棗仁皂苷B對(duì)照品Rf值一致的流分。50 ℃下，減壓回收溶劑，水液直接凍干，得化合物Ⅰ純品500 mg。酸棗仁提取、分離和純化流程見圖1。

圖1 酸棗仁提取、分離和純化流程

2.3結(jié)構(gòu)鑒定 化合物Ⅰ，白色粉末，mp 228～232 ℃,ESI-MS m/z1067[M++Na]。13CNMR數(shù)據(jù)見表1。

由表1可得：化合物Ⅰ的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]中酸棗仁皂苷B 的數(shù)據(jù)一致。故所得化合物Ⅰ為酸棗仁皂苷B。

化合物Ⅰ的1HNMR(C5D5N)數(shù)據(jù)為：0.63,1.08,1.08,1.14,1.38,1.70(3H each,all s,19,18,29,28,21,26-H3),1.56(3H,dd-like,3-H),1.62(3H,d,J=6.0Hz,Rha-6’’-H3),2.81(1H,m,13-H),3.15(1H,dd-like,3-H),4.87(1H,d-like,Ara-1’-H),5.11(1H,d,J=7.6Hz,Glc-1’’’-H),5.36(1H,d,J=7.2Hz,Xyl-1’’’’-H),5.96(1H,brs,Rha-1’’-H)?；衔铫竦?HNMR 譜數(shù)據(jù)更進(jìn)一步證實(shí)了化合物Ⅰ為酸棗仁皂苷B。結(jié)構(gòu)見圖2。

2.5ELSD法測(cè)定所得酸棗仁皂苷B的純度

2.5.1色譜條件 色譜柱：Alltech C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水-甲酸(70∶30∶0.1)；流速：1.0 ml/min；ELSD氣化室溫度：105 ℃；氮?dú)饬髁浚?.5 L/min；柱溫：40 ℃[4]。

2.5.2溶液的制備

2.5.2.1對(duì)照品溶液的制備 稱取對(duì)照品酸棗仁皂苷B 10.002 mg，甲醇溶解，定容至10 ml量瓶，搖勻，即得濃度為1.002 mg/ml對(duì)照品。臨用前取部分溶液經(jīng)濾膜(0.45 μm)過濾后進(jìn)樣10 μl。色譜圖見圖3。

2.5.2.2供試品溶液的制備 稱取自制酸棗仁皂苷B10.013 mg，甲醇溶解，并定容至10 ml量瓶，搖勻，即得濃度為1.013 mg/ml樣品溶液。臨用前取部分溶液經(jīng)濾膜(0.45 μm)過濾后進(jìn)樣10 μl。色譜圖見圖3。

表1 化合物Ⅰ的碳譜數(shù)據(jù)(吡啶)

2.5.3純度測(cè)定 通過質(zhì)譜、碳譜和氫譜數(shù)據(jù)的綜合分析，并與相關(guān)文獻(xiàn)[4]比較，得出化合物Ⅰ為酸棗仁皂苷B，且其純度大于98.2%，達(dá)到了純化的目的。

圖2 化合物I的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.酸棗仁皂苷B

3 討論

3.1實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，酸棗仁總黃酮與總皂苷部分直接用硅膠柱分離，其分離效果不理想，而用D-101樹脂可將二者很好的分離開?？傸S酮與總皂苷部分可分別由50%和80%乙醇洗脫下來，故實(shí)驗(yàn)中采用此法除去總黃酮而得到總皂苷部分。

3.2反相硅膠對(duì)皂苷分離一般較有優(yōu)勢(shì)，故皂苷B的精制過程中使用了反相材料。從本實(shí)驗(yàn)反相硅膠柱的分離情況看，基本達(dá)到了進(jìn)一步分離酸棗仁皂苷B的目的。

3.3實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的13CNMR數(shù)據(jù)均略高于文獻(xiàn)[4]數(shù)據(jù)，可能是由于做13CNMR測(cè)定時(shí)，調(diào)整的內(nèi)標(biāo)有移動(dòng)。

3.4酸棗仁中所含有的酸棗仁皂苷B為三萜皂苷類成分，紫外吸收差，不宜用UV檢測(cè)器。而ELSD檢測(cè)器為質(zhì)量型通用檢測(cè)器，可檢測(cè)任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的化合物，且化合物的響應(yīng)值接近，因而峰面積比例亦近乎各組分的質(zhì)量之比。同時(shí)靈敏度及穩(wěn)定性亦能符合含量測(cè)定的要求，正逐步成為分析無紫外吸收類成分的有力工具[6]。

1 中國(guó)藥典.一部.2000:300-301

2 梅全喜，畢煥新.現(xiàn)代中藥藥理手冊(cè).北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，1998：478

3 Watanabd I,Satio H,Takgi K.Pharmacological studies of zizyphus seeds.Japan J Pharmacol,1973,23(4):563

4 王鋒,劉雪松,陳勇,等.酸棗仁皂苷大孔樹脂純化工藝及HPLC-ELSD測(cè)定方法研究.中藥材，2010,33(8):1342

5 曾路，張如意，王序.藥學(xué)學(xué)報(bào).酸棗仁化學(xué)成分研究Ⅱ.1987，22(2)：114

6 田南卉，王頡，厲進(jìn)忠.高效液相色譜法蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定銀杏葉提取物中內(nèi)酯的含量.藥物分析雜志，1997，17(4)：282