小鼠胚胎腭突上皮細(xì)胞初級纖毛生長規(guī)律的研究

陳玨蓉,王 新,陳 尚,宋慶高,何 葦

0 引 言

非綜合征性唇腭裂是新生兒頜面部常見的出生缺陷，影響患兒容貌語音等諸多方面，我國新生兒患此病發(fā)生率達(dá)1.67‰左右[1]。腭的正常發(fā)育涉及多種信號網(wǎng)絡(luò)因子[2]，研究證實(shí)與腭發(fā)育相關(guān)的Shh信號在其他組織細(xì)胞中依賴初級纖毛發(fā)揮作用[3]，其他關(guān)鍵信號因子，如Wnt信號傳導(dǎo)也與初級纖毛相關(guān)[4]。已有研究證明初級纖毛存在于小鼠的胚胎腭突間充質(zhì)細(xì)胞上[5]，然而初級纖毛在小鼠胚胎腭突上皮細(xì)胞如何分布尚不清楚。本文旨在觀察初級纖毛在小鼠胚胎腭突上皮細(xì)胞的分布變化情況，為研究胚胎腭突上皮細(xì)胞中依賴初級纖毛傳遞的相關(guān)信號提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與材料SPF級C57BL/6J小鼠，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)(原第三軍醫(yī)大學(xué))實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SLXR (渝) 20070005。適應(yīng)性飼養(yǎng)1～2周，每日給予光照和黑暗時間各為12 h，控制相對濕度30%～60%，控制溫度18～25 ℃，動物飼料、飲用水和墊料均已消毒；實(shí)驗(yàn)作用掃描電子顯微鏡，為日本HITACHI品牌，S-3400型；透射電子顯微鏡，為日本HITACHI品牌，H-7650型；激光共聚焦顯微鏡，為德國Leica品牌，TCSSP2型；抗小鼠αα-tubulin單克隆抗體(32-2700，Thermo 美國)，抗小鼠γ-tubulin單克隆抗體(PA-5-34815，Thermo 美國)，Alexa 555山羊抗鼠IgG(H+L，A-21424，Thermo 美國)，Alexa 488 山羊抗兔IgG(H+L，A-11034，Thermo 美國)，抗熒光淬滅封片液(含DAPI，S36964，Thermo 美國)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣本采集以雄雌數(shù)為1∶2比例合籠實(shí)驗(yàn)小鼠，于第2天上午8:00檢查雌鼠的陰道內(nèi)有無精栓，稱重標(biāo)記有精栓的雌鼠，標(biāo)記：妊娠0天(embryo day 0,ED0)，并單獨(dú)飼養(yǎng)；于ED10再次稱重該鼠，重量增加≥2 g且腹部明顯隆起的小鼠確定為已孕繼續(xù)飼養(yǎng)，然后收集ED12.5、ED13.5、ED14.5和ED15.5的孕期小鼠為實(shí)驗(yàn)對象。

1.2.2掃描電鏡標(biāo)本制作各取2只ED12.5、ED13.5、ED14.5、ED15.5時的實(shí)驗(yàn)小鼠，均行安死術(shù)，取胚胎頭部腭以上部位組織先后置于預(yù)冷3%戊二醛和新鮮配置的1%鋨酸中各固定2 h后，然后將組織進(jìn)行梯度乙醇以及叔丁醇脫水，對樣品先行冷凍處理，再抽真空，之后行干燥處理，同時粘臺，最后樣本行導(dǎo)電處理后掃描電鏡觀察拍照。

1.2.3透射電鏡標(biāo)本制作與觀察各取2只ED12.5、ED13.5、ED14.5、ED15.5時的實(shí)驗(yàn)小鼠，均行安死術(shù)，取胚胎頭部腭以上部位，組織先后置于預(yù)冷3%戊二醛和新鮮配置的1%鋨酸中分別固定2h和1.5h。用梯度乙醇行脫水處理，用SPURR樹脂完成浸透包埋處理，修塊后以平行皮膚方向切取50 nm厚超薄切片，鋪片并干燥，甲苯胺藍(lán)染色，觀察定位后加膜后的200目銅網(wǎng)撈片，然后用二氧化鈾-醋酸鉛-檸檬酸鹽染色超薄切片30 min，最后透射電鏡觀察拍照。

1.2.4激光共聚焦顯微鏡標(biāo)本制作各取2只ED12.5、ED13.5、ED14.5、ED15.5時的實(shí)驗(yàn)小鼠，均行安死術(shù)，取胚胎頭部并快速將該組織放入4%多聚甲醛固定液中固定>2 h后，然后脫水石蠟包埋。待連續(xù)切片結(jié)束，實(shí)施免疫熒光(IF)染色操作：一抗孵育(抗小鼠αα-tubulin與抗小鼠γ-tubulin單抗)(1∶200)；二抗孵育(羊抗鼠IgG，紅色熒光；山羊抗兔IgG(Alexa 488)，熒光顯綠色)(1∶500)；DAPI顯色：用DAPI染液行3 min處理，待封片完成，借助激光共聚焦顯微鏡，完成觀察與拍照。

2 結(jié) 果

2.1 掃描電鏡觀察結(jié)果掃描電鏡下各時間點(diǎn)小鼠胚胎腭突組織表面均較完整，無明顯缺損，細(xì)胞間連接致密清晰，腭突上皮細(xì)胞形似半球，大小基本一致。ED12.5和ED13.5小鼠的前腭突和兩側(cè)側(cè)腭突輪廓清晰未融合，ED14.5小鼠側(cè)腭突在腭中線處由前向后部分融合，ED15.5兩端腭突大致融合。在ED12.5、ED 13.5與ED 14.5，能夠觀察到，上皮細(xì)胞表面數(shù)量較多、長度<1 μm的偽足樣結(jié)構(gòu)，ED12.5、13.5、14.5小鼠腭突部分上皮細(xì)胞表面可見長約2～8 μm的指狀突起，即為初級纖毛，纖毛膜細(xì)胞膜連續(xù)，ED12.5纖毛數(shù)量較ED13.5偏少， 觀察發(fā)現(xiàn)ED15.5腭突表面無纖毛。見圖1。

a、b、c、d：分別為ED12.5、ED13.5、ED14.5、ED15.5

2.2透射電鏡觀察結(jié)果通過透射電鏡，能夠觀察到不同時間段小鼠腭突上皮細(xì)胞均具備連續(xù)完整的胞膜，以及均勻的細(xì)胞質(zhì)，且于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)能夠清晰觀察到諸如線粒體等未發(fā)生腫脹的其他細(xì)胞器骨架，細(xì)胞核無膨脹，核膜完整，核仁呈圓形且質(zhì)地均勻。ED12.5初級纖毛基部清晰可見，位于小鼠腭突上皮細(xì)胞內(nèi)部，ED13.5小鼠腭突上皮細(xì)胞可見初級纖毛的基部、纖毛膜和微管，纖毛長度約為1～3 μm，直徑在0.25～0.5 μm上下，纖毛基部深染，纖毛膜連接著細(xì)胞膜，纖毛最下端微管向其最上端延伸，ED14.5小鼠腭突上皮細(xì)胞上清晰可見纖毛結(jié)構(gòu)，達(dá)3～4 μm左右的長度，呈0.25～0.5 μm左右直徑，ED15.5腭突上皮細(xì)胞表面則無初級纖毛。見圖2。

2.3激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果激光共聚焦顯微鏡下可見紅色熒光為細(xì)胞α微管蛋白，綠色熒光為細(xì)胞γ微管蛋白。在ED12.5、ED 13.5與ED 14.5這3個時間段上，大部分初級纖毛處在實(shí)驗(yàn)動物腭突腭中嵴上皮細(xì)胞，在熒光反應(yīng)上，纖毛最下端與體部各顯示為綠色、紅色 ，見圖3，在ED15.5時間段，實(shí)驗(yàn)動物腭突上皮細(xì)胞表面沒有發(fā)現(xiàn)顯示上述熒光反應(yīng)的初級纖毛的存在。

a、b、c、d：分別為ED12.5、ED13.5、ED14.5、ED15.5

a、b、c、d：分別為ED12.5、ED13.5、ED14.5、ED15.5

3 討 論

哺乳動物體內(nèi)多數(shù)細(xì)胞都有纖毛分布這一發(fā)現(xiàn)可追溯至100多年前，然而長期以來，均把纖毛視作一類退化結(jié)構(gòu)，近些年研究發(fā)現(xiàn)初級纖毛是細(xì)胞功能的主要調(diào)節(jié)中樞，初級纖毛對于傳遞細(xì)胞外的機(jī)械和化學(xué)信號到細(xì)胞內(nèi)至關(guān)重要，而且能夠調(diào)控細(xì)胞分化和增殖，以及細(xì)胞極性[6]。

初級纖毛屬于一類細(xì)胞器，其構(gòu)成的基本單位為微管，它從細(xì)胞表面突出，起蜂窩天線的作用[7]。初級纖毛沒有中央微管，即9+0結(jié)構(gòu)，屬于非運(yùn)動性纖毛，眾多研究結(jié)果均顯示，在顯著影響機(jī)體發(fā)育的大量信號通路傳遞方面，初級纖毛扮演者一定角色，包括Shh、Wnt、TGF、PDGFRα、Notch和RTK等信號通路，以及發(fā)揮通過細(xì)胞外基質(zhì)受體的信號傳遞、嘌呤能受體和離子通道等功能[3-4，8]。若纖毛功能或結(jié)構(gòu)失常，會阻止部分發(fā)育關(guān)鍵信號途徑順利傳導(dǎo)，由此導(dǎo)致包括呼吸障礙，肥胖，失明、腎功能異常，骨骼畸形、智力遲鈍等等缺陷[9]，甚至引起一系列嚴(yán)重的遺傳綜合癥。

研究證實(shí)哺乳動物Hedgehog(Hh)信號通過初級纖毛發(fā)揮作用，幾乎所有的Hh信號的核心轉(zhuǎn)導(dǎo)組件都聚集在初級纖毛上[8]，與Wnt信號傳導(dǎo)也有一定關(guān)系[4]，異常的Wnt信號傳導(dǎo)可影響細(xì)胞的增殖與分化[10-11]。Sonic hedgehog(Shh)為Hh的其中一亞類，研究顯示Shh在腭發(fā)育關(guān)鍵時期發(fā)揮重要作用[12]，特定時期小鼠胚胎腭突上皮細(xì)胞有Shh的廣泛表達(dá)[13]。那么小鼠腭發(fā)育期間Shh信號發(fā)揮作用是否依賴于初級纖毛還不得而知，要解決這個問題首先要弄清小鼠腭突上皮細(xì)胞初級纖毛的分布情況，才能進(jìn)行進(jìn)一步深入的研究。

掃描電鏡顯示，ED12.5、ED 13.5、ED 14.5實(shí)驗(yàn)動物的腭突上皮細(xì)胞在腭突表面呈突起狀，其形似半球，清晰呈現(xiàn)出緊密的胞間聯(lián)系，此現(xiàn)象相符于其它研究人員借助掃描電鏡所得結(jié)果，可見取材以及之后的樣本制作行為，未傷及小鼠腭突[14]。借助透射電鏡，能夠發(fā)現(xiàn)小鼠腭突細(xì)胞具備完好、正常的胞膜，且顯示出均勻的胞質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器(包括線粒體等)骨架清晰，且未見腫脹，細(xì)胞核與核膜皆正常，核膜嚴(yán)密貼合核，核仁似圓狀，具均勻質(zhì)地，可見，透射電鏡標(biāo)本制備行為，未導(dǎo)致胞內(nèi)細(xì)胞器受損，進(jìn)而推斷此次觀察到的諸如初級纖毛等其它細(xì)胞器與客觀狀況相符[15]。掃描電鏡和透射電鏡觀察到的纖毛長度不一致，可能是由于標(biāo)本制作觀察過程中并不是每個觀察鏡像或切片都展示了完整的初級纖毛，或者初級纖毛正處于合成/解聚的過程，而不能展示其全長[16]。

借助掃描電子顯微鏡，能夠觀察到有纖毛狀結(jié)構(gòu)分布于一些上皮細(xì)胞表面，此類結(jié)構(gòu)長達(dá)2～8 μm左右，本研究進(jìn)一步利用透射電鏡進(jìn)行觀察，通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)了初級纖毛內(nèi)部典型的9+0型微管結(jié)構(gòu)，同時可清晰觀察到纖毛基部的軸絲和纖毛膜等結(jié)構(gòu)，在初級纖毛直徑與長度等方面，本次觀察所得基本相符于全球其它研究人員的此類觀察結(jié)果[17-18]，說明本研究觀察到的纖毛樣結(jié)構(gòu)即為初級纖毛。

比較幾個時間點(diǎn)的小鼠胚胎腭突上皮細(xì)胞，與ED12.5胎鼠相比，在腭突表面初級纖毛量方面，ED13.5小鼠偏多，在此方面，ED14.5小鼠則相較ED13.5小鼠偏少，然而在長度方面，則前者較長，ED15.5小鼠腭突上皮細(xì)胞表面無纖毛結(jié)構(gòu)，同時絲狀偽足量大幅下降?；贓D12.5～14.5小鼠腭突生長發(fā)育特征表現(xiàn)以及此部位上皮細(xì)胞內(nèi)各類信號表達(dá)時間[19]，再結(jié)合外部環(huán)境可導(dǎo)致初級纖毛長度改變的表現(xiàn)[20]，故推測隨著腭部發(fā)育中各種關(guān)鍵信號的表達(dá)和消失，初級纖毛隨之見規(guī)律性改變，同時其還同腭發(fā)育相關(guān)主要信號途徑有著顯著關(guān)聯(lián)性。

由此次研究，可明確ED12.5、ED13.5、ED14.5的小鼠腭突上皮細(xì)胞表面有初級纖毛分布，同時發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)動物所處發(fā)育期不同，此類初級纖毛在數(shù)量與形態(tài)方面也隨之改變，為探究腭發(fā)育過程中諸如Shh此類核心信號的傳遞，及對在胚胎腭部各發(fā)育期對應(yīng)的腭突表面超微結(jié)構(gòu)變化的分析，開辟出新路徑。