芹菜素的提取及應(yīng)用研究進(jìn)展

劉琴，呂慶云

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023）

芹菜素（4′，5，7，三羥基黃酮），又稱為芹黃素，洋芹素，屬于黃酮亞類。芹菜素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1（a）所示，它是具有3個(gè)羥基取代基的黃酮，其中羥基的去除將其轉(zhuǎn)化為黃酮的基本結(jié)構(gòu)，黃酮的基本結(jié)構(gòu)見圖1（b）所示。黃酮的基本結(jié)構(gòu)具有15個(gè)碳骨架，即2個(gè)苯環(huán)和1個(gè)雜環(huán)?；邳S酮基本結(jié)構(gòu)上羥基的位置和數(shù)量，產(chǎn)生6種可能的衍生物，分別包括在4′，5，7位的單羥基黃酮，在 4，5/5，7/4′，7 位的二羥基黃酮[1]。除羥基外，甲氧基、糖苷和乙?；材軌虍a(chǎn)生許多衍生物。芹菜素在植物界廣泛分布，也是研究最多的酚類物質(zhì)之一。芹菜素主要存在于蔬菜（西芹、旱菜、水芹和洋蔥）、水果（橙子）、草藥（洋甘菊、百里香、牛至和羅勒）和飲料（茶、啤酒和葡萄酒）中[1-2]。一般而言，黃酮類化合物因其抗氧化的性質(zhì)而廣為人知，大量文獻(xiàn)中報(bào)道了芹菜素的抗氧化、抗高血糖、抗炎特性。此外，也報(bào)道了對各種癌細(xì)胞的細(xì)胞抑制、高血壓、心臟肥大、自身免疫、抗動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防等方面的特性[3-5]。

圖1 芹菜素的化學(xué)結(jié)構(gòu)及黃酮的基本結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of apigenin and basic structure of flavonoids

1 合成機(jī)理

在生物遺傳學(xué)上，芹菜素是植物的次生代謝產(chǎn)物，是苯丙烷途徑的產(chǎn)物，可以由苯丙氨酸和酪氨酸兩種莽草酸衍生物前體獲得，如圖2所示。在苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）催化下，苯丙氨酸直接通過非氧化脫氨作用形成肉桂酸，然后在肉桂酸-4-羥化酶（cinnamic acid-4-hydroxylase，C4H）的催化下，在C4處氧化，轉(zhuǎn)化為香豆酸。而酪氨酸直接通過脫氨作用形成香豆酸。香豆酸通過4-香豆酸-輔酶A連接酶（4-coumaric acid-coenzyme A ligas，4CL）催化轉(zhuǎn)變?yōu)閷ο愣辊］o酶A。將對香豆酰輔酶A與3個(gè)丙二酰輔酶A殘基縮合，然后通過查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）進(jìn)行芳構(gòu)化形成查爾酮，其通過查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）進(jìn)一步異構(gòu)化形成柚皮素。最后，在黃酮合成酶（flavonoid synthase，F(xiàn)SⅠ/FSⅡ）作用下，柚皮素被氧化成芹菜素[6-7]。

圖2 芹菜素生物合成途徑Fig.2 Biosynthesis pathway of apigenin

2 芹菜素的制備

2.1 芹菜素的提取

近年來芹菜素主要從芹菜、海州香薷、菊科植物和豆科植物中提取，芹菜葉中含量最高，約20 mg/g～30 mg/g。提取芹菜素的方法一般為有機(jī)溶劑提取法、超聲微波輔助提取法、酶提取法、酸提取法、亞臨界水提法，其中有機(jī)溶劑提取法最常用。

2.1.1 溶劑提取法

在芹菜素的提取中，影響芹菜素的提取效果的因素有提取溶劑的種類、濃度、溶液酸堿度和提取時(shí)間等。提取溶劑有甲醇、乙醇、離子液體、苯和氯仿等，但由于溶劑大都有較大毒性和一定的腐蝕性，所以最常用的還是乙醇。

黃志強(qiáng)等[8]以水芹為原料通過4個(gè)單因素試驗(yàn)確定正交因素和范圍，然后進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，得出了最佳提取條件，乙醇的含水量為10%，水浴溫度80℃，水浴時(shí)間 4 h，固液比 1∶35（g/mL）。Han等[9]選取了4種離子流體和70%的乙醇水溶液提取芹菜中的芹菜素，與70%的乙醇水溶液相比，1.0 mol/L的1-丁基-3-甲基咪唑甲磺酸水溶液作為萃取溶劑得到的芹菜素含量提高了一倍多。然后通過4個(gè)單因素確定最佳提取工藝，超聲功率200 W，pH 1.0，固液比1∶10（g/mL），超聲時(shí)間90 min。用乙醇提取的芹菜素耗時(shí)長、能耗大、提取率不高、易含雜質(zhì)、成本較大。但乙醇能溶解許多有機(jī)物，提取成分比較完全。

2.1.2 酸提取法

酸水解法，方法簡單，成本低，且充分利用芹菜素在熱水中溶解度低的特性獲得比較純的芹菜素粗提物。劉本國等[10]通過向亮葉楊桐葉的水提液中加入一定量的硫酸，在電爐上加熱酸解，獲得大量沉淀物，然后過濾干燥，加入適量乙醇重結(jié)晶獲得芹菜素的粗提物，用高效液相測得的粗提物的芹菜素含量為64.80%。

2.1.3 酶提法

酶解輔助提取法通過使用酶制劑，可以使細(xì)胞壁成分水解和降解。同時(shí)，可以破壞氫鍵相互作用，然后可以釋放更多的游離黃酮化合物。這種方法提取率高、操作簡單。Zhang等[11]研究了用酶預(yù)處理和負(fù)壓空化提取法從木豆根中提取染料木黃酮和芹菜素。通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化了負(fù)壓空化提取法過程中涉及的重要參數(shù)，然后通過中心復(fù)合設(shè)計(jì)研究關(guān)鍵參數(shù)得到提取條件。在最佳條件下，與標(biāo)準(zhǔn)負(fù)壓空化提取法相比，染料木黃酮和芹菜素的產(chǎn)量分別為0.628 mg/g和0.359 mg/g，分別增加了44.70%和53.05%。周國梁等[12]用含0.5%纖維素酶、0.3%木瓜蛋白酶和0.3%果膠酶的復(fù)合酶提取芹菜素，通過響應(yīng)面優(yōu)化各個(gè)單因素，得出鳳尾草中芹菜素提取率最大值為399.63 μg/g。

2.1.4 超聲微波輔助提取

超聲和微波都能增加溶劑的滲透性，溶劑與物料的接觸面積加大；還能通過超聲空化產(chǎn)生的強(qiáng)剪切力和超聲引起胞內(nèi)壓力增加來破壞萃取細(xì)胞的細(xì)胞壁，很容易使細(xì)胞釋放內(nèi)容物質(zhì)，顯著提高和改善提取效果。劉全德等[13]研究超聲波－微波協(xié)同萃取芹菜中芹菜素的含量，通過單因素和正交試驗(yàn)探討最佳的提取工藝：乙醇含水量20%，微波處理功率600 W，固液比1 ∶30（g/mL），微波處理時(shí)間 240 s，芹菜素提取率為14.156 μg/g。

2.1.5 亞臨界水提法

亞臨界水法用于提取中等極性和非極性黃酮類化合物，是一種新興提取方法。Cvetanovi等[14]用亞臨界水從洋甘菊中提取芹菜素，并確定了芹菜素最大產(chǎn)率的最佳操作參數(shù)；物料比1∶30（g/mL）；攪拌速率3 Hz；壓力45 bar；溫度115℃；時(shí)間30 min。在提取過程中用水作為溶劑，是一種環(huán)保、無毒、高效的方法。

2.2 芹菜素含量測定

芹菜素存在于許多草藥、水果和蔬菜中。不同的地區(qū)、種類和植物部位，芹菜素的含量都有所不同，測量芹菜素的方法有薄層色譜法、紫外分光光度法、高效液相色譜法等，常用的方法是高效液相色譜法。近些年測得不同樣品中的芹菜素含量如表1，可見芹菜葉中的芹菜素含量最高。

續(xù)表1 不同樣品中的芹菜素含量Continue table 1 Apigenin content of different samples

3 芹菜素的遞送系統(tǒng)

目前存在的許多治療藥物分子（核酸、蛋白質(zhì)、肽、抗癌藥物等）都具有生物利用度較低，溶解度低，清除快速，毒性高等缺點(diǎn)。芹菜素也是因?yàn)檫@些原因從而被限制推廣和應(yīng)用。因此，市場存在開發(fā)遞送方法和藥物遞送載體的巨大需求。藥物遞送系統(tǒng)研究藥物的設(shè)計(jì)、生物利用度、藥物遞送的控制和持續(xù)釋放，并且它還能夠維持藥物完整轉(zhuǎn)運(yùn)至特定部位，同時(shí)不損壞其他組織。主要目標(biāo)是達(dá)到最佳治療效果，減少劑量，使用合適的劑量和給藥方式，減少副作用，提高藥物或藥物分子的溶解度和生物利用度。

3.1 芹菜素與磷脂的復(fù)合物

磷脂是一種由細(xì)胞膜組成的重要物質(zhì)，同時(shí)含有疏水性脂肪酸酯和親水性磷酸酯基。它可以在一定條件下與具有特定結(jié)構(gòu)的化合物反應(yīng)形成絡(luò)合物，提高生物利用度。制備過程簡單，成本低，是一種改善微溶和吸收不良藥物生物利用度的新方法。Brad等[25]將100 mg芹菜素和200 mg大豆卵磷脂溶解在50 mL四氫呋喃中，并將混合物在25℃下磁力攪拌3 h。然后，通過真空濃縮除去溶劑，得到兩種物質(zhì)的復(fù)合物。通過溶劑法制備的復(fù)合物，提高了生物利用度，增強(qiáng)芹菜素的工業(yè)應(yīng)用。Munyendo等[26]采用薄膜水合法制備了D-α-琥珀酸生育酚聚乙二醇酯修飾的芹菜素磷脂復(fù)合物。實(shí)現(xiàn)87.35%藥物包封和12.60%藥物負(fù)載，顯示球形形態(tài)，粒徑（137.1±3.4）nm和表面電荷-12.94 mV。與游離藥物相比，增加了芹菜素2.4倍的腸道吸收。

3.2 芹菜素與環(huán)糊精包合物

環(huán)糊精是外部親水性和內(nèi)部疏水性化合物，與各種親脂性藥物形成復(fù)合物，改變它們的溶解性，穩(wěn)定性，揮發(fā)性和風(fēng)味。Huang等[27]以N，N-二甲基甲酰胺為溶劑，二氧化碳為反溶劑，采用超臨界反溶劑法制備芹菜素和羥丙基-β-環(huán)糊精包合物。通過試驗(yàn)確定芹菜素和羥丙基-β-環(huán)糊精的摩爾比1∶1。通過單因素試驗(yàn)確定最佳條件，沉淀壓力22.5 MPa，沉淀溫度50℃和芹菜素濃度20 mg/mL。在最佳條件下，芹菜素和羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的負(fù)載效率（13.97±0.17）%，包封率（93.22±1.17）%，平均粒徑（392.13±7.56）nm。

3.3 芹菜素納米囊

納米囊具有無毒、可生物降解和非免疫原性等特性，非常適合用作水不溶性藥物載體，以改善水中的溶解度和分散性。Ding等[28]研究采用相轉(zhuǎn)化法制備載有芹菜素的脂質(zhì)納米膠囊，采用單純晶格設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以載藥量和包封率為指標(biāo)優(yōu)化配方。最佳制劑的載藥量和包封率分別為（1.26±0.05）%和（95.86±0.38）%，芹菜素納米膠囊的形狀為球形，具有良好的分散性，平均粒徑46.1 nm，zeta電位-28.18 mV。

3.4 芹菜素膠束

膠束通常由兩親性嵌段共聚物組成。當(dāng)嵌段共聚物在水中自組裝時(shí)，疏水部分可以面對面形成疏水核，而在外部交聯(lián)的親水鏈形成殼[29]。因此，疏水性藥物可以容易地被包封在聚合物膠束的疏水性核中。Zhai等[30]通過薄膜分散方法制備了由PluronicP123、SolutolHS15和芹菜素組成的聚合物膠束，并且配方用中心復(fù)合設(shè)計(jì)優(yōu)化。所得膠束在透射電子顯微鏡下呈球形，平均直徑16.9 nm，包封率96.36%，載藥量1.32%。體外藥物釋放研究表明，近36%的芹菜素在36 h內(nèi)從膠束中釋放出來，表現(xiàn)出持續(xù)釋放特性。細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明，芹菜素膠束的細(xì)胞毒性對HepG2和MCF-7癌細(xì)胞體外抑制率顯著高于游離藥物。因?yàn)樾∧z束可以通過增強(qiáng)的滲透性和保留時(shí)間，使藥物更好發(fā)揮作用。

4 醫(yī)藥功能

4.1 抗腫瘤特性

癌癥是最嚴(yán)重的危及生命的疾病之一，影響所有年齡段的人，并被認(rèn)為是導(dǎo)致全世界死亡率和發(fā)病率高的主要原因之一。癌細(xì)胞的特征在于突變和遺傳不穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)節(jié)受損，不受控制的增殖和抗細(xì)胞凋亡[31]。芹菜素是一種天然黃酮類化合物，存在于天然植物飲食中。過去幾年大量研究表明，這種特殊的天然化合物具有潛在的抗癌特性。由于極低毒性和對癌細(xì)胞的顯著影響，引起抗癌領(lǐng)域的極大關(guān)注。

4.1.1 卵巢癌

分化抑制劑（inhibitor of differentiation 1，Id1）能夠與堿性蛋白bHLH結(jié)合，抑制DNA與堿性蛋白bHLH結(jié)合，影響了基因的表達(dá)和細(xì)胞分化的能力，促進(jìn)腫瘤新血管生成，促進(jìn)腫瘤發(fā)生[32]。在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)Id1升高，其水平與卵巢腫瘤的惡性潛能相關(guān)。因此，Id1是卵巢癌治療的潛在靶標(biāo)。Li等[33]證明芹菜素通過激活轉(zhuǎn)錄因子3抑制Id1的表達(dá)，減少了人卵巢癌A2780細(xì)胞的增殖和腫瘤發(fā)生的可能性。

4.1.2 肺癌

Akt的激活在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）中起著至關(guān)重要的作用，而EMT是引發(fā)和促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的最重要機(jī)制之一。芹菜素是一種能強(qiáng)力抑制Akt作用的物質(zhì)。Chang等[34]用不同狀態(tài)表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）細(xì)胞，采用活體原位生物發(fā)光異種移植模型，測定芹菜素的抗腫瘤活性。結(jié)果表明，通過抑制Snail/Slug介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，證明芹菜素能抑制具有不同狀態(tài)EGFR的NSCLC細(xì)胞的遷移、侵襲和集落形成。機(jī)理研究表明，芹菜素通過下調(diào)CD26/DPPIV，可調(diào)節(jié)Akt和Snail/Slug信號(hào)傳導(dǎo)之間的相互作用，從而抑制具有多種EGFR狀態(tài)的肺癌轉(zhuǎn)移。

4.1.3 胃癌

芹菜素可以影響腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，基因表達(dá)水平以及代謝、增殖、侵襲和分化。Chen等[35]用不同濃度的芹菜素培養(yǎng)胃癌細(xì)胞（HGC-27、SGC-7901）和正常胃上皮細(xì)胞（GES1）。探討了凋亡細(xì)胞的形態(tài)變化，細(xì)胞周期的變化，胃癌細(xì)胞的凋亡率；在JC-1染色后分析線粒體膜電位變化；通過實(shí)時(shí)PCR分析芹菜素與Bcl-2和Caspase-3表達(dá)的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)芹菜素能降低細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2水平，增強(qiáng)促凋亡蛋白Bax水平，導(dǎo)致線粒體膜電位降低和Caspase-3活化，然后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率增加。

4.1.4 其他

芹菜素還對肝癌、前列腺癌、乳腺癌、皮膚癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、子宮內(nèi)膜癌、腎上腺皮質(zhì)癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、甲狀腺癌等不同的腫瘤細(xì)胞均有抑制作用[36-38]。

4.2 抗炎特性

炎癥的病發(fā)與巨噬細(xì)胞分泌的炎癥介質(zhì)（TNF-α、IL-6、NO等）有關(guān)，而炎癥介質(zhì)的釋放又與iNOS和COX-2催化有關(guān)[39]。Patil等[40]研究了芹菜素對人肺A549細(xì)胞中脂多糖誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子和AP-1的抗炎作用機(jī)制。通過分析促炎細(xì)胞因子（iNOS、COX-2和AP-1）的表達(dá)，確定芹菜素能顯著抑制促炎細(xì)胞因子和AP-1蛋白的表達(dá)，包括一氧化氮的產(chǎn)生。最終證實(shí)了芹菜素的抗炎作用。

4.3 抗氧化特性

天然黃酮具有抗自由基和抑制體內(nèi)氧化酶活性的特點(diǎn)[41]。芹菜素能夠與鐵離子和銅離子鰲合，還原金屬離子，清除自由基，還能抑制DNA和低密度脂蛋白損傷和脂質(zhì)過氧化作用[42]。黃斌等[43]用芹菜素給高脂雄性大鼠灌胃40 mg（/kg·d），連續(xù)12周，發(fā)現(xiàn)芹菜素可明顯改善其腎臟內(nèi)氧化。Ra?kovi等[3]通過測定肝勻漿中的生化參數(shù)，組織學(xué)評估和氧化狀態(tài)，研究芹菜素對撲熱息痛引起的大鼠肝毒性的影響。芹菜素可以防止對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的丙二醛水平升高。與對照組相比，在含毒性劑量的對乙酰氨基酚的肝勻漿中，過氧化氫酶和谷胱甘肽還原酶的活性顯著增加。結(jié)果表明，芹菜素抑制脂質(zhì)過氧化水平，并顯著增強(qiáng)了對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的大鼠肝毒性的酶抗氧化防御。

4.4 舒張血管和抑制動(dòng)脈硬化

隋海霞等[44]研究發(fā)現(xiàn)芹菜素具有顯著的舒張血管作用，其機(jī)制涉及到NO介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，與細(xì)胞外的鈣內(nèi)流受抑、受體操縱性鈣通道、鉀通道激活和抑制電壓依賴性鈣通道有關(guān)。陳寧[45]通過給大鼠建模、灌胃12周、測定各種相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)芹菜素具有抑制動(dòng)脈粥樣硬化損傷的作用。

4.5 其他

除上述的一些功能外，過去幾十年也有對芹菜素其他醫(yī)藥功能的研究報(bào)道，降血糖、降血脂、抗病毒、鎮(zhèn)靜、保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞、對骨質(zhì)疏松的治療、提高自身免疫、調(diào)節(jié)酶活性和抑制血小板聚集的作用[1，6]。

5 結(jié)論與展望

目前對芹菜素提取的方法通常耗時(shí)、耗力或使用大量有機(jī)溶劑，而且提取的溶劑單一，一般是乙醇。將來需要開發(fā)環(huán)保、無毒、安全、可生物降解且成本低的提取溶劑。因?yàn)榍鄄怂厣锢寐实?，為了改善這一問題，已經(jīng)研究有許多新的劑型，但依然存在許多問題需要解決，如制備步驟繁瑣、生產(chǎn)成本較高、不適合工業(yè)化生產(chǎn)等。未來的芹菜素制劑要求具有高載藥量和包封率、穩(wěn)定性、緩釋效果、降低不良反應(yīng)的可能性、易被人體吸收的特點(diǎn)。