HPLC-MS/MS法測(cè)定腌制食品中色素含量的預(yù)處理方法比較

鐘萍，陳鮮麗，羅威，*，李亞楠

（1.湛江幼兒師范專科學(xué)校，廣東湛江524084；2.嶺南師范學(xué)院基礎(chǔ)教育學(xué)院，廣東湛江524037；3.韶關(guān)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，廣東韶關(guān)512026）

蘇丹紅I～I(xiàn)V、蘇丹紅G、蘇丹橙G和蘇丹紅7B均為合成色素，既可用于石油、機(jī)油等化工產(chǎn)品的調(diào)色，也可用于皮革、紡織品或家具的涂染[1-2]。由于上述化合物的結(jié)構(gòu)中均有偶氮結(jié)構(gòu)，人體若長(zhǎng)期接觸，會(huì)對(duì)肝、腎臟器產(chǎn)生強(qiáng)烈毒性作用，并有致癌風(fēng)險(xiǎn)[3-4]，因此國(guó)內(nèi)外食品安全監(jiān)管部門明確要求，不允許將其作為食品添加劑使用，因此建立高效、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，對(duì)相關(guān)食品的安全監(jiān)管意義重大。

目前蘇丹紅I～I(xiàn)V、蘇丹紅G、蘇丹橙G和蘇丹紅7B的檢測(cè)方法主要有紫外分光光度法[5]、薄層色譜法[6]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[7-8]、高效液相色譜-質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS）[9-10]、氣相色譜法[11]及酶聯(lián)免疫檢測(cè)法[12]等。其中以HPLC法和HPLC-MS/MS法應(yīng)用最為常見，但高效液相色譜法的靈敏度較低，且易受共存組分的干擾，而其與質(zhì)譜聯(lián)用后，可克服上述缺點(diǎn)，具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)且定性與定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)，利于排除液相色譜的假陽(yáng)性結(jié)果，因而利用HPLCMS/MS法檢測(cè)腌制肉類食品中合成色素的研究被廣泛報(bào)道[13-15]，但不同預(yù)處理樣品方法對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，卻鮮有提及。因此，本研究分別采用液液萃取-凝膠滲透色譜（liquid liquid extraction-gel permeation chromatography，LLE-GPC）法、固相萃取法（solid-phase extraction，SPE）和QuEChERS法預(yù)處理腌制肉類食品后，利用HPLC-MS/MS法測(cè)定合成色素的含量，從而為相關(guān)食品中合成色素的定量檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅III、蘇丹紅IV、蘇丹紅G、蘇丹橙G和蘇丹紅7B標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度≥90.0%）：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；臘腸：市售；甲醇、乙腈、甲酸、醋酸銨、乙酸乙酯、環(huán)己烷、正己烷、二氯甲烷均為色譜純：德國(guó)默克公司；乙酸、無(wú)水硫酸鈉均為分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硅膠（C18）填料、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）填料、Bio-Beads S-X3填料：天津博納艾杰爾科技有限公司；試驗(yàn)用水為高純水（電阻率大于18.2 MΩ·cm）。

PL-GPC220凝膠滲透色譜儀、Agilent 1200高效液相色譜：美國(guó)安捷倫科技公司；API 4000四極桿質(zhì)譜儀：美國(guó)PE公司；ME204電子天平：梅特勒-托利多公司；LG-22M高速冷凍離心機(jī)：四川蜀科儀器有限公司；FV64全自動(dòng)氮吹濃縮儀：廣州得泰儀器科技有限公司；FRQ-1020超聲波清洗器：溫州百亞超聲設(shè)備有限公司；XH-D渦旋混合器上海冠森生物科技公司；HN-98IB組織勻漿機(jī)：上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1.1 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制

分別準(zhǔn)確稱取蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅III、蘇丹紅IV、蘇丹紅G、蘇丹橙G和蘇丹紅7B標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10.0 mg（精確至0.000 1 g），共置于100 mL容量瓶?jī)?nèi)，用乙腈稀釋至刻度線定容、搖勻，即得0.1 mg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別精密移取上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.10、0.50、1.0、5.0、10.0 mL，置于 100 mL 容量瓶?jī)?nèi)，用乙腈稀釋至刻度線定容、搖勻，配制成濃度為0.10、0.50、1.0、5.0、10.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 儀器工作條件

1.2.2.1 凝膠滲透色譜條件

凝膠色譜柱（400 mm×25 mm），填料為Bio-Beads S-X3（0.037 mm～0.075 mm）；淋洗液：乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，體積比）；流量：5.0 mL/min；進(jìn)樣體積：5 mL。

1.2.2.2 液相色譜條件

Agilent Zorbax SB C18色譜柱（100 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為 30 ℃；流量為 1.0 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸、流動(dòng)相 B 為乙腈；梯度洗脫程序：0～4 min 60%B；6 min～8 min時(shí)，B線性升高至100%；10 min～12 min時(shí)B線性降低至60%后，保持8 min。

1.2.2.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；掃描方式為正離子掃描模式；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（multi-reaction monitoring，MRM）；離子源溫度600℃；氣簾氣流量30 L/min；霧化氣流量40 L/min；輔助干燥氣流量50 L/min；噴霧電壓為5 200 V。

MRM監(jiān)測(cè)模式下7種合成色素的特征離子及其它質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 7種合成色素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Optimal mass parameters for the seven kinds of synthetic colorants

1.2.3 LLE-GPC法

1.2.3.1 樣品制備

超市購(gòu)置的臘腸食品，搗碎后混勻，置于組織勻漿機(jī)內(nèi)，完全粉碎制得供試樣品。

1.2.3.2 待測(cè)物提取

準(zhǔn)確稱取粉碎完全后的樣品2.0g（精確至0.0001g），置于50 mL聚四氟乙烯離心管內(nèi)，精密移取20 mL乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，體積比），搖勻后渦旋振蕩15 min后，加入2 g無(wú)水硫酸鈉，繼續(xù)振蕩10 min后靜置至上層溶液澄清，離心7 min后（轉(zhuǎn)速：4 500 r/min），吸取上清液，重復(fù)上述步驟，合并兩次提取液，過(guò)0.45 μm濾膜，即得提取溶液。

1.2.3.3 GPC純化

精密移取提取溶液10 mL，采用1.2.2.1凝膠滲透色譜條件凈化1.2.3.2中提取液，收集22 min～28 min洗脫液后，于40℃氮?dú)鉂饪s蒸干，殘余物采用乙腈定容至1.0 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，上樣至高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測(cè)。

1.2.4 SPE純化

精密移取提取溶液10 mL至活化后的Thermo SCX固相萃取柱，經(jīng)50 mL正己烷淋洗去除油脂后，采用20 mL二氯甲烷洗脫，收集洗脫液，于40℃氮?dú)鉂饪s蒸干，采用乙腈定容至1 mL后，過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.2.5 QuEChERS法

準(zhǔn)確稱取粉碎完全后的樣品2.0g（精確至0.0001g），置于50 mL聚四氟乙烯離心管內(nèi)，加入20 mL乙腈-水（1∶1，體積比），渦旋振蕩15 min后，加入2 g無(wú)水硫酸鈉，繼續(xù)振蕩 10 min，離心 7 min后（轉(zhuǎn)速：4 500 r/min），吸取上清液，重復(fù)上述步驟，合并兩次提取液后，精密移取10 mL，加入至裝有100 mg硅膠（C18）吸附劑的聚四氟乙烯離心管內(nèi)，渦旋振蕩5 min后，離心5 min（轉(zhuǎn)速：4 500 r/min），吸取上清液，過(guò) 0.22 μm 濾膜，待測(cè)。

1.2.6 基質(zhì)干擾評(píng)價(jià)

為評(píng)估不同預(yù)處理方法的試驗(yàn)條件對(duì)基質(zhì)干擾的去除效果，在乙腈和空白臘腸中分別加入等體積1.0μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，照公式：基質(zhì)效應(yīng)（ME/%）=|（A/B-1）｜×100，（式中：A為空白臘腸中色素的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度；B為乙腈中色素的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度）計(jì)算采用不同預(yù)處理方法試驗(yàn)條件的基質(zhì)效應(yīng)。參考相關(guān)文獻(xiàn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[16]，當(dāng)ME/%＜10%不存在基質(zhì)干擾，10%＜ME/%＜20%時(shí)，為低程度干擾，20%＜ME/%＜50%時(shí)，為中程度干擾，ME/%＞50%時(shí)，則基質(zhì)嚴(yán)重干擾目標(biāo)化合物的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同化合物的色譜圖

根據(jù)7種合成色素的特征離子，在MRM監(jiān)測(cè)模式下不同化合物的總離子流圖，見圖1，LLE-GPC法中凝膠滲透色譜分離，見圖2。

圖1 7種合成色素的總離子流色譜圖Fig.1 The total ion chromatogram of seven kinds of synthetic colorants

2.2 線性范圍與檢出限

圖2 GPC純化加標(biāo)樣品色譜圖Fig.2 The Gel permeation chromatogram

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，利用HPLC-MS/MS法測(cè)定不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度（y）作縱坐標(biāo)，7種合成色素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)以3倍信噪比（S/N）為檢測(cè)限，以10倍信噪比（S/N）為定量限，得到不同分析物在一定線性范圍下的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢測(cè)限與定量限，結(jié)果見表2。

2.3 LLE-GPC法條件優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑選擇

提取溶劑對(duì)目標(biāo)化合物的提取效率直接影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度，為保證樣品中目標(biāo)化合物完全富集，選擇不同提取溶劑，照1.2.3.2步驟，分別萃取1.2.6中樣品溶液，考察正己烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯、乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，體積比）和乙酸乙酯-正己烷（1∶1，體積比）對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同提取溶劑的ME/%均低于10%，但考慮后續(xù)凝膠色譜凈化的洗脫液為乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，體積比），因此確定乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，體積比）為提取溶劑。

表2 線性范圍、線性回歸方程、方法檢測(cè)限與定量限Table 2 Linear ranges，linear regression equation，limit of detection and limit of quantitation

2.3.2 提取次數(shù)選擇

提取次數(shù)間接反映提取效率，照1.2.3.2步驟，分別考察提取次數(shù)對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品溶液經(jīng)兩次提取后，對(duì)不同色素的基質(zhì)效應(yīng)可降低至5%以下，因此確定提取次數(shù)為兩次。

2.4 SPE法條件優(yōu)化

2.4.1 固相萃取柱選擇

固相萃取需利用固相萃取柱選擇性吸附目標(biāo)化合物，經(jīng)液相淋洗除雜后，再選擇性洗脫待測(cè)組分，從而實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的分離、凈化與富集，因此選擇不同類型固相萃取柱，照1.2.3.2步驟，分別處理1.2.6中樣品溶液，考察 Dikma ProElut Silica、Agilent Bond Elut PSA、Thermo SCX固相萃取柱對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 固相萃取柱對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響Fig.3 The effect of solid phase extraction column on matrix effect

從圖3可知，相較其它兩種固相萃取柱，采用Thermo SCX固相萃取柱的基質(zhì)效應(yīng)可降低至10%以下，這歸因于待測(cè)7種合成色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中均存在苯環(huán)偶氮結(jié)構(gòu)，易形成季銨鹽陽(yáng)離子，構(gòu)成π-π共軛穩(wěn)定體系，而Thermo SCX固相萃取柱的固定相為苯磺酸基，具有強(qiáng)陽(yáng)離子交換作用[17]，因此對(duì)上述合成色素均有較好保留，從而可有效去除基質(zhì)干擾，因此選擇采用Thermo SCX固相萃取柱。

2.4.2 洗脫劑選擇

提取溶液上樣至固相萃取柱后，經(jīng)正己烷洗滌去除油脂、蛋白質(zhì)和非極性的雜質(zhì)后，采用洗脫劑選擇性洗脫待測(cè)組分，因此考察等體積的不同洗脫劑（甲醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷）對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與其它洗脫劑相比，二氯甲烷對(duì)目標(biāo)化合物檢測(cè)的基質(zhì)效應(yīng)，可降至最低，因此采用二氯甲烷作為洗脫劑。

2.5 QuEChERS法條件優(yōu)化

2.5.1 提取劑選擇

由于7種合成色素的水溶性較好，化學(xué)性質(zhì)相近，因此分別選擇等體積的不同溶劑（乙腈、乙腈-水（1∶1，體積比）、水、甲醇、甲醇-水（1∶1，體積比））作為提取劑，照1.2.5步驟，預(yù)處理1.2.6中樣品溶液，考察對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用乙腈-水（1∶1，體積比）提取時(shí)，對(duì)7種合成色素檢測(cè)的平均基質(zhì)效應(yīng)最低（4.7%），這可能歸因于乙腈-水（1∶1，體積比）提取目標(biāo)物和其它極性雜質(zhì)后，加入無(wú)水硫酸鈉發(fā)生鹽析效應(yīng)，促使乙腈與水分層，從而除去溶于水相的蛋白質(zhì)、糖分等雜質(zhì)[18]，因此選用乙腈-水（1∶1，體積比）作為QuEChERS法預(yù)處理的提取劑。

2.5.2 吸附劑選擇

QuEChERS法常用 C18、N-丙基乙二胺（PSA）作為吸附劑，以去除提取溶劑中的糖類和蛋白質(zhì)，因此分別照1.2.5步驟，預(yù)處理1.2.6中樣品溶液，考察不同種類與用量的吸附劑對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 吸附劑對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響Fig.4 The effect of adsorbent on matrix effect

從圖4可知，當(dāng)吸附劑為PSA時(shí)，樣品基質(zhì)對(duì)合成色素檢測(cè)時(shí)干擾較小，7種色素的平均基質(zhì)效應(yīng)為5%左右，而C18相對(duì)較高，可能歸因于對(duì)部分色素具有一定吸附作用，另外隨著PSA用量的增多，平均基質(zhì)效應(yīng)降低并不明顯，因此選擇100 mg PSA作為QuEChERS法預(yù)處理的吸附劑。

2.6 不同預(yù)處理方法結(jié)果的準(zhǔn)確度與精密度

為考察3種預(yù)處理方法結(jié)果的準(zhǔn)確度與精密度，采用回收率表示結(jié)果準(zhǔn)確度，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示結(jié)果的精密度，分別照1.2.3、1.2.4和1.2.5所述步驟，預(yù)處理3個(gè)水平（0.50、1.0、5.0 μg/mL）的加標(biāo)樣品，進(jìn)行回收試驗(yàn)，每個(gè)水平平行測(cè)定5次，結(jié)果見表3。

表3 不同預(yù)處理方法的測(cè)定結(jié)果回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 3 The average recoveries and RSDs of results in different pretreatment methods（n=5）

從表3可知，SPE法的不同濃度水平的平均回收率在70%～110%之間，而QuEChERS法與LLE-GPC法的不同濃度水平的平均回收率均在90%～110%之間，優(yōu)于SPE法，這可能歸因于提取溶液在固相萃取時(shí)，未被完全洗脫，3種方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于5%。與LLE-GPC法、SPE法相比，QuEChERS法的提取、除雜、純化過(guò)程簡(jiǎn)便、快速，且無(wú)需昂貴的儀器與耗材，因而綜合預(yù)處理效率較高，適于相關(guān)產(chǎn)品的快速檢測(cè)。

3 結(jié)論

采用液液萃取-凝膠滲透色譜法、固相萃取法和QuEChERS法預(yù)處理腌制肉類食品后，利用高效液相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定其合成色素的含量，固相萃取法的不同濃度水平的平均回收率在80%～110%之間，而QuEChERS法與液液萃取-凝膠滲透色譜法的不同濃度水平的平均回收率均在90%～110%之間。與液液萃取-凝膠滲透色譜法、固相萃取法相較，QuEChERS法預(yù)處理樣品的操作更為簡(jiǎn)便、快速，且處理成本適中，綜合預(yù)處理效率較高，因此適用于腌制肉類食品中合成色素的測(cè)定。