B16全細(xì)胞腫瘤疫苗在C57BL/6小鼠中的免疫效果及腫瘤抑制作用

牟大超 吳沙沙 繆治永 周 軼

早在18世紀(jì)末，Edward Jenner就將牛痘疫苗接種于嬰幼兒體內(nèi)，以達(dá)到預(yù)防天花的目的，開創(chuàng)了疫苗免疫的新紀(jì)元[1]。當(dāng)今，腫瘤的免疫治療已成為繼手術(shù)治療、放化療后，最具前景的治療手段[2]。腫瘤免疫療法包括單克隆抗體治療、免疫檢查點抑制劑治療(PD-1、CTAL-4等)、嵌合抗原受體T細(xì)胞治療(CAR-T)、腫瘤疫苗等，部分已在臨床應(yīng)用，也不乏藥物上市[3-9]。相對來說，腫瘤疫苗的發(fā)展比較緩慢，較為成功的當(dāng)屬預(yù)防人乳頭狀瘤病毒(papillomavirus，HPV)感染的宮頸癌疫苗(HPV)[10]。腫瘤疫苗包括全細(xì)胞腫瘤疫苗、樹突細(xì)胞疫苗、多肽疫苗、核酸疫苗等[11-14]。腫瘤疫苗的發(fā)展緩慢究其原因可能與腫瘤特異性抗原的發(fā)現(xiàn)較難有關(guān)，針對腫瘤相關(guān)抗原所制備的疫苗在免疫保護(hù)中效果不佳[15]。

黑色素瘤是一種惡性程度較高的腫瘤，主要表現(xiàn)為皮膚色素痣的形態(tài)和顏色改變，可發(fā)生骨轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移等[16]。B16細(xì)胞是小鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞系，B16細(xì)胞腫瘤疫苗的研發(fā)在國外有相關(guān)報道，但其保護(hù)效果存在爭議，國內(nèi)相關(guān)研究報道較少[17-19]。本文采用滅活方式，加以弗氏佐劑，制備B16腫瘤細(xì)胞疫苗。采用三針免疫程序，對C57小鼠進(jìn)行免疫。第3次免疫后28天，對小鼠進(jìn)行B16活細(xì)胞攻擊，從而觀察其保護(hù)效果。在第3次免疫后檢測抗體滴度，在接受B16活細(xì)胞攻擊后取小鼠脾臟，分析淋巴細(xì)胞CD4+T和CD8+T 細(xì)胞，從而判斷疫苗的免疫效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細(xì)胞與動物 B16黑色素瘤細(xì)胞由四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國家重點實驗室楊寒朔教授惠贈，本室保種傳代。C57BL/6小鼠,清潔級,6～8周,購自四川成都達(dá)碩實驗動物有限公司[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2015-03]。

1.1.2 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM高糖培養(yǎng)基和青霉素鏈霉素購自Gibco公司，胎牛血清購自阿根廷Natocor公司，弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自德國Sigma公司，HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG購自杭州華安生物技術(shù)有限公司，TMB單組分顯色液購自北京索萊寶科技有限公司，CD3流式抗體、CD4流式抗體和CD8流式抗體均購自BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 B16細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16于含有10% FBS，青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 B16腫瘤疫苗制備及小鼠免疫 收集對數(shù)生長期B16細(xì)胞，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml，在-80 ℃冰箱和37 ℃之間反復(fù)凍融5次制得抗原。24只小鼠平均分為3組，每組雌雄各半。A組:接種含弗氏佐劑的B16腫瘤疫苗(1∶1混合)，B組:接種不含弗氏佐劑的B16腫瘤疫苗，C組:接種生理鹽水對照。每只C57BL/6小鼠的雙側(cè)腓腸肌肌肉注射各0.25 ml。采用0、1、2月三針免疫程序，A組中第1次免疫疫苗用弗氏完全佐劑配制，第2次和第3次免疫用弗氏不完全佐劑配制。第3次免疫后第28天，于每只小鼠鼠尾采血，分離血清用于ELISA抗體檢測。

1.2.3 ELISA法檢測小鼠抗B16抗體 B16細(xì)胞抗原用BCA法測濃度，每孔3 μg抗原包被96孔板4 ℃過夜，洗滌后每孔加200 μl 3%BSA封閉液，37 ℃孵育1 h，洗滌后首孔加20倍稀釋小鼠血清，2倍稀釋度梯度稀釋，共11個稀釋孔，100 μl/孔，最后一孔作空白對照孔。37 ℃孵育1 h，洗滌后每孔加100 μl TMB，室溫放置10 min。加2 M硫酸終止反應(yīng),酶標(biāo)儀450 nm波長測吸光度值。OD值≥2.1倍空白孔則判定為陽性。

1.2.4 B16細(xì)胞攻擊免疫小鼠 取對數(shù)生長的B16細(xì)胞，用生理鹽水稀釋成濃度為2.5×106/ml細(xì)胞懸液，每只免疫小鼠背部皮下接種細(xì)胞懸液100 μl，從第7天開始，用游標(biāo)卡尺測量皮下腫瘤的長徑和寬徑，每隔兩天測量1次，直到有小鼠因腫瘤生長而出現(xiàn)死亡。計算腫瘤體積=0.52×長徑×寬徑2。

1.2.5 荷瘤小鼠脾臟CD3，CD4和CD8流式分析 取B16細(xì)胞攻擊的免疫小鼠，在最后1次測量腫瘤體積后脫頸處死，無菌取脾臟研磨，過70 μm篩網(wǎng)，裂解紅細(xì)胞，分別在100 μl的FACS buffer中加CD3，CD4和CD8流式抗體染色，流式分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0分析數(shù)據(jù)。小鼠腫瘤體積分析均采用單因素重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析；流式數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。P<0.05判定為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 免疫小鼠血清抗B16細(xì)胞抗原結(jié)果

取第3次免疫后小鼠尾靜脈血分血清，每個樣本血清稀釋度分別為1/20,1/40,1/80,1/160,1/320,1/640,1/1280,1/2560,1/5120,1/102400和1/104800共11孔。陰性對照為免疫前各小鼠的尾靜脈血20倍稀釋血清。結(jié)果顯示，A組小鼠在第3次免疫后抗體幾何平均滴度(GMT)最高，達(dá)到1∶6891(P<0.05)；B組抗體滴度居中；而C組生理鹽水空白對照組抗體滴度最低。見圖1。

2.2 免疫小鼠皮下接種B16細(xì)胞后腫瘤生長情況

3組小鼠在疫苗第3次免疫后接種B16腫瘤細(xì)胞，隔天測量小鼠腫瘤生長情況。結(jié)果顯示，生理鹽水對照組小鼠腫瘤生長較快，在攻擊后第16天，腫瘤體積明顯大于其余2組(P<0.05)；含佐劑的B16疫苗小鼠腫瘤生長最慢，不含佐劑的B16腫瘤疫苗組居中。見圖2。

圖1 各組小鼠第3次免疫后抗體滴度GMT情況

圖2 各組小鼠第3次免疫后接種B16腫瘤細(xì)胞后腫瘤生長情況

2.3 免疫小鼠皮下接種B16細(xì)胞后脾臟CD3/CD4/CD8流式分析

在各組小鼠接種腫瘤后16天，無菌取脾，制成單細(xì)胞懸液，流式抗體CD3、CD4、CD8染色分析細(xì)胞群落。結(jié)果顯示，3組荷瘤小鼠，CD4+T 細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞群比例沒有統(tǒng)計學(xué)差異。但3組荷瘤小鼠比例CD4+T cell/CD8+T cell(0.78～0.87)與正常小鼠CD4+T cell/CD8+T cell(1.5～2)相比明顯降低，3組荷瘤小鼠CD3+CD8+T cell比例上調(diào)。見圖3。

圖3 各組小鼠脾臟免疫細(xì)胞群流式細(xì)胞術(shù)分析

3 討論

腫瘤的免疫療法至今已有多種，尤為突出的當(dāng)屬免疫檢查點抑制劑治療、嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫治療(CAR-T)、單克隆抗體治療等，并且已有相應(yīng)藥物上市。相對來說，腫瘤細(xì)胞疫苗發(fā)展較為緩慢，這可能與腫瘤特異性抗原的尋找較難有關(guān)。常用作疫苗制備的腫瘤相關(guān)抗原，其本身來源于機(jī)體正常細(xì)胞，缺乏特異性和免疫原性。

本文利用小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞，制備B16全細(xì)胞腫瘤疫苗，其具有抗原種類全的優(yōu)勢，加以弗氏佐劑，又增強(qiáng)其免疫原性。在國外的研究中，已有利用人黑色素瘤細(xì)胞株Mich-1和Mich-2制備全細(xì)胞腫瘤疫苗，以抑制腫瘤，延長生存率的研究報道[20]。該疫苗添加Hyper-IL-6作為分子佐劑，患者平均總生存期可達(dá)到17.3月，且未見嚴(yán)重不良事件，證實了全細(xì)胞疫苗的可行性。本文B16腫瘤疫苗與弗氏佐劑1∶1配比(首次免疫用弗氏完全佐劑，第2、3次免疫用弗氏不完全佐劑)，能激活小鼠B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生較高的抗體滴度，具有很好的免疫原性(圖1)。3組小鼠中雖然CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞比例沒有統(tǒng)計學(xué)差異，但3組小鼠CD3+CD8+T細(xì)胞數(shù)明顯增加，證實小鼠體內(nèi)T淋巴細(xì)胞也被激活(圖3)。A組小鼠B淋巴細(xì)胞的大量激活，除產(chǎn)生抗體，引發(fā)機(jī)體抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性效應(yīng)(ADCC)外，還能遞呈腫瘤抗原，供T細(xì)胞識別。兩者共同作用有利于對腫瘤生長的抑制(圖2)。

腫瘤疫苗的開發(fā)仍需大量工作，本文僅探討使用了腫瘤全細(xì)胞開發(fā)疫苗，包含了腫瘤細(xì)胞的所有抗原種類。在后續(xù)的研究中，可對腫瘤疫苗進(jìn)行優(yōu)化，分離純度更高、特異性更強(qiáng)的蛋白作為腫瘤抗原。同時為增強(qiáng)疫苗的免疫原性，可添加高效佐劑或在抗原蛋白上偶聯(lián)趨化因子等。腫瘤疫苗聯(lián)合其他治療方法，對末期腫瘤患者的聯(lián)合治療方法也亟待開發(fā)。