鑒定晚期肺腺癌EGFR-T790M耐藥基因突變候選生物標(biāo)志物

陳麗鵑 單莉 俞婷婷

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中最常見的驅(qū)動(dòng)基因，其中EGFR19del和EGFR21L858R是最常見的基因突變類型，具有以上基因突變的晚期NSCLC可使用第一代EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs）：易瑞沙或者特羅凱進(jìn)行抗腫瘤治療。但患者在用藥后的9個(gè)月-13個(gè)月都不可避免的出現(xiàn)了耐藥[1]。EGFR-T790M突變是一代EGFR-TKI最常見的耐藥機(jī)制，而IL-6/JAK1/STAT3、PI3K/Akt信號(hào)通路激活、Kras突變、Fox M1上調(diào)等為其他常見耐藥機(jī)制[2]。第三代EGFR-TKI Osimertinib被批準(zhǔn)用于攜帶EGFR-T790M耐藥基因突變患者，極大地延長了晚期NSCLC患者生存期。但不少患者因進(jìn)展病灶隱匿活檢困難，或因其他耐藥突變而無法使用Osimertinib。根據(jù)最新FLAURA研究結(jié)果[3]，Osimertinib一線用于EGFR突變晚期NSCLC患者中，中位總生存期優(yōu)于續(xù)慣EGFR-TKI治療患者。盡管奧西替尼在EGFR-T790M突變的NSNCL取得卓越療效，而那些因?yàn)椴≡铍[匿、年老體弱或者體液檢測(cè)假陰性的患者依然無法從中獲益[4-8]。本研究旨在使用蛋白組學(xué)的方法鑒定出與EGFR-T790M基因突變相關(guān)的生物標(biāo)志物，為無法二次活檢或體液檢測(cè)假陰性患者提供幫助。而蛋白組學(xué)技術(shù)具有很高的靈敏度和可重復(fù)性，已被廣泛用于研究藥物對(duì)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月-2018年12月就診于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院具有EGFR19缺失或EGFR21L858R基因突變晚期肺腺癌患者36例，根據(jù)病情需要口服易瑞沙治療，采用高分辨計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography,CT）進(jìn)行隨訪，實(shí)體瘤的療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors,RECIST）為疾病進(jìn)展后對(duì)患者再次行組織活檢，采用突變擴(kuò)增系統(tǒng)（amplification refractory mutation system,ARMS）法檢測(cè)出EGFR-T790M突變組患者18例；非EGFR-T790M組18例，收集以上患者血清于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所進(jìn)行保存。其中EGFR-T790M突變組男8例，女10例，年齡47歲-79歲，平均年齡（61.82±9.12）歲。非T790M突變組男12例，女6例，年齡42歲-83歲，平均年齡（62.17±10.53）歲。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料和儀器 材料：Bradford蛋白定量試劑盒、蛋白質(zhì)濃縮試劑盒（購自Bio-Rad）、TMT質(zhì)量標(biāo)記試劑盒和試劑、LC-MS級(jí)超純水、LC-MS級(jí)甲酸、LC-MS級(jí)乙腈（購自Thermo）、考馬斯亮蘭R-250購自Amresco、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺購自Sigma、質(zhì)譜級(jí)胰酶購自Promega、丙酮（購自國藥）、氨水（購自Sigma）、水飽和酚（購自 Solarbio）。儀器：L-3000 HPLC（購自RIGOL）、EASY-nLCTM 1200納升級(jí)UHPLC、QExactiveTMHF-X質(zhì)譜儀、C18除鹽柱、低溫離心機(jī)（購自Thermo）、恒溫混勻器（購自Scilogex）、冷凍干燥機(jī)（購自Labogene）、電泳儀、電泳槽（購自Bio-Rad）、電子天平（購自 Sartorius）、渦旋混合器（購自Scientific Industries）、RT-6100 酶標(biāo)儀（購自雷杜）、制冰機(jī)（購自雪科）、3k超濾管（購自 Millipore）、組織研磨儀（購自上海凈信）、超聲波細(xì)胞破碎儀（購自寧波新芝）。樣本收集：采取以上納入患者晨起空腹外周靜脈血5 mL，將采取標(biāo)本放入（EDTA）乙二胺四乙酸二鈉的抗凝管中，4,000 r/min離心10 min ，取血清儲(chǔ)存于-80 °C冰箱備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血清高豐度蛋白去除：將兩組清樣本混樣后使用ProteoMiner蛋白質(zhì)濃縮試劑盒去除高豐度蛋白，改善蛋白質(zhì)檢測(cè)的分辨率并對(duì)試驗(yàn)樣品的制備進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.2 總蛋白提取 取出樣品低溫研磨成粉于液氮預(yù)冷離心管中，加裂解液后冰水浴超聲5 min充分裂解。離心后取上清液加入二硫蘇糖醇 56oC反應(yīng)1 h，于碘乙酰胺室溫避光反應(yīng)1 h。加入4倍體積的丙酮于-20oC條件下沉淀至少2 h，于4oC、12,000 r/min離心15 min后收集沉淀。加入1 mL -20oC預(yù)冷丙酮重懸并清洗沉淀，同等條件下再次離心收集沉淀，風(fēng)干加入適量蛋白溶解液溶解蛋白沉淀。

1.3.3 蛋白質(zhì)檢 使用Bradford蛋白定量試劑盒，按說明配制濃度梯度為0 μg/μL-0.5 μg/μL BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。取不同濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液及不同稀釋倍數(shù)的待測(cè)樣品加入96孔板中，補(bǔ)足體積至20 μL，每梯度重復(fù)3次。加入180 μL G250染色液，室溫放置 5 min，測(cè)定595 nm吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算待測(cè)樣品的蛋白濃度。各取20 μg蛋白待測(cè)樣品進(jìn)行12%SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠電泳條件為80 V、20 min，分離膠電泳條件為120 V、90 min。電泳結(jié)束后行考馬斯亮藍(lán)R-250染色，脫色至條帶清晰。

1.3.4 TMT 標(biāo)記 各取120 μg蛋白樣品，加蛋白溶解液補(bǔ)足至100 μL，加入3 μL濃度為1 μg/μL胰酶和500 μL TEAB緩沖液，混合勻后至37oC酶切過夜。加入等體積的1%甲酸，混勻于室溫、離心取上清通過C18除鹽柱，使用1 mL清洗液連續(xù)清洗3次后加入0.4 mL洗脫液洗脫2次，洗脫樣合并凍干。加入100 μL TEAB緩沖液復(fù)溶，加入41 μL TMT標(biāo)記試劑，室溫下顛倒混勻反應(yīng)2 h。終止反應(yīng)后取等體積標(biāo)記的樣品混合，除鹽凍干。

1.3.5 餾分分離 配制流動(dòng)相A液和B液。使用1 mL A液溶解標(biāo)記混合樣品粉末，室溫下12,000 r/min離心10 min，取1 mL上清進(jìn)樣。使用L-3000HPLC系統(tǒng)，色譜柱為Waters BEH C18，柱溫設(shè)為50oC。每分鐘收集1管合并為10個(gè)餾分，凍干后各加入 0.1%甲酸溶解。

1.3.6 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián) 使用EASY-nLCTM1200納升級(jí)UHPLC系統(tǒng)液相色譜洗脫。使用Q ExactiveTMHF-X質(zhì)譜儀，Nanospray FlexTM（ESI）離子源，設(shè)定離子噴霧電壓為2.3 kV，離子傳輸管溫度為320 °C ，質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴型采集模式，質(zhì)譜全掃描范圍為350 m/z-1,500 m/z，一級(jí)質(zhì)譜分辨率設(shè)為60,000（200 m/z），C-trap 最大容量為3×106，C-trap最大注入時(shí)間為20 ms；選取全掃描中離子強(qiáng)度TOP 40的母離子使用高能碰撞裂解（HCD）方法碎裂，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)，二級(jí)質(zhì)譜分辨率設(shè)為 15,000（200 m/z），C-trap最大容量為1×105，C-trap最大注入時(shí)間為45 ms，肽段碎裂碰撞能量設(shè)為32%，閾強(qiáng)度設(shè)為8.3×103，動(dòng)態(tài)排阻范圍設(shè)為20 s，生成質(zhì)譜檢測(cè)原始數(shù)據(jù)（.raw）。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

1.4.1 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析 質(zhì)譜下機(jī)數(shù)據(jù)格式為*raw，存放質(zhì)譜數(shù)據(jù)完整的掃描信息，下機(jī)后的raw文件直接導(dǎo)入到Proteome Discoverer 2.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，譜肽、蛋白定量,本次使用數(shù)據(jù)庫：homo_sapiens_uniprot_2019.01.18.fasta（169389 sequences）。搜庫參數(shù)為：使用賽默飛超高分辨質(zhì)譜儀，標(biāo)記量化，酶切類型為胰蛋白酶，最大允許2個(gè)酶漏切位點(diǎn)，前體離子搜庫時(shí)質(zhì)量偏差容忍范圍10 ppm，碎片離子搜庫時(shí)質(zhì)量偏差容忍范圍0.02 Da，特定的可變修飾類型：氧化+15.995 Da（M）、TMT 10plex/+229.163 Da（K），N末端的修飾類型：乙酰化+42.011 Da、TMT 10plex/+229.163 Da，固定修飾類型：脲甲基化+57.021 Da。為了提高分析結(jié)果質(zhì)量，降低假陽性率，可信度在99%以上的譜肽（peptide spectrum matches,PSMs）為可信PSMs，至少包含一個(gè)unique肽段（特有肽段）的蛋白為可信蛋白，保留可信的譜肽和蛋白，并做FDR驗(yàn)證，去除FDR大于1%的肽段和蛋白。

1.4.2 生物信息學(xué)分析 采用GO數(shù)據(jù)庫分析蛋白的細(xì)胞組分，分子功能及生物過程；基于KEGG數(shù)據(jù)庫PATHWAY部分分析蛋白質(zhì)參與的主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使用Interproscan軟件對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和功能注釋；利用StringDB蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定蛋白的互作分析。

1.4.3 蛋白質(zhì)鑒定、定量及質(zhì)控 使用Proteome Discoverer 2.2軟件對(duì)檢索結(jié)果過濾：保留可信度在99%以上的譜肽和蛋白，F(xiàn)DR時(shí)去除FDR大于1%的肽段和蛋白，鑒定出607種蛋白。搜庫完成后進(jìn)行肽段長度分布、母離子質(zhì)量容差分布、Unique肽段數(shù)分布、蛋白覆蓋度分布、蛋白分子量分布質(zhì)控，蛋白可信度及整體準(zhǔn)確性高。

1.4.4 血清差異蛋白篩選 對(duì)兩組蛋白質(zhì)進(jìn)行定量后，將每個(gè)蛋白在比較樣品對(duì)中的生物重復(fù)定量值的均值的比值作為差異倍數(shù)（fold change,FC）。為了判斷差異的顯著性，將每個(gè)蛋白在兩個(gè)比較對(duì)樣品中的相對(duì)定量值進(jìn)行t檢驗(yàn)，并計(jì)算相應(yīng)的P值，以此作為顯著性指標(biāo)。當(dāng)FC≥1.0同時(shí)P≤0.05時(shí)蛋白表現(xiàn)為表達(dá)量上調(diào)，當(dāng)FC≤1.00同時(shí)P≤0.05時(shí)蛋白表現(xiàn)為表達(dá)量下調(diào)。

2 結(jié)果

與EGFR-T790M基因突變相關(guān)差異性蛋白篩選：基于質(zhì)譜檢測(cè)得到的原始數(shù)據(jù)鑒定出共607種蛋白質(zhì)，篩選出共17種差異性蛋白,上調(diào)蛋白 6種，下調(diào)蛋白 11種，結(jié)果見表1。

2.1 差異蛋白GO富集結(jié)果及分析 將差異蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行GO富集分析，17種差異蛋白中參與分子功能（molecular function,MF）占40.74%，細(xì)胞組分（cellular component,CC）占7.41%，生物過程（biological process,BP）占51.85%。主要參與蛋白水解作用（proteolysis），細(xì)胞過程調(diào)節(jié)（regulation of cellular process），骨骼重塑過程（bone remodeling）等生物過程；構(gòu)成細(xì)胞外區(qū)域（extracellular region）的主要成分；主要參與作用于L-氨基酸肽段激活肽段活性（peptidase activity acting onL-amino acid peptides），硫醇氧化酶活動(dòng)（thioloxidase activity）等分子功能如圖1A。

2.2 差異蛋白KEGG富集結(jié)果及富集通路分析 KEGG顯著性富集分析差異蛋白中顯著性富集的路徑。能確定差異蛋白參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。KEGG路徑富集結(jié)果見圖1B，常見的功能條目是：瘧疾（malaria）、人類乳頭瘤病毒感染（human papillomavirus infection）、血小板激活（platelet activation）等。對(duì)所有差異分布蛋白的KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)了12個(gè)富集通路如：血纖維蛋白溶酶原、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等，途徑作圖顯示富集指數(shù)最高的是補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，表明該途徑中的關(guān)鍵因素可能是潛在的能預(yù)測(cè)EGFR-T790M耐藥突變生物標(biāo)志物，與該途徑相關(guān)潛在生物標(biāo)記物見表2。

2.3 差異性蛋白結(jié)構(gòu)域富集分析結(jié)果 對(duì)差異性蛋白結(jié)構(gòu)域富集進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)具有蛋白酶抑制劑羧肽酶前肽（proteinase inhibitor,carboxypeptidase propeptide）、細(xì)胞外基質(zhì)-1（extracellular matrix 1）、磷蛋白質(zhì)分泌-24（secreted phosphoprotein 24）等結(jié)構(gòu)域的差異蛋白可能與肺腺癌患者發(fā)生EGFR-T790M耐藥基因突變相關(guān)。差異性蛋白結(jié)構(gòu)域富集柱狀圖見圖1C。

表1 與EGFR-T790M突變相關(guān)表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的蛋白Tab 1 Proteins with up-regulated and down-regulated expression associated with EGFR-T790M mutation

表2 與補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)相關(guān)差異性蛋白Tab 2 Different proteins associated with complement and coagulation cascade reactions

3 討論

與其他不可逆EGFR-TKIs一樣，Osimertinib與ATP結(jié)合位點(diǎn)中的半胱氨酸-797殘基發(fā)生不可逆反應(yīng)，與T790M突變體的結(jié)合力是WTEGFR的100倍-200倍[1]，因此Osimertinib是肺癌精準(zhǔn)治療的延續(xù)。最新FLAURA研究數(shù)據(jù)結(jié)果顯示[3]：先前未經(jīng)治療的EGFR突變晚期NSCLC患者一線接受Osimertinib，中位總生存期為38.6個(gè)月，而一線使用一代EGFR-TKI患者中位總生存期為31.8個(gè)月。因此Osimertinib被批準(zhǔn)一線用于具有EGFR敏感突變的晚期NSCLC患者。但因?yàn)獒t(yī)保問題，多數(shù)的患者仍選擇在一代EGFR-TKI出現(xiàn)耐藥并檢測(cè)出EGFR-T790M敏感突變后使用Osimertinib。在臨床實(shí)踐中患者因進(jìn)展病位于：腦、肝臟、骨等部位致重復(fù)活檢的風(fēng)險(xiǎn)增加，而與Osimertinib失之交臂。血清中的蛋白檢測(cè)可以呈現(xiàn)腫瘤在整個(gè)身體的情況而不是局限于某一特定位置。許多研究[9,10]表明，腫瘤細(xì)胞耐藥與某些蛋白高表達(dá)有關(guān)，蛋白質(zhì)組學(xué)分析可用于鑒定生物標(biāo)記物和評(píng)估生物網(wǎng)絡(luò)的強(qiáng)大工具。信號(hào)蛋白之間的相互聯(lián)系與惡性腫瘤治療至關(guān)重要。本研究采用蛋白組學(xué)技術(shù)篩選出與EGFR-T790M基因突變相關(guān)的差異性蛋白：其中上調(diào)蛋白6種，下調(diào)蛋白11種，參與26種分子功能，7種細(xì)胞組分，26種生物過程。所參與通路中富集指數(shù)最高的是補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，該通路中上調(diào)的蛋白有：F2RM37（凝血因子IX）、Q96IY4（羧肽酶B2），下調(diào)的蛋白有：P00747 （纖維蛋白原）、P00742（凝血因子X）、Q7Z664（未描述）和B7Z1F8（未描述）。

圖1 差異蛋白相關(guān)富集圖表。A：差異蛋白GO功能富集結(jié)果；B：差異蛋白KEGG富集氣泡圖；C：差異性蛋白結(jié)構(gòu)域富集柱狀圖。Fig 1 Differential protein-related enrichment diagram.A:GO function annotation analysis of differential protein; B:KEGG enrichment scatter plot of differential protein; C:Histogram of enrichment of different protein domains.

羧肽酶B2：是金屬羧肽酶家族的成員，羧肽酶B2本身可以通過介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境干擾腫瘤生長。有研究[11-14]表明，羧肽酶B2不僅在凝血途徑中扮演重要角色，其水平顯著增加乳腺癌和肺癌，胃癌和多發(fā)性骨髓瘤等的血栓發(fā)生，在乳腺癌組織、卵巢癌和肝癌細(xì)胞系中也較正常組織高表達(dá)，羧肽酶B2下調(diào)可以抑制腫瘤的侵襲和遷移。本研究中因此羧肽酶B2屬于上調(diào)蛋白，有潛力成為預(yù)測(cè)EGFR-T790M耐藥基因突變的生物標(biāo)志物。

F2RM37（凝血因子IX）是維生素K依賴性凝血因子。凝血因子IX通過FXII觸發(fā)并激活從而參與內(nèi)源性凝血途徑，目前在乙型血液病中被廣泛研究，缺乏凝血因子IX乙型血液病病患者需終身注射FIX制劑[15]，目前尚無研究關(guān)于凝血因子IX在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。

凝血因子X是凝血激活的重要步驟之一，可以激活內(nèi)皮蛋白C受體和蛋白酶激活受體1，凝血因子X及其激活物在癌癥的生長和傳播中起著重要的作用。內(nèi)皮蛋白C受體可在結(jié)直腸癌、肺癌、惡性胸膜間皮瘤、乳腺癌、卵巢癌、 胃癌等腫瘤組織中表達(dá)增高，凝血因子X激活在胃癌進(jìn)展中也起了一定的作用[16,17]。另一項(xiàng)研究[18]對(duì)21例子宮內(nèi)膜癌標(biāo)本進(jìn)行蛋白Z、蛋白Z依賴性蛋白酶抑制劑和凝血因子X進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)正常子宮內(nèi)膜組織均未表達(dá)以上3種因子，而在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中可觀察到中到強(qiáng)度表達(dá)。凝血因子X及其激活產(chǎn)物在包括肺癌在內(nèi)各類惡性腫瘤生長及轉(zhuǎn)移中起著一定的作用，極有潛力成為預(yù)測(cè)EGFR-T790M耐藥基因突變的生物標(biāo)志物。

P00747（纖溶酶原，Plasminogen，PLG），纖溶酶原是纖溶酶的無活性前體，通過組織型纖溶酶原激活物、尿激酶纖溶酶原激活劑激活成為纖溶酶。既往有研究同樣通過蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，纖溶酶原與卵巢惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，血清中及組織中的纖溶酶原過表達(dá)均有潛力成為檢測(cè)卵巢癌預(yù)后良好的生物標(biāo)志物[5,19,20]。此外Serafin等[21]也發(fā)現(xiàn)凝血途徑中的纖溶酶原激活物抑制劑-1尿纖溶酶原激活物在健康患者的血漿的平均水平為前列腺癌患者水平的8倍，可見凝血級(jí)聯(lián)途徑在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中起著及其重要的作用。

綜上，本研究通過同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量標(biāo)記結(jié)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜定量蛋白組學(xué)技術(shù)共篩選出17種差異性蛋白參與各種生物過程、細(xì)胞組分、種分子功能，其中補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)與EGFR-T790M耐藥突變密切相關(guān)，而該途徑中的差異蛋白：羧肽酶B2、凝血因子IX升高，凝血因子X、纖溶酶原降低均有可能成為EGFR-T790M耐藥突變相關(guān)生物標(biāo)志物，可為無法二次活檢或體液檢測(cè)假陰性的患者做補(bǔ)充，避免部分患者因以上原因錯(cuò)失第三代EGFR-TKI而致疾病持續(xù)進(jìn)展。另外本研究對(duì)血清中所檢測(cè)到的標(biāo)志物進(jìn)行初步篩選，樣本量較少，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量在活檢組織標(biāo)本中進(jìn)一步證實(shí)。

Author contributions

Chen LJ,Yu TT,and Shan L conceived and designed the study.Chen LJ,Yu TT,and Shan L performed the experiments.Chen LJ,Yu TT,and Shan L analyzed the data.Chen LJ,Yu TT,and Shan L contributed analysis tools.Chen LJ,Yu TT,and Shan L provided critical inputs on design,analysis,and interpretation of the study.All the authors had access to the data.All authors read and approved the final manuscript as submitted.