壬二酸凝膠的制備與質(zhì)量控制

劉 丹 許 靜 李志平 何 皎 宮燦儀 韋 甫 夏筆軍

南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院，廣東廣州 510095

壬二酸為9碳直鏈二元酸，別名杜鵑花酸。壬二酸為無(wú)色至淡黃色晶體或粉末，熔點(diǎn)98～103℃，微溶于冷水，溶于熱水、乙醚，易溶于乙醇。壬二酸能直接抑制黑素細(xì)胞、抑制和殺滅細(xì)菌，具有抗炎、抑制細(xì)胞增殖等藥理作用[1-2]。目前，壬二酸凝膠在治療痤瘡、黃褐斑、酒糟鼻、色素過(guò)度沉著等方面得到了廣泛應(yīng)用，該藥安全性好，局部應(yīng)用未見(jiàn)明顯不良反應(yīng)[3-4]，但起效劑量需大于10%（g/g）。由于壬二酸在水中的溶解度低，熔點(diǎn)高以及起效劑量大，易變色，使其應(yīng)用受到很大限制。2003年國(guó)內(nèi)藥廠中康恩貝生產(chǎn)的20%壬二酸乳膏上市，但目前批準(zhǔn)文號(hào)尚未轉(zhuǎn)正，長(zhǎng)期斷貨。目前，壬二酸臨床上使用的劑型有乳膏、霜、軟膏[5-9]。因壬二酸制劑的處方設(shè)計(jì)有一定難度，主要是高濃度壬二酸導(dǎo)致沙礫感或易引起破乳。在已報(bào)道的制劑中，壬二酸為不能完全溶解的細(xì)粉分散在基質(zhì)中，這降低了壬二酸的生物利用度[10]。本研究發(fā)現(xiàn)加入非離子型增溶劑聚氧乙烯蓖麻油EL可改善壬二酸的溶解度，提高其在水中的溶解性。本研究研發(fā)了新型15%壬二酸凝膠外用制劑，壬二酸凝膠具有清爽、滲透性好、顯效快、作用持久等優(yōu)點(diǎn)。該凝膠劑無(wú)沙礫感，無(wú)分層和破乳，質(zhì)量穩(wěn)定可控，安全、有效。本研究探討了一種加VIPER柱前管路高效液相色譜法直接測(cè)定壬二酸含量的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

紫外分光光度儀（UV-2450，日本島津），高效液相色譜儀（LC-20A，日本島津），C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm，Aquasil，Thermo），VIPER柱前管路（Thermo），十萬(wàn)分之一電子天平（MS-105，梅特勒），光學(xué)顯微鏡（CX31，OLYMPUS），集菌儀（HTY-601型集菌儀，浙江泰林生物技術(shù)有限公司）。

1.2 試藥

壬二酸凝膠（15%，批號(hào)：20190320、20190324、20190326，南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病制劑中心配制），壬二酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，101067-200901）；超純水，甲醇（Merck，色譜純），其余試劑均為分析純。

1.3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：181221），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：190115），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)：181119），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號(hào)：190126），甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：180828），溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：180820），以上培養(yǎng)基均購(gòu)于北京陸橋技術(shù)股份有限公司，經(jīng)適用性檢查均符合規(guī)定。

1.4 菌株

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]，金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]，白色念珠菌（candida albicans）[CMCC（F）98001]，黑曲霉（aspergillus niger）[CMCC（F）98003]，枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis）（ATCC6633）均購(gòu)于廣東省藥品檢驗(yàn)所。

2 處方與制備

2.1 處方

壬二酸150g，卡波姆940 12g，三乙醇胺12g，丙二醇120g，乙醇50g，聚氧乙烯蓖麻油EL 150g，EDTA-2Na 0.3g，純化水465.7g，共制1000g。

2.2 制備

2.2.1 增溶劑選擇的選擇 比較增溶劑吐溫80和聚氧乙烯蓖麻油EL的增溶效果，聚氧乙烯蓖麻油EL增溶效果優(yōu)于吐溫80。所以，確定增溶劑為聚氧乙烯蓖麻油EL?？疾焯幏街芯垩跻蚁┍吐橛虴L 10%、12%、15%三種含量的增溶作用，15%的聚氧乙烯蓖麻油EL能使壬二酸在水中完全溶解。所以，確定增溶劑聚氧乙烯蓖麻油EL的濃度為15%。

2.2.2 制備方法 卡波姆940用50℃水分散浸泡24h得A液；取壬二酸加丙二醇潤(rùn)濕攪勻，加聚氧乙烯蓖麻油EL、EDTA-2Na、純化水，水浴加熱至65℃，加入乙醇得B液；將B液加入A液中，邊加邊攪拌，加三乙醇胺中和調(diào)節(jié)pH=6，攪拌至冷凝，即得。

3 質(zhì)量控制研究

3.1 鑒別

液相色譜法，結(jié)果顯示，供試品溶液與對(duì)照品溶液主峰的保留時(shí)間相符，見(jiàn)圖1。

3.2 檢查

3.2.1 粒度 參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部粒度和粒度分布測(cè)定法（通則0982第一法）測(cè)定[12]，均不得檢出大于180μm的粒子。結(jié)果顯示，粒子粒度均小于150μm。

3.2.2 微生物限度方法學(xué)驗(yàn)證與檢查

3.2.2.1 微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證 壬二酸凝膠微生物限度檢查驗(yàn)證方法參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015版和本實(shí)驗(yàn)室的適用性實(shí)驗(yàn)方法[11-12]，各菌株回收率結(jié)果見(jiàn)表1，控制菌驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 各菌株不同驗(yàn)證方法的回收率

由表1可見(jiàn)，取1∶20的供試液，用平皿法時(shí)，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3個(gè)菌株3次試驗(yàn)的回收率均在0.5～2.0范圍內(nèi)，因此本品的需氧菌總數(shù)可用平皿法檢查（即1∶20的供試液，1mL/皿）。取1∶10的供試液，用平皿法時(shí)，白色念珠菌和黑曲霉2個(gè)菌株3次的回收率均在0.5～2.0，表明本品的霉菌和酵母菌總數(shù)可用平皿法檢查（即1∶10供試液，1mL/皿）。

表2 控制菌驗(yàn)證結(jié)果

由表2可見(jiàn)，本品可用常規(guī)法檢查金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。

3.2.2.2 微生物限度檢查 供試液制備：取本品10g，先加少量5%（g/mL）聚山梨酯80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，置45℃水浴使溶散，再加45℃含5%（g/mL）聚山梨酯80 pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，邊加邊搖，靜置1min，取下層液作為1∶10的供試液。取1∶10的供試液適量，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋制成1∶20的供試液。

需氧菌總數(shù)取1∶20的供試液1mL，按平皿法檢查。

霉菌和酵母菌總數(shù)取1∶10的供試液1mL，按平皿法檢查。

金黃色葡萄球、菌銅綠假單胞菌取1∶10的供試液10mL，分別接種至不少于100mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，按控制菌檢查法試驗(yàn)。

3.2.2.3 微生物限度檢查結(jié)果 三批壬二酸凝膠（批號(hào)：20190320、20190324、20190326）需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)為0，未檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌。

3.3 壬二酸含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證與結(jié)果

3.3.1 色譜條件 色譜柱：Thermo AQUASIL C18柱（250mm×4.6mm，5μm），以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；柱溫：40℃。流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（40∶60∶0.1），流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；進(jìn)樣量：20μL。

3.3.2 溶液的制備

3.3.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取壬二酸對(duì)照品，精密稱(chēng)定，加甲醇適量，超聲使溶解，制成0.6mL/min的壬二酸對(duì)照品溶液。

3.3.2.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)定壬二酸凝膠0.2g，加甲醇適量置50mL容量瓶中，超聲使溶解，用甲醇定容，搖勻，冰浴1h，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

3.3.2.3 陰性對(duì)照液的制備 精密稱(chēng)定壬二酸凝膠的陰性樣品0.2g，同“3.3.2.2”項(xiàng)方法制備陰性對(duì)照溶液。

3.3.3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.3.3.1 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液、對(duì)照品溶液及陰性對(duì)照溶液按“3.3.1”項(xiàng)色譜項(xiàng)條件項(xiàng)分別測(cè)定，記錄色譜圖，觀察主要成分色譜峰的保留時(shí)間是否一致，各成分是否相互干擾。結(jié)果表明陰性樣品無(wú)干擾，理論板數(shù)為10 885，分離度18.2，拖尾因子1.02，方法的專(zhuān)屬性較好，見(jiàn)圖1。

圖1 三種溶液的HPLC圖

3.3.3.2 回收率實(shí)驗(yàn) 取壬二酸對(duì)照品0.3g，精密稱(chēng)定，至50mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解制成濃度為6mL/min的對(duì)照品溶液，作為壬二酸對(duì)照品母液。取空白基質(zhì)0.20g，精密稱(chēng)定，平行9份，分別精密加入對(duì)照品母液4、5、6mL，置50mL量瓶中，每個(gè)濃度各配制3份，同“3.3.2.2”項(xiàng)供試品溶液的制備方法制備，即得相當(dāng)于標(biāo)示量80%、100%、120%的樣品，計(jì)算回收率，見(jiàn)表3。

結(jié)果顯示，壬二酸平均回收率為99.4%，RSD為0.55%，說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確度較好，符合定量測(cè)定要求。

3.3.3.3 定量限 精密稱(chēng)定壬二酸對(duì)照品0.02g，置20mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容（濃度為1.000mL/min）。取上述溶液加甲醇逐級(jí)稀釋?zhuān)瑴y(cè)得壬二酸的定量限為0.525μg/mL（信噪比為10∶1）。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

3.3.3.4 線性關(guān)系考察 取壬二酸對(duì)照品0.2g，精密稱(chēng)定，至20mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解成10.00mg/mL的對(duì)照品溶液，作為對(duì)照品母液。分別 精 密 量 取 對(duì) 照 品 母 液0.1、0.2、1.6、3.2、6.4mL至10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成0.100、0.200、1.600、3.200、6.400mg/mL壬 二 酸 對(duì) 照 品 溶液，按“3.3.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)Y，以濃度為橫坐標(biāo)X，進(jìn)行線性回歸，得線性方程：Y=556 068.6X-24 893.91，r=0.9999，壬二酸在0.100～6.400mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

3.3.3.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液20μL，注入液相色譜儀，連續(xù)測(cè)定6次，記錄壬二酸的峰面積，結(jié)果峰面積積分值的RSD為0.39%，表明精密度良好。

3.3.3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取壬二酸凝膠（批號(hào)：20180310）0.2g，精密稱(chēng)定，平行6份，按“3.3.2.2”供試品溶液制備項(xiàng)的方法制備，按照“3.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，以峰面積計(jì)算壬二酸的含量，結(jié)果含量的平均值為15.4%（g/g），RSD為0.56%，表明本含量測(cè)定方法重復(fù)性良好。

3.3.3.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按照“3.3.2”溶液制備項(xiàng)制備供試品溶液和對(duì)照品溶液，按照“3.3.1”項(xiàng)色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果RSD為0.56%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

3.3.3.8 樣品含量測(cè)定 取3批壬二酸凝膠（批號(hào)：20190320、20190324、20190326）各3份，每 批 平行測(cè)定3次，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算壬二酸的含量，結(jié)果3批樣品的含量分別為標(biāo)示量的99.3%（RSD=0.48%）、100.2%（RSD=0.35%）、100.8%（RSD=0.52%）。

4 穩(wěn)定性考察

4.1 離心試驗(yàn)[13]

取樣品適量，裝入離心管中，以4000r/min轉(zhuǎn)速離心30min，結(jié)果顯示壬二酸凝膠無(wú)破乳、無(wú)分層現(xiàn)象。

4.2 耐寒耐熱試驗(yàn)[13]

取樣品適量，分裝于包裝盒內(nèi)加蓋，分別置-15℃冰箱24h，置55℃干燥箱恒溫6h，結(jié)果顯示壬二酸凝膠無(wú)破乳、無(wú)分層現(xiàn)象。

4.3 加速試驗(yàn)

取3個(gè)批次樣品，在溫度為（30±2）℃，相對(duì)濕度為（65±5）%的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，放置6個(gè)月。于試驗(yàn)的第0、3、6個(gè)月末取樣一次，考察壬二酸凝膠的性狀、鑒別、檢查、含量，結(jié)果顯示樣品的各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

4.4 長(zhǎng)期試驗(yàn)

取3個(gè)批次樣品，在溫度為（25±2）℃，相對(duì)濕度為（60±10）%的條件下，放置12個(gè)月。于試驗(yàn)的第0、3、6、9、12個(gè)月末取樣一次，考察壬二酸凝膠的性狀、鑒別、檢查、含量，結(jié)果顯示樣品的各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

5 討論

由于壬二酸在水中的溶解度低，熔點(diǎn)高以及起效劑量大，易變色，使其在應(yīng)用時(shí)受到很大限制。增溶劑聚氧乙烯蓖麻油EL，穩(wěn)定性好，安全[14]。所以，選用聚氧乙烯蓖麻油EL作為增溶劑。考察并篩選出了溶解壬二酸的最佳溫度65℃。壬二酸凝膠制備方法可行，穩(wěn)定性良好。

壬二酸為直鏈二羧酸，臧亞茹[15]采用酸堿滴定法測(cè)定復(fù)方壬二酸乳膏中壬二酸的含量，有文獻(xiàn)報(bào)道[16-17]采用HPLC法檢測(cè)脂質(zhì)體中壬二酸雜質(zhì)，采用衍生化后HPLC法測(cè)定壬二酸的含量。本研究通過(guò)加VIPER柱前管路HPLC法直接測(cè)定壬二酸的含量，比較了不加柱前管路使用流動(dòng)相甲醇-水-0.01mol/mL乙酸銨，甲醇-水-0.1%磷酸，色譜峰均前延，峰形不對(duì)稱(chēng)，加VIPER柱前管路，峰型對(duì)稱(chēng)，分離度＞1.5，所以通過(guò)加VIPER柱前管路測(cè)定含量。進(jìn)一步比較不同流動(dòng)相的理論塔板數(shù)，甲醇-水-0.1%磷酸的理論塔板數(shù)高于甲醇-水-0.01mol/mL乙酸銨。因此，確定流動(dòng)相為甲醇-水-0.1%磷酸。

新劑型壬二酸凝膠質(zhì)量穩(wěn)定可控，制備和質(zhì)量控制方法可行，重復(fù)性好，為開(kāi)發(fā)壬二酸凝膠新制劑提供理論基礎(chǔ)。