四君子湯對脾虛模型大鼠肽轉(zhuǎn)運載體1轉(zhuǎn)運功能及其基因表達的影響*

杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007

肽轉(zhuǎn)運載體1（PepT1）主要表達于小腸刷狀緣膜上,是蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物小分子肽（二肽、三肽）在小腸吸收的主要轉(zhuǎn)運體。因此，PepT1的表達和功能直接影響蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物的吸收水平[1-3]。PepT1的底物很多，以β-內(nèi)酰氨類抗生素頭孢羥氨芐（Cefadroxil）最為常用，PepT1對頭孢羥氨芐具有與二肽、三肽相同的底物特異性。即頭孢羥氨芐在腸道內(nèi)的吸收機理與二肽一樣，均是通過 PepT1轉(zhuǎn)運，而且頭孢羥氨芐在腸道吸收后由于缺乏相應的降解酶而幾乎不被降解［4-5］，因此，許多關(guān)于PepT1的研究都以頭孢羥氨芐為底物［6-7］。

四君子湯由人參、炙甘草、茯苓和白術(shù)4味藥物組成，其主要功用是健脾益氣，常用于治療脾胃虛弱、運化無力等癥，為治療脾虛證的基礎方。本研究以頭孢羥氨芐為PepT1的底物，研究了脾虛模型大鼠服用四君子湯對PEPT1的表達和功能的影響。通過測定四君子湯對PepT1轉(zhuǎn)運功能及蛋白、mRNA表達、底物的血藥濃度的影響，以期為科學指導臨床中西藥合理聯(lián)藥提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品：黨參、白術(shù)、茯苓、甘草購自浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片廠。以上四味藥材按3∶3∶3∶2的比例混合后，加10倍量水煎煮2次，每次1小時，合并濾液后濃縮，冷藏過夜，離心，取上清液稀釋至2g藥材/ml，作為四君子湯藥液。

1.2 儀器與試劑：安捷倫高效液相色譜儀（Agilent 1200）；臺式高速冷凍型微量離心機（D3024R，Dragon‐Lab）；熒光定量PCR儀（Stepone plus，ABI）；超微量分光光度計（NanoDrop2000，Thermo）；利血平（Reserpine,Sigma,Lot WXBC4865V）；PepT1抗體（ABACM，Ab203043）；頭孢羥氨芐標準品cefadroxil（中國食品藥品檢定研究院，130431-201203）；頭孢羥氨芐片(清遠華能制藥有限公司，20161016)。

2 方法

2.1 動物分組及給藥：將SD雄性大鼠50只（體重200g左右）隨機分為5組，每組10只，分別為正常對照組，模型組，高、中、低劑量治療組。正常對照組每日股四頭肌注射生理鹽水0.1ml/只，連續(xù)14天，并于當天灌服生理鹽水2ml/只，連續(xù)14天。模型組和三組治療組每日股四頭肌注射利血平注射液0.5ml/Kg，連續(xù)14天，建立脾虛模型。模型組在造模當天灌服生理鹽水2ml/只，連續(xù)14天。高中低劑量組在造模當天分別灌服四君子湯藥液2ml、1ml、0.5ml/100g，連續(xù)14天。第15天禁食后每組大鼠灌服頭孢羥氨芐200mg/Kg，于給藥后0.5、1、1.5、2、4h、6h、8h眼眶取血，肝素抗凝管制備血漿，-80℃保存?zhèn)溆?。處死大鼠，立即取十二指腸下15cm處小腸段5cm，DEPC處理水清洗3次后冰上刮取黏膜，放入凍存管中液氮保存，用于PepT1 mRNA檢測；在幽門下20cm處剪取小腸段2cm，冰生理鹽水清洗后中性甲醛固定20h，用于PepT1蛋白免疫組化檢測。

2.2 頭孢羥氨芐吸收的測定：分述如下。

2.2.1 色譜條件：色譜柱（Agilent XDB-C18 150mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇：水（含0.01M磷酸二氫鈉）＝13∶87（V∶V）；檢測波長：260nm；柱溫：35℃；流速：1ml·min-1；進樣量20μl。

2.2.2 樣品制備：精密量取血漿0.1ml，加入0.1ml 6%高氯酸溶液，震蕩1min，低溫離心5min（12000rpm），取上清液即為供試品溶液。

2.2.3 線性關(guān)系的考察：將一定量的頭孢羥氨芐標準品溶解于一定量的蒸餾水中，配成8種濃度的標準溶液。精密吸取空白血漿90μl，加入以上標準溶液10μl，按“2.2.2”的方法操作后進行樣品分析，設進樣濃度值為X，峰面積值為Y，用加權(quán)（W=1/C2）最小二乘法進行回歸運算，得線性回歸方程：Y＝0.1137X-4.0078，r＝0.9997，線性范圍0.6375-81.6μg?ml-1，最低檢出濃度為：0.6375μg?ml-1（以S/N≥3計）。

2.2.4 精密度：低、中、高按濃度樣品的日內(nèi)精密度RSD為1.35%、0.98%、1.09%，日間精密度RSD為1.79%、1.52%、1.45%，精密度達到分析要求。

2.2.5 重復性：取同一血漿樣品，按“2.2.2”項下操作，平行操作5次，得5份供試品溶液，在“2.2.1”條件下進行含量測定，RSD小于5%。

2.2.6 加樣回收率：精密量取已知濃度的血漿樣品90μl，共9份，每3份為一水平，分別精密加入頭孢羥氨芐標準溶液102、204、408μg?ml-110μl，按“2.2.2”項下操作，在“2.2.1”色譜條件下進行分析，平均回收率為94.75%，RSD為3.63%。

2.3 小腸黏膜PepT1表達的影響：采用免疫組織化學法，按照試劑盒說明書步驟進行免疫組化染色。顯示蘇木素染細胞核為藍色，DAB顯出的PEPT1陽性表達為棕黃色。每組內(nèi)每張切片隨機挑選至少3個200倍視野進行拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。應用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標準，對每張照片進行分析得出每張照片陽性的累積光密度值（IOD）以及組織的像素面積（AREA）。并求出平均光密度值（average optical,AO值），AO=IOD/AREA，AO值越大表明陽性表達水平越高。

2.4 小腸黏膜PepT1mRNA表達的檢測：應用熒光定量PCR法對小腸黏膜 PepT1 mRNA表達進行定量。取小腸黏膜用Trizol法提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄為CDNA，按照實時定量PCR試劑盒的說明書進行操作，檢測PepT1的mRNA表達水平，引物序列見表1。擴增程序為預變性，95℃，10min；循環(huán)（40次），95℃，15s→60℃，60s；熔解曲線，60℃→95℃，每15s升溫0.3℃。以GAPDH為內(nèi)參，實驗重復3次，采用2一△△CT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

表1 PCR引物

3 結(jié)果

3.1 血漿頭孢羥氨芐濃度經(jīng)時變化：各組大鼠灌服頭孢羥氨芐30min后，血中即可檢測到較高濃度的頭孢羥氨芐，達峰時間在1h左右。0～4h，與正常組相比，模型組血藥濃度明顯增加（P＜0.01）；用藥后，高劑量組和中劑量組血藥濃度與模型組相比顯著下降（P＜0.01），與正常組接近；低劑量組無明顯變化。見圖1。

圖1 各組平均血藥濃度-時間曲線

3.2 四君子湯對小腸黏膜PepT1表達的影響：模型組大鼠PepT1蛋白表達與正常組比較，呈明顯上調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，四君子湯高劑量組和中劑量組蛋白表達顯著下降(P＜0.01),其中高劑量組與正常組接近（P＞0.05）；低劑量組與模型組相比，蛋白表達也下調(diào)，但無顯著性差異（P＞0.05）。見表2、圖2。

表2 四君子湯對大鼠小腸上皮PepT1表達的影響（±s，n=10）

表2 四君子湯對大鼠小腸上皮PepT1表達的影響（±s，n=10）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

AO值0.004030±0.001031 0.1165±0.002442△△0.004827±0.001083**0.006381±0.0009205**0.009401±0.002531組別正常組模型組高劑量組中劑量組低劑量組

圖2 免疫組化方法測定小腸黏膜PepT1表達

3.3 四君子湯對大鼠小腸黏膜PepT1 mRNA表達的影響：應用熒光定量PCR法對小腸黏膜 PepT1 mRNA表達進行定量，模型組大鼠PepT1 mRNA表達量相對于正常組略有升高，但無顯著性差異（P＞0.05）；用藥之后，四君子湯高、中、低劑量組大鼠PepT1 mRNA表達量相對于模型組略有升高，但無顯著性差異（P＞0.05），相對于正常組都有升高，高、中劑量組有顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05）。

圖3 PCR法測定小腸黏膜PepT1 mRNA結(jié)果

4 討論

脾虛狀態(tài)下，脾主運化功能障礙，小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運功能降低，但是本實驗中脾陽虛模型組大鼠頭孢羥氨芐的血藥濃度與正常組比較顯著性升高，模型組大鼠小腸黏膜上皮細胞刷狀膜囊緣上PepT1陽性表達比正常組顯著增加。有研究認為，在小腸吸收功能出現(xiàn)障礙或整體蛋白質(zhì)營養(yǎng)吸收低下的情況下，二肽轉(zhuǎn)運比氨基酸轉(zhuǎn)運更有效[8]。實驗結(jié)果與文獻報道一致，可以理解為在脾虛狀態(tài)下，小腸對二肽吸收轉(zhuǎn)運的增加是一種病理狀態(tài)下的應激反應，是對小腸氨基酸轉(zhuǎn)運不足而造成的營養(yǎng)不良的一種代償狀態(tài)。與模型組比較治療后高劑量組和中劑量組蛋白表達顯著下降(P＜0.01)，對二肽的吸收減少，因此頭孢羥氨芐的血藥濃度下降，高劑量組與正常組接近（P＞0.05），而低劑量組相對模型組無明顯變化，說明在本實驗中，四君子湯可使脾虛大鼠異常升高的Pep T1蛋白表達趨于正常，且呈劑量依賴性。

本試驗中模型組PepT1陽性表達增加了，但PepT1的mRNA水平并沒有顯著升高。有報道小腸黏膜上皮細胞刷狀膜囊緣上PepT1蛋白才是具有轉(zhuǎn)運活性的功能蛋白，在細胞池內(nèi)還存在不具有轉(zhuǎn)運活性的PepT1蛋白[9]。有研究發(fā)現(xiàn)用TNF-α，IFN-γ等炎癥因子處理后PepT1表達增加，但是PepT1 mRNA并沒有增加，提示細胞膜上PepT1蛋白表達的增加是轉(zhuǎn)錄后變化[10]。通過本實驗，初步可以得出，用藥后小腸黏膜上皮細胞刷狀膜囊緣上PepT1蛋白表達的增加，只是促進了轉(zhuǎn)運載體從細胞池到細胞膜上的移位增加，而不是從頭合成增加。