P16及FHIT基因異常表達在非小細胞肺癌發(fā)病機制中的研究

佘天宇，佘真真，徐海濤，劉 帥，賈 騰，張慶廣，李文晶

(1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 a.胸外科，b.腫瘤科，山東 濱州 256600；2.山東省無棣縣人民醫(yī)院普外科，山東 濱州 251900)

非小細胞肺癌(NSCLC)約占全部肺癌的85%，發(fā)病率約為45.39/10萬[1]，我國NSCLC每年新發(fā)病例約73.3萬，死亡病例約59.1萬[2]。原癌基因和抑癌基因參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展，多個基因異常表達，長期積累下引起正常細胞增殖調(diào)控失常，細胞惡性增殖導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[3，4]。NSCLC 基因異常表達的發(fā)病機制為臨床研究熱點，P16及FHIT基因為NSCLC主要的抑癌基因[5]，當(dāng)發(fā)生基因變異如雜合性缺失、DNA甲基化等情況，可能造成抑癌基因失活[6]。本研究分析P16及FHIT基因雜合性缺失、DNA甲基化與P16及FHIT蛋白表達缺失的關(guān)聯(lián)，為NSCLC發(fā)病機制研究提供參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料2018年10月至2019年12月我院肺癌切除術(shù)NSCLC患者65例，均符合NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，術(shù)后病理確診為NSCLC。收集NSCLC腫瘤組織標(biāo)本和距離癌灶組織邊緣5 cm以外的正常肺組織標(biāo)本。男41例，女24例，年齡47～75歲[(61.39±7.22)歲]；臨床分期：Ⅰ期10例，Ⅱa期17例，Ⅱb期25例，Ⅲa期13例；病理分型：鱗癌37例，腺癌28例；有吸煙史45例。

1.2 儀器設(shè)備Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶(Takara公司)，兔抗人P16單克隆抗體、兔抗人FHIT單克隆抗體(三生制藥集團)，Trizol試劑、免疫組化試劑盒(美國賽默飛世爾科技公司)。變性聚丙烯酰胺凝膠、硝酸銀溶液等由實驗室自行配置。主要儀器：ABI QuantStudio 7實時熒光定量PCR儀(美國賽默飛世爾科技公司)，“六一牌”電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 取10 mg組織標(biāo)本研磨、勻漿，加入PBS溶液200 μl，離心6 min，棄上清，再加入Trizol試劑2 ml，在室溫下培育5 min。向EP管中加入0.2 ml氯仿/1 ml Trizol，室溫培育3 min。離心15 min吸取上層水相，加入0.5 ml異丙醇/1 ml Trizol再離心15 min。再棄上清，沉淀加入70%乙醇清洗，離心10 min。棄上清，取管底沉淀物DNA晾干10 min，干燥DNA沉淀物待檢。P16及FHIT基因的PCR引物序列、反應(yīng)體系及條件見表1。擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上觀察。

表1 PCR反應(yīng)條件

1.3.2基因雜合性缺失檢測 采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳-硝酸銀染色法檢測。方法：取PCR擴增產(chǎn)物8 μl，加入等體積雙鏈DNA變性緩沖液，97 ℃變性10 min，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。硝酸銀染色法：將變性聚丙烯酞胺凝膠在雙蒸水中漂洗一次，0.1%硝酸銀溶液染色30 min，雙蒸水中漂洗3次，加入3%碳酸鈉溶液(含0.014%乙醇)顯色，當(dāng)DNA帶較清晰時，倒掉顯色液，加入7.5%冰乙酸終止。雜合性缺失判定標(biāo)準(zhǔn)：等位基因擴增信號缺失為(+)。

1.3.3DNA甲基化檢測 采用限制性內(nèi)切酶法處理。方法：取組織標(biāo)本中提取的沉淀物DNA 3 μl，加入甲基化敏感限制性內(nèi)切酶1 μl，25 ℃水浴過夜(未酶切處理的DNA為對照)。再進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。DNA甲基化判定標(biāo)準(zhǔn)[8]：經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理后的DNA仍能擴增出完整的DNA片段為(+)。

1.3.4免疫組化法檢測蛋白表達 組織標(biāo)本常規(guī)石蠟切片4 μm制片，放入80 ℃烘箱內(nèi)烤片30 min。二甲苯、無水乙醇透明、脫水。再使用蒸餾水洗，封閉液室溫孵育30 min，PBS緩沖液沖洗3次。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法(SP法)。沖洗后，滴加10%非免疫羊血清封閉液，孵育30 min。加入兔抗人P16或FHIT單克隆抗體(一抗)過夜，以PBS緩沖液代替一抗為陰性對照，再加入標(biāo)記有辣根過氧化物酶(HRP)的羊抗兔抗體(二抗)過夜。滴加DAB顯色溶液，顯微鏡下觀察特異性顯色。免疫組化結(jié)果判定采取Bresalier半定量法，判定標(biāo)準(zhǔn)[9]：①陽性細胞評分：0分為陽性細胞<10%，1分為10%～25%陽性細胞，2分為26%～50%陽性細胞，3分為51%～75%陽性細胞，4分為≥76%陽性細胞；②顯色深淺評分：0分為不顯色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。兩項評分相加，≥3分為蛋白表達陽性(+)，<3分為蛋白表達缺失(-)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；關(guān)聯(lián)性分析采用列聯(lián)表χ2檢驗，并計算列聯(lián)系數(shù)c；以Logistic回歸分析篩選獨立影響因素。檢驗水準(zhǔn)ɑ=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組P16基因雜合性缺失、甲基化發(fā)生率以及P16蛋白表達情況比較NSCLC組織P16基因雜合性缺失發(fā)生率為58.46%，甲基化發(fā)生率為49.23%，蛋白表達缺失率為67.69%。正常肺組織未見P16基因雜合性缺失、甲基化、蛋白表達缺失。兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組P16基因雜合性缺失、甲基化發(fā)生率以及P16蛋白表達情況比較 [n(%)]

2.2 兩組FHIT基因雜合性缺失、甲基化發(fā)生率以及FHIT蛋白表達情況比較NSCLC組織FHIT基因雜合性缺失發(fā)生率為70.77%，甲基化發(fā)生率為66.15%，蛋白表達缺失率為72.31%。正常肺組織未見FHIT基因雜合性缺失、甲基化、蛋白表達缺失。兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組FHIT基因雜合性缺失、甲基化發(fā)生率以及FHIT蛋白表達情況比較 [n(%)]

2.3 NSCLC組織P16基因雜合性缺失、甲基化與P16蛋白表達缺失的關(guān)聯(lián)性分析P16基因雜合性缺失與P16蛋白表達缺失具有關(guān)聯(lián)(χ2=15.340，列聯(lián)系數(shù)c=0.437，P<0.001)，見表4。P16基因甲基化與P16蛋白表達缺失具有關(guān)聯(lián)(χ2=30.083，列聯(lián)系數(shù)c=0.562，P<0.001)，見表5。

表4 NSCLC組織P16基因雜合性缺失與P16蛋白表達缺失的關(guān)聯(lián)性分析

表5 NSCLC組織P16基因甲基化與P16蛋白表達缺失的關(guān)聯(lián)性分析

2.4 NSCLC組織FHIT基因雜合性缺失、甲基化與FHIT蛋白表達缺失的關(guān)聯(lián)性分析FHIT基因雜合性缺失與FHIT蛋白表達缺失具有關(guān)聯(lián)(χ2=16.865，列聯(lián)系數(shù)c=0.484，P<0.001)，見表6。FHIT基因甲基化與FHIT蛋白表達缺失具有關(guān)聯(lián)(χ2=40.827，列聯(lián)系數(shù)c=0.621，P<0.001)，見表7。

表6 NSCLC組織FHIT基因雜合性缺失與FHIT蛋白表達缺失的關(guān)聯(lián)性分析

表7 NSCLC組織FHIT基因甲基化與FHIT蛋白表達缺失的關(guān)聯(lián)性分析

2.5 P16、FHIT蛋白表達缺失與臨床特征的影響因素分析臨床分期是P16蛋白表達缺失的獨立影響因素，性別、吸煙史是FHIT蛋白表達缺失的獨立影響因素(P<0.05)，見表8，表9。

表8 P16蛋白表達缺失與臨床特征的影響因素分析

表9 FHIT蛋白表達缺失與臨床特征的影響因素分析

3 討論

惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展受原癌基因與抑癌基因調(diào)控，P16及FHIT基因為NSCLC主要的抑癌基因，起負調(diào)節(jié)作用，與原癌基因相互制約，抑制肺上皮細胞異常增殖。P16基因位于人類染色體9p21，直接參與細胞周期的調(diào)控，負調(diào)節(jié)細胞增殖及分裂。大多數(shù)人類腫瘤細胞株純存在P16基因雜合性缺失、甲基化、堿基置換突變或缺失等多種基因變異現(xiàn)象，可能與NSCLC易感性相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，在NSCLC組織中，P16基因雜合性缺失發(fā)生率為58.46%，甲基化發(fā)生率為49.23%，蛋白表達缺失率為67.69%，而在正常肺組織中未見P16基因雜合性缺失、甲基化、蛋白表達缺失；而且P16基因雜合性缺失與P16蛋白表達缺失具有關(guān)聯(lián)。上述說明，NSCLC易發(fā)生P16基因雜合性缺失、甲基化，這與Wang等[10]、鐘云華等[11]研究報道一致。而且這種基因突變造成了P16基因失活，導(dǎo)致P16蛋白表達缺失，喪失了P16基因的抑癌功能，肺上皮細胞周期G1期(DNA合成前期)向S期(DNA合成期)加速轉(zhuǎn)變，G1期的DNA修復(fù)、RNA和核糖體準(zhǔn)備不完善，過早的進入到S期，導(dǎo)致細胞惡性增殖發(fā)展為NSCLC。本研究還發(fā)現(xiàn)，臨床分期是P16蛋白表達缺失的獨立影響因素，臨床分期高的患者P16蛋白表達缺失風(fēng)險是臨床分期低的患者的2.809倍，可以解釋為：P16基因突變與臨床分期升高存在相互效應(yīng)，P16基因突變越多，蛋白質(zhì)表達缺失也相應(yīng)增多，患者越易發(fā)生細胞惡性增殖，也使得NSCLC生物學(xué)行為趨向于惡性。黃芬芬等[12]研究也證實，P16基因突變與NSCLC腫瘤分期具有相關(guān)性。

FHIT基因位于人類染色體3p14.2，目前研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)肺癌患者存在FHIT基因突變及蛋白表達缺失。本研究結(jié)果顯示，在NSCLC組織中，F(xiàn)HIT基因雜合性缺失發(fā)生率為70.77%，甲基化發(fā)生率為66.15%，蛋白表達缺失率為72.31%，而正常肺組織未見FHIT基因雜合性缺失、甲基化、蛋白表達缺失；而且FHIT基因雜合性缺失與FHIT蛋白表達缺失具有關(guān)聯(lián)。上述說明，NSCLC易發(fā)生FHIT基因雜合性缺失、甲基化，而且這種基因突變造成了FHIT基因失活，導(dǎo)致FHIT蛋白表達缺失。Geng等[13]研究也表示，NSCLC易發(fā)生FHIT基因甲基化。劉瑩等[14]研究指出FHIT基因甲基化水平升高，NSCLC患病風(fēng)險增加2.927倍，這對NSCLC具有較高的診斷價值。FHIT基因的抑癌作用尚不明確，Lee等[15]研究指出可能與誘導(dǎo)癌細胞凋亡有關(guān)，F(xiàn)HIT蛋白是一種腫瘤抑制蛋白，通過14-3-3τ誘導(dǎo)NSCLC細胞自噬。本研究還發(fā)現(xiàn)，性別、吸煙史是FHIT蛋白表達缺失的獨立影響因素，男性、吸煙者的FHIT蛋白表達缺失風(fēng)險是女性、不吸煙者的2.442倍、4.433倍。FHIT基因與吸煙密切相關(guān)，F(xiàn)HIT基因可能是煙草致癌物誘發(fā)癌變的靶基因。肺癌男性發(fā)病率通常高于女性，F(xiàn)HIT蛋白表達缺失率也較高，可能是因為男性患者吸煙率較高。

綜上所述，P16及FHIT基因異常表達在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，發(fā)病機制可能與P16及FHIT基因的雜合性缺失和甲基化導(dǎo)致的P16及FHIT蛋白表達缺失有關(guān)。P16及FHIT蛋白表達缺失，造成抑癌基因?qū)毎ＩL負調(diào)節(jié)的作用失控，導(dǎo)致NSCLC發(fā)生。在臨床上，檢測P16及FHIT基因突變情況，或許有助于NSCLC的診斷、分型及治療，這可作為下一步的研究方向。