基于SSR標(biāo)記的26份棉花材料的遺傳多樣性分析

翟書偉，鄧婷婷，曹云泉，陳 奇，湯盈盈，袁寶童，汪保華

(南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南通 226019)

棉花是世界上最重要的纖維作物，現(xiàn)今已被絕大多數(shù)國家所種植。近年來，隨著棉紡織企業(yè)對(duì)棉花需求量的不斷增加，培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)棉成為了棉花研究的主要方向。但同時(shí)也伴隨著棉花品種多，種類雜等問題[1]。因此，分析不同棉花品種之間的遺傳差異，合理選配親本，減少配置雜交組合的盲目性將有利于棉花育種親本選配工作的順利進(jìn)行[2]。

分子標(biāo)記輔助育種是繼轉(zhuǎn)基因育種之后新興的分子育種技術(shù)，與傳統(tǒng)育種技術(shù)相比較，分子標(biāo)記輔助育種因其具有跟蹤目標(biāo)基因(性狀)、提高育種效率、減少遺傳累贅等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于植物育種中[3]。目前，在植物育種中使用的分子標(biāo)記很多，最常用的有RFLP、RAPD、AFLP和SSR等[4,5]。其中，SSR標(biāo)記因其多態(tài)性豐富,重復(fù)性好，遺傳上呈共顯性等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛用于棉花遺傳圖譜的構(gòu)建和重要農(nóng)藝性狀的定位等方面[6]。馬軒等[7]利用SSR技術(shù)在110對(duì)SSR引物中篩選到10對(duì)擴(kuò)增效果較好的引物，并以此構(gòu)建了18個(gè)彩色棉品系的DNA指紋圖譜，同時(shí)用這10對(duì)引物對(duì)18個(gè)彩色棉進(jìn)行了聚類分析，對(duì)它們的親緣關(guān)系作了初步探討。劉峰等對(duì)32份棉花品種聚類分析結(jié)果表明，32份棉花品種遺傳基礎(chǔ)狹窄，相同育種單位育成的部分品種間遺傳距離較近，不同育種單位育成的品種間遺傳距離相對(duì)較大[8]。滕中華等對(duì)29份棉花品種進(jìn)行了聚類分析，在相似系數(shù)為0.78時(shí)，29份棉花品種被分為陸地棉、海島棉和二倍體栽培棉3個(gè)大類，該研究表明，棉花栽培種陸地棉、海島棉、二倍體栽培棉種內(nèi)遺傳差異較小[9]。本研究通過SSR分子標(biāo)記技術(shù)和序列比對(duì)，以26份棉花品種為研究對(duì)象，分析其遺傳關(guān)系,為棉花育種工作的親本選配提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

由于品種來源有限，本研究所選用的26份棉花材料，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所國家棉花種質(zhì)中期庫提供，具體品種名稱見表1。

1.2 方 法

1.2.1DNA提取、PCR擴(kuò)增和電泳

將供試材料播種于溫室中，苗期待棉花長出3～4片真葉，每個(gè)供試材料隨機(jī)選取3株長勢良好的棉花，每株選取1片較大的幼嫩葉片，置于研缽中用液氮進(jìn)行研磨，最后利用改良的CTAB法[5]從上述棉花植株幼嫩葉片中提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增過程選用10 μL的反應(yīng)體系，成分包括：1 μL DNA模板，1 μL SSR引物(1 μ mol·L-1)，1 μL 10×Reaction buffer(不含Mg2+)，1 μL Mg2+(25 mol·L-1)，0.2 μLTaq酶(2.5 U·μL-1)，1 μL dNTP(10 mmol·L-1)，4.8 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增步驟如下：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存待測。PCR產(chǎn)物用10%聚丙烯酰胺凝膠分離，采用銀染法[10]得到DNA條帶。

表1 26份棉花材料編號(hào)及簡介

1.2.2SSR多態(tài)性引物篩選

基于實(shí)驗(yàn)室先前研究和現(xiàn)有引物[11]，從中篩選了60對(duì)擴(kuò)增條帶明顯，特異性強(qiáng)的SSR標(biāo)記引物用于本次實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3數(shù)據(jù)收集及分析

凝膠照片通常可以被用來分析DNA條帶。在每個(gè)條帶的位置，給出以下值：帶呈現(xiàn)記為“1”，帶不存在記為“0”。然后計(jì)算供試材料間的簡單匹配系數(shù)(SM)，SMij=M/N，其中M是指材料i和j之間共有的片段數(shù)目，N指在2個(gè)材料中出現(xiàn)的片段數(shù)目之和。采用不加權(quán)成對(duì)群算術(shù)平均數(shù)方法(UPGMA，Unweight pair group method using arithmetic averages)和SM系數(shù)，利用NTSYSpc 2.10 e軟件[12]進(jìn)行聚類分析。引物的多態(tài)信息含量(Polymorphism information content, PIC)按如下公式計(jì)算：

式中，k是一個(gè)SSR所檢測到的等位基因的數(shù)目，Pi是第i個(gè)等位基因的頻率。PIC可以反映出某個(gè)引物的多態(tài)性水平及其區(qū)分群體的能力大小，其PIC值取決于檢測到的等位位點(diǎn)數(shù)目的多少及位點(diǎn)頻率的高低。

1.2.4DNA測序及序列分析

從聚丙烯酰胺凝膠中切割相似性高的多態(tài)性片段，經(jīng)切膠回收[13]后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)用50 μL體系，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物5 μL用于檢測，剩余45 μL送上海捷瑞公司測序，測序時(shí)提供了對(duì)應(yīng)的單向引物序列。測序結(jié)果使用BioEdit軟件比對(duì)同源序列和進(jìn)行基本的突變分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增片段的多態(tài)性分析及引物的多態(tài)信息含量

擴(kuò)增片段的分析表明，60對(duì)引物均能產(chǎn)生擴(kuò)增帶，其中39對(duì)SSR引物產(chǎn)生的擴(kuò)增帶穩(wěn)定而清晰，分子量在100～300 bp之間。產(chǎn)生多態(tài)性的SSR引物其擴(kuò)增產(chǎn)物均用于后續(xù)分析，在26份棉花品種中共檢測出117個(gè)等位位點(diǎn)，其中99個(gè)等位位點(diǎn)具有多態(tài)性，占84.6%，每對(duì)引物可擴(kuò)增出1～5個(gè)位點(diǎn)，平均為2.5個(gè)等位位點(diǎn)，其中NAU 2679和NAU 3008的等位位點(diǎn)最多，為5個(gè)。結(jié)果表明，26份棉花品種具有較豐富的遺傳變異。

39對(duì)SSR引物的多態(tài)性信息含量PIC變幅為0.497～0.859，平均為0.678，以引物DPL 0222值最高(0.859)，這表明引物DPL 0222能較好地揭示不同棉花品種間的遺傳多樣性，同時(shí)表明在這個(gè)位點(diǎn)的棉花基因組中，存在較高的遺傳變異，且該擴(kuò)增位點(diǎn)遺傳多樣性豐富。引物NAU 3862、CCRI 711和SWU 21646值最低(0.497)(表2)。

Botstein等[14]最先提出評(píng)判基因多樣性的PIC標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)PIC<0.25時(shí)，表明是低度多態(tài)信息位點(diǎn)；當(dāng)0.250.5時(shí)，是高度多態(tài)信息的位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中有5對(duì)引物能揭示中度多態(tài)信息位點(diǎn)，34對(duì)引物能揭示高度多態(tài)信息位點(diǎn)。一般認(rèn)為，多態(tài)性越高，越能夠反映出各物種之間的遺傳關(guān)系。本研究結(jié)果表明，所選引物能較好地揭示豐富的遺傳信息。部分引物的SSR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

2.2 聚類分析

通過Ntsys軟件，利用SM%(單匹配系數(shù)%)表示棉花品種間的相似性，得到品種間的相似系數(shù)。26份棉花品種之間的相似系數(shù)在0.303～0.989之間。其中海門雞腳棉和南通紫莖雞腳白花紅心相似系數(shù)最大(0.989)，表明海門雞腳棉和南通紫莖雞腳白花紅心之間親緣關(guān)系最近，小黑子棉和超雞腳長絨棉相似系數(shù)最小(0.303)，表明兩材料之間親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。從聚類圖可以看出，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.73時(shí)，26份棉花品種可分為四大類，其中第Ⅰ類為南通青莖雞腳椏鈴果黃花、南通紫莖雞腳白花紅心、海門青莖雞腳棉、海門雞腳棉、如東雞腳椏果、江蘇南通雞腳棉、江陰雞腳棉毛子、江蘇常熟雞腳棉、石系亞1號(hào)和長豐黑籽234；第Ⅱ類為小黑子棉、澳L 23/757、Siokral 22和TM-1；第Ⅲ類為紫紅雞腳葉棕絮、雞腳紅葉棉、雞腳德字棉、脫字棉、洋雞腳棉14、雞腳小洋花、短節(jié)雞、GP 79和N 73 DeltapineNFO；第Ⅳ類為超雞腳長絨棉、Termez 17-1和Buhara 2 TNV。聚類結(jié)果如圖2所示。

2.3 DNA序列分析

為了研究不同基因組中DNA的差異性，對(duì)26份棉花品種進(jìn)行了序列測序，選擇了條帶清晰、遺傳多樣性豐富的引物BNL 4092，對(duì)其擴(kuò)增出來的共有條帶進(jìn)行了3次重復(fù)克隆測序，挑選原始測序結(jié)果峰圖單一穩(wěn)定的序列，用BioEdit軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行多序列分析。序列比對(duì)結(jié)果見圖3。

表2 26份棉花品種遺傳多樣性分析結(jié)果

多序列比對(duì)結(jié)果表明，26份棉花品種分為二倍體棉花組和四倍體棉花組，且序列差異很大，從分子水平上揭示不同組別棉花的本質(zhì)差異。在二倍體棉花組中，10份棉花品種(南通青莖雞腳椏鈴果黃花、南通紫莖雞腳白花紅心、海門青莖雞腳棉、海門雞腳棉、如東雞腳椏果、江蘇南通雞腳棉、江陰雞腳棉毛子、江蘇常熟雞腳棉、長豐黑籽234和石系亞1號(hào))堿基序列基本相同，同源性很高(為99.5%)，這與聚類結(jié)果相一致。同時(shí)10份棉花品種堿基序列相對(duì)保守，堿基突變位點(diǎn)較少，其內(nèi)部存在1處突變位點(diǎn)，T/C突變。在四倍體棉花組中，11份棉花品種(小黑子棉、澳L 23/757、Siokral 22、TM-1、紫紅雞腳葉棕絮、雞腳紅葉棉、洋雞腳棉14、短節(jié)雞、超雞腳長絨棉、Termez 17-1和Buhara 2 TNV)同樣堿基序列基本相同，同源性很高(為98.5%)，其內(nèi)部存在3處突變位點(diǎn)，主要為A/G突變、A/T突變和C/T突變。其余5份棉花品種(雞腳德字棉、脫字棉、雞腳小洋花、GP 79和N 73 DeltapineNFO)含有與其他品種不同的串聯(lián)重復(fù)序列，推測該序列可能在其進(jìn)化過程中具有重要意義。

圖2 26份棉花品種聚類圖

圖1 SSR引物BNL 4092和CCRI 252的擴(kuò)增片段結(jié)果

3 結(jié)論與討論

通過不同來源棉花品種的遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，在不同的分類中，來自相同地域的棉花品種間遺傳差異較小、親緣關(guān)系較近。例如，南通青莖雞腳椏鈴果黃花、南通紫莖雞腳白花紅心、海門青莖雞腳棉和海門雞腳棉在相似系數(shù)為0.878時(shí)聚在第Ⅰ大類，這可能因?yàn)檫@些雞腳棉品種均為南通市當(dāng)?shù)乩掀贩N，可能來自共同祖先，變異幅度不大，且南通紫莖雞腳白花紅心和海門雞腳棉相似系數(shù)達(dá)0.989，表型分析可知，2種棉花株高相近，植株矮小，莖稈偏紫，雞腳葉五爪深裂，開白花紅心，綜合分析結(jié)果推測，2種棉花可能為同種異名。澳大利亞棉花品種多為雞腳葉型棉，纖維品質(zhì)優(yōu)良，抗枯萎病性狀突出[15]，20世紀(jì)90年代澳洲棉的引入，在一定程度上解決了我國棉花品種抗性不強(qiáng)、品質(zhì)不佳等問題[16]，推動(dòng)了我國棉花育種進(jìn)程。本研究所選用的Siokral 22棉花材料，是1992年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所郭金城先生訪問澳大利亞時(shí)，澳方贈(zèng)與我國的[17]，在相似系數(shù)為0.949時(shí)和澳L 23/757聚在第Ⅱ大類。脫字棉和N 73 DeltapineNFO均為20世紀(jì)20—50年代間引入的國外棉花品種[1]，在我國棉花換種階段占有重要地位，這也在一定程度上對(duì)我國棉花種質(zhì)資源進(jìn)行了改良，聚在第Ⅲ大類。

注：箭頭所示為引物結(jié)合位置。圖3 26份棉花品種多序列比對(duì)結(jié)果

Termez 17-1和Buhara 2 TNV均為烏茲別克斯坦棉花[18]，在相似系數(shù)為0.898時(shí)聚為第Ⅳ大類，但與之聚在一起的超雞長絨棉，與其他材料棉花親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳相似系數(shù)在0.303～0.595之間，在表型觀察中，發(fā)現(xiàn)超雞長絨棉莖稈粗壯，結(jié)鈴少，株高可達(dá)2 m，這與王忠義等[19]的研究結(jié)果不同，可能是超雞長絨棉在種植過程中產(chǎn)生了較大的變異。

四倍體棉花物種是由A基因組物種木本棉(亞洲棉)和D基因組物種雷蒙德氏棉物種間雜交形成[20]。在本研究中，聚類分析顯示二倍體棉花品種和四倍體棉花品種在相似系數(shù)為0.47時(shí)被分為兩類，遺傳差異較大、親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這可能與所選用的二倍體棉花品種來源較為單一有關(guān)。多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)二倍體棉花品種和四倍體棉花品種序列間差異顯著，且四倍體棉花品種含有更多的突變位點(diǎn)，這都表明了四倍體棉花在形成過程中基因組發(fā)生了顯著性的差異改變，且突變位點(diǎn)的增多將更有利于其遺傳上的進(jìn)化。但在同為四倍體的棉花品種中，序列的差異性又顯著減小，存在保守序列，含有3處突變位點(diǎn)，與之相比，二倍體棉花品種的保守性更為顯著，這表明了四倍體棉花品種在進(jìn)化上具有一定的優(yōu)勢性，但也都顯示出了目前棉花遺傳基礎(chǔ)的狹窄性，不過也證實(shí)了棉花基因組中確實(shí)存在單核苷酸突變位點(diǎn)[21]。

綜合分析表明，我國棉花品種遺傳基礎(chǔ)狹窄，因此，廣泛引進(jìn)國外品種資源，充分利用地方品種資源，合理設(shè)計(jì)開發(fā)分子標(biāo)記，將成為今后棉花育種的主要方向。