薄荷精油對幾種植物病原真菌的抑制作用研究

劉琳玉 牛之函 任艷利

（伊犁師范大學生物與地理科學學院，新疆伊寧 835000）

1 引言

1.1 薄荷的形態(tài)及分布薄荷屬（Mentha haplocalyx Briq.）是唇形科多年生的芳香草本植物，葉對生，葉具柄或無柄，葉基部楔形。薄荷屬植物大多分布在北半球溫帶區(qū)域，少數(shù)分布在南半球。薄荷屬植物在我國分布比較廣泛，北方有黑龍江，南方有云南西雙版納，西北部有新疆伊犁，東部有臺灣。此外，還有很多人工栽培薄荷植物，例如：薄荷（M.haplocalyxBriq.）、留蘭香（M.spicataL.）、椒樣薄荷（M.piperitaL.）等［1］。薄荷是一種良好的中藥材，也是最主要的香料。薄荷生長適應能力強，在海拔2100m以下地區(qū)均可生長。薄荷喜生長在溫暖濕潤、陽光充足、雨量充沛的環(huán)境，栽培時土壤以疏松肥沃、排水良好的砂壤土最好，對土壤酸堿性要求不嚴，pH在5.5～7.5。新疆伊犁河谷一帶氣候濕潤、雨量充足，為藥用植物提供了良好的生長環(huán)境，據(jù)統(tǒng)計該地區(qū)野生藥用植物資源超過1000種［2］。

1.2 植物精油植物精油（Essential oils，Eos），又稱為揮發(fā)油（volatile oils），屬于植物次生代謝產物，是存在于芳香植物體內的一類具有揮發(fā)性、由分子量較小且具有一定活性的簡單化合物組成、可隨著水蒸氣蒸餾、具有強烈的香味和氣味的油狀液體物質的總稱，多數(shù)精油為無色或淡黃色液體。植物精油不易溶于水，但極易溶于極性小的有機溶劑。植物精油是從植物的根、莖、葉、花、皮等中提取，因此精油成分受植物的品種和地理環(huán)境影響較大［3］

1.3 研究目的和意義精油在植物界分布非常廣泛［4］，薄荷精油具有良好的抑菌效果，可以作為食品防腐劑［5］。植物病原菌引起的植物病害是影響農業(yè)生產的主要因素之一。農業(yè)生產過程中，由于植物病原真菌引起的病害大約占植物病害總數(shù)的70%～80%［6］。植物精油具有抗菌活性，能夠殺死細菌、病毒和真菌。例如：丁香、芥末具有較強的抑菌作用，迷迭香和百里香具有中等抑菌作用等［7］。植物精油成分復雜，對很多植物病原菌作用多樣化，具有很好的抑制作用。由于植物精油來源于植物組織，因此對人畜、環(huán)境無害，在自然條件下可以分解，可有效解決化學殺菌劑對環(huán)境的污染問題［8-9］?；诖耍P者研究了薄荷精油對5種植物病原真菌的抑制作用，以期為灰葡萄孢菌、辣椒疫霉病菌、菜豆炭疽病菌、油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌的防治提供參考。

2 材料與方法

2.1 供試材料薄荷精油：于2019年5月在新疆伊犁哈薩克自治州伊寧市尼勒克縣野核桃溝采樣。供試菌種：灰葡萄孢菌（Botrytis Cinerea）、辣椒疫霉病菌（Phytopthora capsici）、菜豆炭疽病菌（Colletotrichum linde-muthianum）、油菜菌核病菌［（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）］、棉花枯萎病菌［（Fusariurn oxysporum f. Sp. Vasinfectum（Atk.）Snyder&Hansen）］，供試病菌置于PDA固體培養(yǎng)基中備用。

2.2 方法

2.2.1 配制PDA培養(yǎng)基 稱取去皮土豆200g，切成小塊后放入鍋中加入1000mL蒸餾水，加熱至沸騰，持續(xù)加熱20～30min。將紗布疊成6層趁熱在量杯上過濾，濾渣丟棄。向濾液中補充水分至1000mL，加入葡萄糖20g、瓊脂粉20g，再用小火加熱至瓊脂完全溶解后，補充水分至所需量。放入滅菌鍋中，121℃滅菌20min。

2.2.2 薄荷精油提取 薄荷采摘自新疆伊犁哈薩克自治州伊寧市尼勒克縣野核桃溝，于通風陰涼處陰干7d后粉碎。稱取100g薄荷粉末，量取2L蒸餾水，依次加入三頸燒瓶中，將三頸燒瓶放入加熱套中，連接鐵架臺、揮發(fā)油提取器、球形冷凝管。當揮發(fā)油提取器中出現(xiàn)油狀小液滴時開始計時，提取時間一般為8h。當揮發(fā)油提取器中不再出現(xiàn)小液滴時停止收集，從揮發(fā)油提取器下端取出薄荷精油，裝入已滅菌的10mL離心管中。在離心管中加入無水硫酸鈉，去除薄荷精油中的多余水分。將離心管放入離心機中離心處理，8000rmp，5min。用移液槍將上層無水薄荷精油轉入新的離心管中，用封口膜封口，放入4℃冰箱備用。

2.2.3 含精油培養(yǎng)基的配制 首先吸取不同濃度的薄荷精油與0.1%吐溫-80進行混合并充分搖勻，隨后將已經乳化好的薄荷精油混合液加入到已經冷卻至60℃左右的PDA固體培養(yǎng)基中，最后在無菌室超凈工作臺上將PDA培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，得到薄荷精油最終濃度分別為5.0、2.5、1.25、0.625μL∕mL的固體培養(yǎng)基，同時配制不含薄荷精油的PDA培養(yǎng)基平板作為空白對照。

2.2.4 接種培養(yǎng) 選取在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～7d的菌體作為供試菌，使用無菌打孔器（直徑為7mm），在菌落邊緣切取菌餅，然后將切取的菌餅放入到精油濃度不同的平板和不含精油的空白對照培養(yǎng)基中。將恒溫培養(yǎng)箱溫度設置為28℃，培養(yǎng)皿倒置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)5d。從第1天開始，采用十字交叉法測量供試菌的直徑，記錄并計算抑制率。

根據(jù)抑制率大小就可判定不同濃度薄荷精油的抑菌活性大小。較弱抑制：相對抑制率≤40%；中等強度抑制：相對抑制率40%～70%；較強抑制：相對抑制率≥70%。

2.2.5 最低抑制濃度（MIC測定） 依據(jù)試驗結果，使用瓊脂稀釋的方法測定不同濃度薄荷精油對不同植物病原菌的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。將融化的培養(yǎng)基與已乳化好的不同濃度精油充分混勻。在無菌室內超凈工作臺上將PDA培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，使得培養(yǎng)皿中精油濃度分別為7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0μL∕mL。在空白對照中加入同等量的1%吐溫-80。選取7mm的無菌打孔器切取菌餅，將菌餅放入到上述不同處理的培養(yǎng)皿中央，在恒溫培養(yǎng)箱28℃的條件下培養(yǎng)48h，每個樣本重復3次，對其生長情況進行觀察記錄并計算抑制率。若有菌落生長則為無抑菌作用，菌落完全沒有生長的最低精油濃度即為MIC。

3 結果與分析

3.1 對辣椒疫霉病菌菌絲生長的抑制作用由圖1可知，薄荷精油濃度為5μL∕mL時，第1～2天菌絲生長速率均為0（抑制率100%），在第3～5天時菌絲生長速率分別為0.17、1.0、1.22mm∕d，抑制率分別為98.57%、90.24%、86.8%；精油濃度為2.5μL∕mL時，第1天未見到菌絲生長（抑制率100%），但是從第2～5天時，菌絲出現(xiàn)明顯生長，生長速率分別為1.4、4.17、5.25、5.72mm∕d，抑制率分別為87.88%、64.29%、48.78%、38.1%；精油濃度為1.25μL∕mL時，菌絲從第1天即開始生長，生長速率分別為0.8、3.75、5.67、6.45、6.76mm∕d，精油抑制率分別為92.38%、67.53%、51.43%、37.07%、26.84%；精油濃度為0.625μL∕mL時，第1～5天菌絲增長速率分別為8.2、10.5、10.57、9.8、9.0mm∕d，精油抑制率分別為21.9%、9.09%、9.43%、4.39%、2.60%，與對照組相比差異不大，抑制作用較弱。

由圖1可知，隨著精油濃度增加，其對辣椒疫霉病菌的抑制作用越強；隨著時間的增加，精油的抑制作用也越弱。當精油濃度為5μL∕mL時，表現(xiàn)出較強的抑制作用；當精油濃度為0.625μL∕mL時，菌絲增長速率幾乎與空白對照無差異，表現(xiàn)出較弱的抑制作用。

3.2 對油菜菌核病菌菌絲生長的抑制作用由圖2可知，薄荷精油濃度為5μL∕mL時，油菜菌核病菌在第1～5天均未見增長，抑制率達到100%；精油濃度為2.5μL∕mL時，油菜菌核病菌在第1～2天均未見增長（抑制率100%），在第3～5天增長率分別為2.03、1.88、2.84mm∕d，精油抑制率分別為80.63%、77.94%、61.93%；精油濃度為1.25μL∕mL時，第1～5 天菌絲增長率分別為0.2、0.25、5.37、6.83、6.52mm∕d，菌絲增長抑制率分別為97.50%、97.96%、48.89%、19.71%、12.60%；精油濃度為0.625μL∕mL時，菌絲從第1天開始增長明顯，第1～5天增長率分別為0.5、7.0、9.5、7.85、7.0mm∕d，菌絲增長抑制率分別為93.75%、42.86%、9.52%、7.65%、6.17%，從第3天開始菌絲生長速率與空白對照組差異不明顯，表現(xiàn)出較弱抑制作用。

由圖2可知，薄荷精油濃度越低，對油菜菌核病菌的抑制效果越弱。油菜菌核病菌無增長、抑制效果非常明顯的精油濃度為5μL∕mL；當精油濃度為0.625μL∕mL時，第3～5天菌絲增長迅速，抑制效果明顯減弱。

3.3 對棉花枯萎病菌菌絲生長的抑制作用由圖3可知，精油濃度為5μL∕mL時，棉花枯萎病原菌第1～2天均未見增長（抑制率均為100%），在第3～5天菌絲增長速率分別為0.4、1.15、2.24mm∕d，菌絲生長抑制率分別為96.24%、87.93%、74.43%，此時抑制作用較強；精油濃度為2.5μL∕mL時，第1天未見菌絲明顯增長，第2～5天菌絲增長速率分別為1.35、2.37、4.23、4.88mm∕d，抑制率分別為87.73%、77.74%、55.64%、44.29%；精油濃度為1.25μL∕mL時，菌絲在第1天未見增長（抑制率100%），從第2～5天菌絲增長率分別為4.1、5.87、6.65、6.36mm∕d，菌絲生長抑制率分別為62.73%、44.83%、30.18%、27.40%；精油濃度為0.625μL∕mL，菌絲從第1天開始增長明顯，，第1～5天增長率分別為2.7、8.0、8.37、8.05、7.68mm∕d，菌絲增長抑制率分別為28.95%、27.27%、21.32%、15.49%、12.33%，此濃度的精油抑制作用較弱，從第4天開始菌絲生長速率與空白對照組差異不明顯。

由圖3可知，當精油濃度為5μL∕mL時，棉花枯萎病菌增長緩慢，抑制效果非常明顯；當精油濃度為0.625μL∕mL時，第2～5天菌絲增長迅速，抑制效果明顯減弱。與空白對照相比，含有薄荷精油的菌絲生長速度明顯減慢；隨著薄荷精油濃度的增加，生長速率也逐漸變??；隨著時間的增加，抑制效果也逐漸減弱。

3.4 對灰葡萄孢菌菌絲生長的抑制作用由圖4可知，精油濃度為5μL∕mL時，灰葡萄孢菌第1～2天均未見增長，在第3～5天菌絲增長速率分別為0.07、0.15、0.18mm∕d，菌絲生長抑制率分別為98.83%、97.48%、96.84%，抑制作用較強；精油濃度為2.5μL∕mL時，第1天未見菌絲明顯增長，第2～5天菌絲增長速率分別為0.55、0.53、0.5、0.5mm∕d，菌絲生長抑制率分別為90.91%、90.64%、91.60%、91.23%；精油濃度為1.25μL∕mL時，菌絲從第1天開始增長，增長率分別為0.3、1.3、2.97、3.9、4.64mm∕d，菌絲生長抑制率分別為92.68%、78.51%、47.95%、34.45%、18.60%；精油濃度為0.625μL∕mL，菌絲從第1天開始增長明顯，第1～5天菌絲增長率分別為0.6、0.85、1.37、2.53、2.84mm∕d，菌絲增長抑制率分別為85.37%、85.95%、76.02%、57.56%、50.18%，抑制效果較弱。

由圖4可知，當精油濃度為5μL∕mL時，灰葡萄孢菌增長非常緩慢，抑制效果最為明顯；當精油濃度0.625μL∕mL時，第4～5天菌絲增長迅速，抑制效果明顯減弱。與空白對照相比，經薄荷精油處理過的灰葡萄孢菌菌絲生長速率減小，且隨著精油濃度的增加，菌絲生長速率逐漸變??；隨著時間的增加，抑制效果也逐漸減弱。

3.5 對菜豆炭疽病菌菌絲生長的抑制作用由圖5可知，精油濃度為5μL∕mL時，第1～2天未見菌絲增長（抑制率100%），第3～5天菌絲增長速率分別為0.1、1.08、2.08mm∕d，菌絲生長抑制率分別為99.13%、89.46%、77.83%，抑制作用較強；精油濃度為2.5μL∕mL時，第1天未見菌絲生長，第2～5天菌絲增長速率分別為2.75、3.23、4.93、5.04mm∕d，菌絲生長抑制率分別為73.17%、71.80%、51.72%、46.27%；精油濃度為1.25μL∕mL時，第1～5天的菌絲增長速率分別為0.5、4.95、8.13、8.05、7.54mm∕d，抑制率分別為88.64%、51.71%、29.07%、21.08%、19.62%；精油濃度為0.625μL∕mL時，第1～5 天菌絲增長率分別為2.6、8.4、9.43、8.88、8.18mm ∕d，菌絲增長抑制率分別為40.91%、18.05%、17.73%、12.99%、12.79%，菌絲增長速率明顯減慢，抑制率降低，第2天開始增長速率明顯加快，與空白對照組差異較小。

由圖5可知，當精油濃度為5μL∕mL時，菜豆炭疽病菌增長緩慢，抑制效果非常明顯；當精油濃度為0.625μL∕mL時，第2～5天菌絲增長迅速，抑制效果明顯減弱。與空白對照相比，含有薄荷精油的菜豆炭疽病菌菌絲生長速率緩慢。當精油濃度增加時，菌絲的生長速率也逐漸變??；隨著時間的增加，抑制效果也逐漸減弱。

3.6 最低抑菌濃度使用瓊脂稀釋法，將不同量薄荷精油加入至大約50℃的定量PDA培養(yǎng)基中，制成含精油的平皿，使精油濃度分別為7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0μL∕mL。分別接種灰葡萄孢菌、辣椒疫霉病菌、菜豆炭疽病菌、油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌，每個濃度重復3組，并進行MIC測定。由表1可知，薄荷精油對5種供試菌的最低抑菌濃度為灰葡萄孢菌＜油菜菌核病菌＜棉花枯萎病菌＜辣椒疫霉病菌＜菜豆炭疽病菌，其中薄荷精油對灰葡萄孢菌的抑制作用最強，最低抑菌濃度（MIC）為3.5μL∕mL；對菜豆炭疽病菌的抑制作用最弱，最低抑菌濃度（MIC）為6.0μL∕mL。

表1 薄荷精油對5種供試菌株的最低抑菌濃度（μL/mL）

4 結論與討論

4.1 結論當薄荷精油濃度為5μL∕mL時，處理5d對油菜菌核病菌的抑制率達到100%，可完全抑制油菜菌核病菌的增長；當精油濃度為2.5μL∕mL時，對灰葡萄孢菌有較強的抑制作用；當精油濃度為1.25μL∕mL時，對辣椒疫霉病菌、棉花枯萎病菌的抑制作用表現(xiàn)為中等；當精油濃度為0.625μL∕mL時，對菜豆炭疽病菌的抑制作用較弱。薄荷精油對5種植物病原菌生長抑菌效果均隨精油濃度增加而增強。

薄荷精油對5種供試菌的最低抑菌濃度為灰葡萄孢菌＜油菜菌核病菌＜棉花枯萎病菌＜辣椒疫霉病菌＜菜豆炭疽病菌，說明薄荷精油對這5種植物病原菌的抑制作用隨著薄荷精油濃度的增大而不斷增強，且對不同植物病原菌的抑制作用存在差異。

4.2 討論與化學滅菌劑相比，植物精油來源于植物組織，對人畜、環(huán)境無害，在自然條件下可以分解，可有效解決化學殺菌劑對環(huán)境的污染問題［8-9］。同時，植物精油也是一種重要的天然防腐保鮮劑原料［10］。隨著對植物精油的研究不斷深入，農藥領域也開始重視植物精油對植物病原菌的抑制作用。任艷利等研究發(fā)現(xiàn)椒蒿精油對幾種植物病原菌具有明顯的抑制作用；倪秀紅等［11］研究發(fā)現(xiàn)迷迭香精油對幾種植物病原菌也具有明顯的抑制作用；秦海燕等［12］研究發(fā)現(xiàn)檸檬精油可以通過呼吸作用直接作用于肺部發(fā)揮抑菌作用。本試驗僅研究了薄荷精油對5種植物病原真菌的抑制作用，對于其他植物病原菌是否具有抑制作用，還需后續(xù)試驗驗證。