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    瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定小麥中長穗偃麥草的基因

    2020-11-19 06:37:06單張凡
    安徽農(nóng)學(xué)通報(bào) 2020年21期
    關(guān)鍵詞:麥草凝膠電泳瓊脂糖

    單張凡

    (江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,江西南昌 330045)

    長穗偃麥草是小麥遠(yuǎn)緣雜交利用最廣泛和成功的小麥近緣物種之一,在小麥育種和生產(chǎn)中作出重大貢獻(xiàn)[1]二倍體長穗偃麥草具有抗炎、抗旱等優(yōu)秀性狀,因而人們較早地開展了小麥與長穗偃麥草的遠(yuǎn)緣雜交和回交轉(zhuǎn)育工作,相繼育成了一套完整的小麥-長穗偃麥草二體附加系和代換系[2],本試驗(yàn)通過DNA提取、PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳法等方法,對(duì)長穗偃麥草雜交的幾個(gè)組合小麥進(jìn)行了檢測(cè),檢測(cè)其抗白粉病基因,并驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性,以期后續(xù)相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料本試驗(yàn)所采用的實(shí)驗(yàn)材料均由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所提供,具體組合為新春37∕XC(長穗偃麥草雜交后代)10、新春37∕XC31、新春37∕XC35

    1.2 試驗(yàn)步驟

    1.2.1 播種 組合新春37∕XC10取63粒種子、新春37∕XC31取15粒、新春37∕XC35取22粒播種,取5×10的培養(yǎng)盤2盒,在培養(yǎng)盤中放入由農(nóng)場土、肥料土和較為松軟的營養(yǎng)土混合而成的土,撥平土面,將種子從格子中間壓入土中。然后將其轉(zhuǎn)移至溫室,定期澆水。

    1.2.2 DNA檢測(cè)溶液的配制 取樣:在小麥1葉1心期進(jìn)行取樣。取2g左右小麥的葉片,放入2mL的離心管中,將離心管放入液氮罐中防止葉片失活。

    磨樣:將裝有小麥樣品的離心管從液氮罐中撈出來并迅速放入磨樣機(jī)粉碎。

    DNA提?。簩⒁呀?jīng)研磨至粉末狀的樣品撈出,加入0.8mL裂解液(1%SLS裂解液),劇烈振蕩,充分混勻,于室溫 靜 置10min;加 入0.8mL 的CTAB 提 取 液,室 溫 靜 置10min,12000rpm離心10min后,將上清液移至1.5mL離心管中,重復(fù)此操作1次;加入上清液0.6倍體積的預(yù)冷異丙醇,充分混勻,-20℃沉淀30min;4℃10000rpm離心10min,棄上清,加入1mL75%乙醇洗滌沉淀2 遍,每次4℃10000rpm離心5min后棄上清,第3遍用無水乙醇洗滌,離心后棄上清,在超凈工作臺(tái)吹干;向干燥的DNA中加入TE緩沖液,溶解DNA.得DNA提取液

    DNA提取液濃度檢測(cè):使用NanoDrop1000微量紫外-分光光度計(jì)測(cè)定樣品液的純度及質(zhì)量濃度。打開Nano?Drop軟件,設(shè)計(jì)Type為DNA,加入1μL DNA提取液進(jìn)行測(cè)定,得出DNA濃度、260∕280、260∕230數(shù)值。DNA濃度范圍應(yīng)為100ng∕ul左右,若過大,則應(yīng)加入TE緩沖液進(jìn)行稀釋;260∕280數(shù)值應(yīng)在1.9左右;260∕230數(shù)值不得小于2.0。

    1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR體系的構(gòu)建:在離心管中分別加入154.8μL Mix、3.6μL ThpF、3.6μL ThpR,混合離心,在96孔板中先加入1.5μL 檢測(cè)后的DNA,取13.5ul離心后的溶液,封口,放入PCR儀中。

    PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性2min;94℃變性20s;根據(jù)不同的引物設(shè)置不同的退火溫度,退火15s;60℃延伸30s;最后72℃延伸7min的擴(kuò)增后的溶液。

    1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 凝膠的配制:稱取2.5g瓊脂糖粉置于250mL的錐形瓶中,加入100mL TAE溶液,將錐形瓶置于微波爐中中火加熱,搖晃后再次置于微波爐中加熱進(jìn)行消泡后,加入5μ LEB染液混合均勻,倒入實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)備好的膠盒中,并放好梳子,靜置10min后小心地垂直拔出梳子。

    瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè):取出已成的膠體,放于電泳槽中,將經(jīng)PCR擴(kuò)增后的DNA溶液小心加入點(diǎn)樣孔,蓋上蓋子,然后啟動(dòng)電泳儀,在140V的電壓下等待20min后取出膠體,放在凝膠成像分析系統(tǒng)中進(jìn)行鑒定。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 3種組合的檢測(cè)結(jié)果利用引物Thp51、Thp43、Thp7、Thp34分別構(gòu)建不同的PCR體系,并利用瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)新春37∕XC10、新春37∕XC31、新春37∕XC35進(jìn)行檢測(cè)。不同引物和退火溫度對(duì)3種組合的檢測(cè)結(jié)果見圖1~4。由圖1~4可見:不管是哪一種PCR體系,這幾個(gè)組合的擴(kuò)增結(jié)果并沒有發(fā)生改變,均只有新春37∕XC31、新春37∕XC35的部分幼苗跑出了與長穗偃麥草相同的亮帶,說明這些擁有與長穗偃麥草相同亮帶的品種中導(dǎo)入了長穗偃麥草的基因,且此方法準(zhǔn)確度較高。

    2.2 方法重現(xiàn)性的驗(yàn)證采用引物Thp51,退火溫度58.4對(duì)新春37∕XC31和新春37∕XC35的幼苗進(jìn)行重復(fù)3次進(jìn)行測(cè)定,檢測(cè)結(jié)果見圖5~7。

    由圖5結(jié)果可見:采用相同的引物相同的退火溫度,對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)3次的檢測(cè),能跑出亮帶的品種類型一致,該方法的重現(xiàn)性較高。

    3 結(jié)論與討論

    長穗偃麥草是普通小麥的野生近緣種,其基因組DNA序列與小麥具有很高的同源性[3],本試驗(yàn)結(jié)果表明,應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳法可以檢測(cè)3個(gè)組合中導(dǎo)入的長穗偃麥草基因。瓊脂糖凝膠電泳法所取的樣品為小麥的葉片,取樣后并不影響小麥的正常生長,且可以重復(fù)取樣。該方法不僅重現(xiàn)性好,而且測(cè)得的結(jié)果較為穩(wěn)定,準(zhǔn)確度高,亮帶明顯。由此可見,應(yīng)用這一技術(shù),可以大規(guī)模篩選已導(dǎo)入某一基因的植株,檢驗(yàn)小麥雜交成功與否。

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