江西部分地區(qū)臨床健康豬群中副豬嗜血桿菌的血清型鑒定及耐藥性調(diào)查

譚美芳，譚 佳，李海琴，曾艷兵，季華員，方紹培，楊 群

（江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，江西南昌 330200）

【研究意義】副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）是一種非溶血、不運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陰性、多形態(tài)桿菌，屬于巴斯德菌科嗜血桿菌屬，是正常豬群上呼吸道的一種常在的條件性致病菌，生長(zhǎng)依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD 或V 因子），可引起豬的多發(fā)性漿膜炎、腦膜炎和關(guān)節(jié)炎[1]。隨著養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)模化、集約化發(fā)展，副豬嗜血桿菌已成為近年來(lái)危害養(yǎng)豬業(yè)的重大生豬疫病之一，呈世界性分布[2]。副豬嗜血桿菌只感染豬，且可感染不同階段的豬群，主要在斷奶前后和保育階段發(fā)病，也在某些病毒性疾病暴發(fā)后繼發(fā)感染，發(fā)病率一般在10%～15%，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)50%[3]。此外，副豬嗜血桿菌還可引起敗血癥，并且在急性感染后可能留下后遺癥，即母豬流產(chǎn)、公豬慢性跛行[3]。近年來(lái)副豬嗜血桿菌病在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率均呈顯著上升趨勢(shì)，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[4]。因此，在臨床實(shí)際中對(duì)副豬嗜血桿菌進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和耐藥性監(jiān)測(cè)，有助于正確選擇有效藥物來(lái)防控副豬嗜血桿菌病的暴發(fā)，并降低耐藥菌株和耐藥基因水平傳播的風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)健康綠色發(fā)展。【前人研究進(jìn)展】副豬嗜血桿菌的血清型較多，目前可分為15個(gè)血清型，臨床還有26%以上的分離株尚不能分型[5]。各血清型和毒株間致病力存在很大的差異，且各血清型之間缺乏有效的交叉免疫保護(hù)，另外不同國(guó)家、地區(qū)優(yōu)勢(shì)流行菌株不同，因此商品化疫苗臨床使用效果并不理想[6]。副豬嗜血桿菌的血清型普遍被認(rèn)為是其毒力的標(biāo)志，其中血清1、5、10、12、13和14型毒力最強(qiáng)，4 d內(nèi)引起病豬死亡或?yàn)l死；血清2、4、8和15型毒力中等，感染后死亡率較低；血清3、6、7、9 和11 型被認(rèn)為是無(wú)毒株，感染后無(wú)明顯臨床癥狀[7]。我國(guó)當(dāng)前流行的主要血清型是4、5、12、13 型和14 型[6]。目前，抗菌藥物是防治副豬嗜血桿菌病的主要措施。在病癥發(fā)生早期，使用抗生素能夠起到延遲發(fā)病以及降低死亡率的效果[8]。但是，長(zhǎng)期、廣泛、不合理的使用抗菌藥勢(shì)必導(dǎo)致耐藥菌株不斷增多、耐藥譜日益擴(kuò)大[9]。

【本研究切入點(diǎn)】副豬嗜血桿菌在江西省部分地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)中的流行和耐藥情況尚不清楚。另外，目前對(duì)副豬嗜血桿菌的血清型分型和耐藥性調(diào)查主要集中于發(fā)病豬只[10-13]，對(duì)臨床的表觀健康豬群中所攜帶的副豬嗜血桿菌的調(diào)查研究相對(duì)較少。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究選定江西省部分地區(qū)的幾個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)，采集健康豬只鼻拭子并進(jìn)行副豬嗜血桿菌的分離鑒定、血清分型和耐藥性研究，為有效防控副豬嗜血桿菌病的發(fā)生提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源

1.1.1 臨床健康豬群鼻拭子 樣本來(lái)自2018—2019年江西省南昌、吉安、撫州、贛州等地的規(guī)?；i場(chǎng)。在保育豬群和種豬群中隨機(jī)挑選表觀健康豬只共計(jì)114頭，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75%酒精棉擦拭豬鼻表面后，用無(wú)菌棉簽采集鼻液拭子114份。將鼻拭子保存在生理鹽水中，4 ℃冷藏運(yùn)輸和保存。

1.1.2 參考菌株 本研究所用參考菌株為副豬嗜血桿菌CVCC3729，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC）。本研究所用質(zhì)控菌株為大腸埃希氏菌（Escherichia coli）模式菌株ATCC25922，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

PremixTaqDNA 聚合酶、ddH2O、DL2000 DNA marker、50×TAE 緩沖液購(gòu)自大連Takara 公司；胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；新生牛血清（無(wú)噬菌體低內(nèi)毒素）購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；NAD 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；引物由深圳華大基因科技有限公司合成。革蘭氏陰性桿菌藥敏試劑盒（擴(kuò)散法）購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司，包含17種抗生素：氨芐西林（10μg/片），氨曲南（30μg/片），頭孢唑林（30μg/片），頭孢噻吩（30μg/片），頭孢呋辛（30μg/片），頭孢哌酮（75μg/片），頭孢噻肟（30μg/片），頭孢曲松（30μg/片），頭孢吡肟（30μg/片），頭孢他啶（30μg/片），頭孢西叮（30μg/片），氧氟沙星（5μg/片），鏈霉素（10μg/片），妥布霉素（10μg/片），卡那霉素（30μg/片），麥迪霉素（30μg/片），哌拉西林（100μg/片）。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)及初步鑒定

用無(wú)菌接種環(huán)蘸取鼻拭子液，劃線接種至含5%新生牛血清與0.01%NAD 的TSA 平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。選取無(wú)色透明、邊緣整齊、光滑濕潤(rùn)的圓形小菌落進(jìn)行革蘭氏染色，觀察細(xì)菌的顯微形態(tài)特征。將可疑菌落接種到新鮮的TSA 平板上，繼續(xù)劃線純培養(yǎng)。培養(yǎng)后的細(xì)菌進(jìn)行PCR 鑒定。選取1 株確定為副豬嗜血桿菌的菌株，由武漢塞維爾生物科技有限公司通過(guò)掃描電鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.4 副豬嗜血桿菌的PCR鑒定

用煮沸法制備細(xì)菌基因組DNA。PCR 鑒定副豬嗜血桿菌的高度保守基因（HPS_219690793，Gen?Bank 登錄號(hào)：CP020085.1），引物為：HPS-F（5′-ACAACCTGCAAGTACTTATCGGGA-3′），HPS-R（5′-TAGCCTCCTGTCTGATATTCCCAC-3′）[13]。對(duì)副豬嗜血桿菌進(jìn)行血清分型的引物參照Howell等[13]設(shè)計(jì)的15 對(duì)PCR 分型鑒定引物。所有的PCR 反應(yīng)體系（20μL）均為：Taq mixture 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板2μL，ddH2O 6μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳。在所有的PCR 反應(yīng)中，用ddH2O替代模板的PCR反應(yīng)作為陰性對(duì)照。

1.5 藥敏試驗(yàn)

采用Kirby-Baner（KB）紙片擴(kuò)散法調(diào)查副豬嗜血桿菌的藥敏情況，本次試驗(yàn)所用平板為含5%新生牛血清和0.01%NAD 的TSA 平板。詳細(xì)試驗(yàn)步驟如下：將已純化鑒定的菌株劃線接種至TSA 平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；用無(wú)菌棉拭子蘸取3～5 個(gè)單菌落，置于1 mL 滅菌生理鹽水中稀釋，將菌懸液濃度調(diào)整至0.5麥?zhǔn)媳葷岫?；另取無(wú)菌棉拭子浸潤(rùn)菌懸液，在管壁上旋轉(zhuǎn)擠壓幾次，均勻涂布到新鮮TSA 培養(yǎng)基表面；平板在室溫下干燥3～5 min，用鑷子取藥敏片貼在瓊脂表面，輕輕壓平；貼好藥敏片后15 min內(nèi)，將平板在35 ℃條件下恒溫倒置培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后取出平板，用毫米尺量取抑菌圈直徑，抑菌環(huán)的邊緣以肉眼看不見(jiàn)細(xì)菌為限，根據(jù)藥敏試劑盒說(shuō)明書(shū)判讀結(jié)果，以敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）報(bào)告。

2 結(jié)果

2.1 副豬嗜血桿菌的分離純化和形態(tài)觀察

本研究采集114 份臨床健康豬群的鼻液拭子，劃線接種于TSA 培養(yǎng)基表面，挑選圓形隆起、無(wú)色透明、光滑濕潤(rùn)的細(xì)小露珠樣菌落，菌落直徑約為0.5～1.0 mm，自然光下呈現(xiàn)淡藍(lán)色，進(jìn)一步劃線純化。副豬嗜血桿菌具有多種不同的形態(tài)，從單個(gè)的革蘭氏陰性小桿菌到長(zhǎng)的、細(xì)長(zhǎng)的，甚至絲狀的菌體[14]。通過(guò)菌落形態(tài)和細(xì)菌形態(tài)觀察（圖1），共分離純化得到13株疑似菌株。

圖1 革蘭氏染色（左，1 000×）與透射電鏡（右，5 000×）Fig.1 Gram staining（left，1 000×）and transmission electron microscopy（right，5 000×）

2.2 副豬嗜血桿菌的PCR鑒定

采用PCR的方法檢測(cè)副豬嗜血桿菌的高度保守基因，結(jié)果顯示，13株細(xì)菌均能擴(kuò)增得到275 bp的條帶（圖2），與預(yù)期條帶大小相符，證實(shí)該13株疑似菌株均為副豬嗜血桿菌，檢出率為11.40%（13/114）。

圖2 13株副豬嗜血桿菌的16S rRNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of HPS 16S rRNA

2.3 血清型鑒定結(jié)果

采用15 對(duì)HPS 分型引物同時(shí)對(duì)上述13 株副豬嗜血桿菌分離株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，除5 株未顯示條帶不可分型（NT）外，其余菌株的擴(kuò)增結(jié)果分別為血清5型1株（目的條帶560 bp，圖3），血清11型1 株（目的條帶890 bp，圖4）和血清13 型6 株（目的條帶840 bp，圖5），NT、5 型、11 型、13 型的占比分別為38.46%（5/13）、7.69%（1/13）、7.69%（1/13）、46.15%（6/13）。

圖3 血清5型的PCR鑒定結(jié)果Fig.3 PCR identification of HPS serotype 5

圖4 血清11型的PCR鑒定結(jié)果Fig.4 PCR identification of HPS serotype 11

圖5 血清13型的PCR鑒定結(jié)果Fig.5 PCR identification of HPS serotype 13

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

13 株副豬嗜血桿菌對(duì)17 種抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示（圖6），菌株對(duì)不同抗生素的敏感性存在較大差異。13株分離株對(duì)氧氟沙星和大部分頭孢類抗生素具有很強(qiáng)的敏感性，敏感率可達(dá)100%（13/13）。對(duì)妥布霉素、氨曲南和頭孢他啶也有很好的敏感性，敏感率達(dá)92.31%（12/13）。同樣是β-內(nèi)酰胺類抗生素，13 株分離株對(duì)哌拉西林和氨芐西林的敏感性明顯下降，耐藥率分別達(dá)到46.15%（6/13）和61.54%（8/13）；對(duì)鏈霉素和麥迪霉素的耐藥率最高，均達(dá)到69.23%（9/13）。

多重耐藥性分析結(jié)果顯示（表1），1 株分離株不耐藥，2 株耐受2 種，4 株耐受3種，5 株耐受4 種，1 株耐受6 種，無(wú)單一耐藥菌株；共呈現(xiàn)10種耐藥譜。

圖6 抗生素耐藥試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Antibiotic resistance results

表1 HPS菌株的多重耐藥性情況分析Tab.1 Analysis of multi-drug resistance of HPS isolates

3 討論

副豬嗜血桿菌是條件性致病菌，通常定植在豬鼻腔、扁桃體和氣管前段等上呼吸道表面，不引起臨床癥狀[2]。以往副豬嗜血桿菌病的發(fā)生與飼養(yǎng)管理密切相關(guān)，例如寒冷、濕熱、氨氣濃度過(guò)高、斷奶、轉(zhuǎn)群、去勢(shì)或疫苗接種等常見(jiàn)應(yīng)激情況，因此多呈散發(fā)[8]。但是隨著養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)模式的快速轉(zhuǎn)變和免疫抑制性病毒（豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒、豬流感病毒等）的出現(xiàn)，副豬嗜血桿菌病成為常見(jiàn)的危害嚴(yán)重的豬呼吸系統(tǒng)疾病之一[8]。自2006 年發(fā)生高熱病以來(lái)，臨床上副豬嗜血桿菌病常以繼發(fā)病毒感染或混合病毒感染存在，加重了病豬的臨床癥狀和病理變化[6]。因此，副豬嗜血桿菌病的發(fā)生意味著豬場(chǎng)管理方面存在問(wèn)題或豬場(chǎng)發(fā)生免疫抑制性病毒感染，豬群免疫能力下降所致[8]。

疫苗免疫接種是預(yù)防副豬嗜血桿菌病最有效的方式[6]。副豬嗜血桿菌的血清型種類較多，不同地區(qū)、不同豬場(chǎng)其流行菌株的血清型存在差異，而且不同血清型之間缺乏交叉免疫保護(hù)[6]。本研究在表觀健康豬群中分離出13 株副豬嗜血桿菌，經(jīng)過(guò)分型，發(fā)現(xiàn)血清13 型占比最高，為優(yōu)勢(shì)血清型，其次是NT型、血清5 型、血清11 型。2014 年華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心對(duì)全國(guó)21 個(gè)省市送檢的12 452 份臨床病料進(jìn)行細(xì)菌分離和鑒定，從中分離到致病菌3 926 株，其中副豬嗜血桿菌占比22.49%，優(yōu)勢(shì)血清型為血清4型、5型和13型[15]。2017—2018年河南省規(guī)?；i場(chǎng)流行的優(yōu)勢(shì)菌株為血清5型、7型和4型[13]。2008—2017 年安徽地區(qū)副豬嗜血桿菌的主要流行血清型為4 型和13 型[11]，可見(jiàn)血清型流行情況具有明顯的地方特征性。因此，做好豬場(chǎng)流行菌株的血清型檢測(cè)、選擇對(duì)型的疫苗株，是防控該病的關(guān)鍵。有條件的規(guī)?；i場(chǎng)有必要對(duì)本場(chǎng)豬群抗體定期監(jiān)測(cè)和評(píng)估，并盡可能選擇與本場(chǎng)主要流行血清型相符合的疫苗進(jìn)行合理免疫，以增強(qiáng)保護(hù)力[15]。

抗菌藥物的使用是控制副豬嗜血桿菌病最有效的手段[6]。由于長(zhǎng)期、廣泛和不合理使用抗菌藥，豬群對(duì)抗菌藥物的依賴性不斷增加，導(dǎo)致臨床上副豬嗜血桿菌的耐藥菌株頻繁產(chǎn)生、耐藥譜日益擴(kuò)大[4]。目前，副豬嗜血桿菌在我國(guó)主要對(duì)磺胺類、β-內(nèi)酰胺類和喹諾酮類藥物較敏感，而對(duì)氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類藥物有一定的抵抗力，且極易產(chǎn)生耐藥性[6]。此次分離的13株副豬嗜血桿菌的耐藥性結(jié)果與上述結(jié)論一致：菌株對(duì)氨基糖苷類（卡那霉素、鏈霉素）、大環(huán)內(nèi)酯類（麥迪霉素）耐藥率較高，而對(duì)喹諾酮類（氧氟沙星）和β-內(nèi)酰胺類，尤其是頭孢類抗菌藥敏感率可達(dá)100%。耐藥性分析是選擇有效藥物的基本依據(jù)[11]，本研究為江西地區(qū)規(guī)模化豬場(chǎng)選擇科學(xué)有效的抗菌藥物來(lái)防控副豬嗜血桿菌感染提供了科學(xué)依據(jù)。

細(xì)菌性疾病的防控是一個(gè)結(jié)合抗生素治療、疫苗免疫和良好管理等的綜合過(guò)程[16]。目前對(duì)于副豬嗜血桿菌病的防控應(yīng)堅(jiān)持防重于治、防治結(jié)合的原則，生物安全措施是防控副豬嗜血桿菌病發(fā)生的關(guān)鍵[6]。作為條件致病菌，該病的發(fā)生與飼養(yǎng)管理息息相關(guān)，因此要從源頭進(jìn)行控制，找出病因并改善飼養(yǎng)條件，從營(yíng)養(yǎng)因素、環(huán)境衛(wèi)生、規(guī)范生產(chǎn)、消毒、疫苗接種等角度提高豬群免疫力，從而有效地預(yù)防該病發(fā)生[17]。有條件的豬場(chǎng)可以考慮定期通過(guò)實(shí)驗(yàn)室分離具有代表性的致病菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[16]。一旦發(fā)病，選擇敏感藥物合理治療，避免出現(xiàn)治療過(guò)程出現(xiàn)費(fèi)事費(fèi)力、成本高且易產(chǎn)生耐藥性等情況。