脅迫馴化及常壓室溫等離子體復(fù)合誘變選育丁醇高產(chǎn)菌株

劉孟熒，羅壹艷，黃小倩，周智友，李 志，李漢廣

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院/江西農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用微生物研究所/江西農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室/江西省菌物資源保護與利用重點實驗室，江西南昌 330045）

【研究意義】以可再生資源生產(chǎn)能源物質(zhì)是解決當(dāng)前化石燃料儲量逐年減少及環(huán)境惡化的重要手段之一。丁醇作為繼乙醇之后的又一新型生物燃料，因其高燃燒值、低腐蝕性、燃燒特性與汽油相似等優(yōu)勢，使其在生物燃料領(lǐng)域的發(fā)展?jié)摿σ堰h超乙醇[1-2]，因此加強對丁醇發(fā)酵的研究具有重要的現(xiàn)實意義?！厩叭搜芯窟M展】生物丁醇距今已有上百年歷史。在20 世紀80 年代以前，丁醇發(fā)酵是僅次于乙醇發(fā)酵的第二大發(fā)酵工業(yè)。然而隨著石油產(chǎn)業(yè)的快速崛起，利用化學(xué)合成法生產(chǎn)丁醇在價格上占據(jù)了優(yōu)勢，從而逐步取代了發(fā)酵法。近年來隨著各國對環(huán)境保護意識的不斷加強，開發(fā)環(huán)境友好型能源成為未來經(jīng)濟發(fā)展的必然趨勢，因此發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇再次成為生物質(zhì)能源領(lǐng)域的研究熱點。傳統(tǒng)丁醇發(fā)酵常采用梭狀芽孢桿菌作為生產(chǎn)菌株，其中，以丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）和拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）最為常見[3-5]。然而發(fā)酵產(chǎn)物（丁醇）對生產(chǎn)菌株具有較強的生物學(xué)毒性，常常導(dǎo)致其發(fā)酵結(jié)束后出現(xiàn)低產(chǎn)物濃度及低產(chǎn)率現(xiàn)象，因此提高生產(chǎn)菌株的發(fā)酵性能是增強其產(chǎn)業(yè)化的重要途徑之一。近年來，利用人工育種、組學(xué)技術(shù)等方法對生產(chǎn)菌株進行改良已成為獲得優(yōu)良菌株的常用方法，如Matsusako 等[5]以異丁醇作為選擇壓力對Synechocystissp.PCC6803 進行定向馴化，獲得的突變菌株對各醇類均具有較強的抗逆性，其發(fā)酵性能與原始菌株相比也有很大提高。【本研究切入點】目前，丁醇生產(chǎn)菌株的發(fā)酵產(chǎn)物主要為乙醇、丙酮、丁醇，其質(zhì)量比約為1:3:6。其中，副產(chǎn)物的高占比嚴重降低了底物轉(zhuǎn)化效率，同時增加了后期分離成本。另一方面，丁醇生產(chǎn)菌株雖具有較廣泛的底物利用能力，如可利用已糖、戊糖及多糖進行溶劑生產(chǎn)，但在混糖發(fā)酵過程中，由于葡萄糖阻遏效應(yīng)，仍存在戊糖代謝能力不足等問題，從而導(dǎo)致原料利用率降低，甚至影響丁醇發(fā)酵的進程；而且木糖作為纖維水解液中第二大可發(fā)酵單糖，若能減少葡萄糖阻遏效應(yīng)，增強菌株對木糖的利用能力，對于木質(zhì)纖維素丁醇發(fā)酵過程具有重要意義[6-7]。因此篩選出可同步利用混糖發(fā)酵的高丁醇占比生產(chǎn)菌株對于丁醇發(fā)酵的工業(yè)化應(yīng)用具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為選育出可同步利用混糖發(fā)酵的高丁醇占比生產(chǎn)菌株，本文采用實驗室自行設(shè)計的“三明治”篩選方法對收集的樣品進行初步篩選，以獲取高丁醇占比菌株，然后對其中發(fā)酵性能最好的菌株進行脅迫馴化及常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）復(fù)合誘變，同時對原始菌株及突變菌株的發(fā)酵性能進行初步研究，以期為其工業(yè)化應(yīng)用提供一些有益的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本試驗土樣采自南昌江紅釀造廠及其附近土壤，牛糞樣品采自南昌市屠宰廠，每份樣品約10 g，采集完成后將樣品置于無菌密封袋內(nèi)封存，標記采樣時間、地點等信息，于4 ℃冰箱保存，并盡快進行篩選分離。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基[8]：取新鮮土豆，將其切成大小為0.2 cm3左右的土豆塊莖，于4 ℃條件下儲藏備用。

分離純化培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，可溶性淀粉40 g，胰蛋白胨6 g，酵母浸粉2 g，乙酸銨3 g，磷酸氫二鉀0.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，七水合硫酸亞鐵0.01 g，結(jié)晶硫酸鎂0.2 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 自然，121 ℃滅菌20 min。

篩選培養(yǎng)基：在分離純化培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加8～10 g/L丁醇及0.02 g/L刃天青。

發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源（葡萄糖、木糖或混糖）60 g，胰蛋白胨6 g，酵母浸粉2 g，乙酸銨3 g，磷酸氫二鉀0.5 g，七水合硫酸亞鐵0.01 g，一水合硫酸錳0.01 g，結(jié)晶硫酸鎂0.2 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

1.3 篩選方法

1.3.1 富集培養(yǎng) 利用實驗室自行設(shè)計的“三明治”篩選方法進行富集培養(yǎng)[8]，具體試驗步驟如下：稱取2～3 g樣品，以一層樣品一層土豆塊莖的方式，將其放置于厭氧瓶中（裝樣高度約為厭氧瓶的2/3）。然后加入20 mL 10 g/L異丁醇，浸沒樣品及土豆塊莖。裝瓶完成后，將厭氧瓶置于100 ℃沸水浴中熱激120 s，以殺死部分營養(yǎng)細胞，待其冷卻后，于37 ℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)2～3 d。

1.3.2 菌株的分離純化 由于丁醇生產(chǎn)菌株在發(fā)酵過程中會生產(chǎn)大量H2和CO2，因此在富集培養(yǎng)過程中若有丁醇產(chǎn)生菌出現(xiàn)定會大量產(chǎn)氣并出現(xiàn)醪蓋現(xiàn)象。根據(jù)這一特點，將大量產(chǎn)氣并出現(xiàn)醪蓋現(xiàn)象的厭氧瓶挑出，吸取1 mL樣液以10倍稀釋法進行平板涂布，37 ℃厭氧培養(yǎng)40～48 h。

1.3.3 丁醇生產(chǎn)菌的可視化篩選 由于丁醇高產(chǎn)菌株一般具有較高的丁醇耐受性及較強的氧化還原力[9]。因此，向分離純化培養(yǎng)基中加入一定量的丁醇及刃天青，可根據(jù)菌落及褪色圈大小，篩選出具有高丁醇耐受性及強氧化還原力的發(fā)酵菌株。

1.4 丁醇脅迫馴化

丁醇脅迫馴化試驗采用劉小波等[10]所建立的方法，其具體步驟如下：取0.5 mL 對數(shù)生長期的細胞置于25 mL厭氧管中，加入4.5 mL不同濃度丁醇溶液作為脅迫因子，搖勻密封后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中，浸泡處理。利用分光光度計測定浸泡液吸光值（OD600），待其OD600達到1.0后，取浸泡樣液稀釋涂布于篩選平板。選取菌落及退色圈較大的單菌落進行ABE 發(fā)酵，連續(xù)進行傳代，在每一次傳代過程中，取溶劑產(chǎn)量前3名的菌株，進行下一輪次馴化；在馴化過程中，每次試驗都應(yīng)設(shè)置上一濃度梯度作為馴化試驗的對照組，當(dāng)馴化至某一濃度菌體出現(xiàn)生長半停滯或不生長時，返回上一濃度進行重新馴化，若三輪次該濃度馴化均無明顯差異，則停止馴化。

1.5 ARTP誘變處理

1.5.1 菌懸液制備 取對數(shù)期發(fā)酵液8 000 r/min離心15 min，離心完成后棄去上清液，用50 mmol/L PBS緩沖液將細胞濃度稀釋至106～107CFU/mL，于4 ℃條件下儲藏備用[11]。

1.5.2 ARTP 誘變 取10μL 菌懸液進行誘變處理，工作電壓120 v，照射距離2 mm，氣體流量15 L/min，誘變時間設(shè)置為40、80、120、160、200、240 s，誘變完成后用少量無菌水將菌株洗脫至EP 管中，稀釋涂布于篩選平板，選取菌落及褪色圈較大的單菌落進行發(fā)酵培養(yǎng)，同時計算致死率及突變率。其中，將丁醇產(chǎn)量高于原始菌株5%以上的突變菌株定義為正突變菌株，丁醇產(chǎn)量低于原始菌株5%以上的定義為負突變菌株[12]，兩者的計算公式如下：

1.6 測定方法

1.6.1 還原糖含量測定 采用雙波長Douglas比色法測定還原糖含量[13]，測定波長550 nm，參比波長425 nm。

1.6.2 溶劑（乙醇、丙酮、丁醇）含量測定 取1 mL 發(fā)酵液于10 000 r/min 條件離心10 min，上清液與1.21 g/L 異丁醇（異丁醇作為內(nèi)標）按1:4 比例混勻，用于氣相檢測。色譜柱條件如下：PEG20M 毛細管柱（30 m×0.32 mm×0.4μm），進樣溫度：240 ℃，檢測器溫度：240 ℃，柱溫：90 ℃，以氮氣作載氣，進樣量1μL[8]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選

利用實驗室自行設(shè)計的“三明治”篩選方法，從28份土樣中共獲得5株丁醇生產(chǎn)菌株，為進一步探究篩選所得菌株對單糖及混糖的利用情況，分別以葡萄糖、木糖及混糖（木糖∶葡萄糖=1∶2）作為發(fā)酵原料，各菌株發(fā)酵的最終結(jié)果如表1所示。

表1 篩選菌株不同碳源條件下的丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量Tab.1 The production of butanol and total solvent from different carbon sources by screening strains

由表1 可知，在以葡萄糖為底物進行發(fā)酵時，菌株A3 丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量最高，可達到7.93 g/L 和11.47 g/L，丁醇占比為69.2%，但其對木糖利用能力較差，發(fā)酵同等濃度木糖僅產(chǎn)生3.62 g/L丁醇；相比之下，菌株L8 對木糖利用能力與葡萄糖基本相當(dāng)，發(fā)酵同等濃度木糖可產(chǎn)生7.13 g/L 丁醇和8.35 g/L 總?cè)軇?，同時在混糖條件下丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量波動較小，丁醇占比較大，可達到總?cè)軇┝康?5%以上。

在丁醇發(fā)酵的三種主要產(chǎn)物中，以丁醇目前的市場價格最高，約為12 000 元/t，乙醇和丙酮的市場價格約為85 000 元/t和5 000 元/t[14]。由于傳統(tǒng)丁醇發(fā)酵過程中副產(chǎn)物占比高達到40%，使得底物轉(zhuǎn)化效率嚴重降低，從而增加了生產(chǎn)成本。因此，獲取具有高丁醇占比的溶劑生產(chǎn)菌株，對于提高生物丁醇經(jīng)濟競爭力具有重要意義。與其它篩選菌株相比，菌株L8 發(fā)酵性能更優(yōu)，因此將其作為目的菌株進行后續(xù)試驗。

2.2 分子生物學(xué)鑒定

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，微生物分類及鑒定由表觀層面深入至基因?qū)用?，人們開始在基因水平上研究微生物種群的親緣關(guān)系[15]。在眾多檢測基因中，16S rDNA存在于所有細菌染色體中，并具有高度的保守性及高變性，利用其可變區(qū)序列的差異可對不同種屬細菌進行分類鑒定。因此，對未知細菌進行16S rDNA測序已成為細菌鑒定的一個重要依據(jù)[16-17]。

為進一步了解菌株L8 的種屬特性，將其送至南昌市科暢生物科技有限公司進行16S rDNA 測序，測序完成后將結(jié)果與GENEBANK 數(shù)據(jù)庫中的BLAST 軟件進行相似性比對，發(fā)現(xiàn)菌株L8 與Clostridium bei?jerinckiiCP23-KKU相似性達到99%，下載相似性較高序列，利用Mega5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其結(jié)果如圖1所示。結(jié)合菌株L8發(fā)酵及生理生化特性，最終確定菌株L8為拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）。

圖1 基于菌株L8 16S rDNA序列同源性構(gòu)建的進化樹Fig.1 Phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA sequence homology of strain L8

2.3 菌株L8對混糖為底物的發(fā)酵利用情況

當(dāng)前可用于丁醇發(fā)酵生產(chǎn)的廉價底物主要有木質(zhì)纖維[6-7]、粗甘油[18]、海洋藻類[19-20]等。其中，木質(zhì)纖維作為自然界中分布最廣，含量最為豐富的可再生資源之一，其水解產(chǎn)物主要由己糖、戊糖及二糖等混合糖組成。盡管不同纖維水解液中糖組分及含量各不相同，但葡萄糖和木糖仍是木質(zhì)纖維水解液中主要碳源[21-23]。為探究菌株L8 利用不同木質(zhì)纖維水解液進行丁醇發(fā)酵的可行性，本試驗利用含不同濃度葡萄糖及木糖的混糖發(fā)酵液來模擬水解液中碳源組成，將木糖與葡萄糖的比例分別設(shè)置為1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1，觀察菌株L8對其利用情況，結(jié)果如表2所示。

表2 菌株L8在不同混糖條件下的溶劑產(chǎn)量Tab.2 Solvent production from different mixed sugar by strain L8

由表2 可知，在初始糖濃度不變的條件下，混糖發(fā)酵中單糖比例的改變對發(fā)酵產(chǎn)物并無明顯影響。通過殘?zhí)侵心咎桥c葡萄濃度可看出，不同于Raganati 等[24]報道中所提出的只有當(dāng)葡萄糖濃度降至15 g/L以下時，菌體才能實現(xiàn)對木糖的利用，菌株L8在木糖與葡萄糖比例高達1∶3時，木糖利用亦未受阻，發(fā)酵結(jié)束后基本無木糖殘留。

在混糖發(fā)酵過程中，由于葡萄糖阻遏效應(yīng)的存在，溶劑生產(chǎn)菌株往往無法同時利用葡萄糖和木糖進行發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵結(jié)束后木糖的大量殘留會造成了嚴重的底物浪費。而通過觀察菌株L8 對不同比例混糖的利用情況可發(fā)現(xiàn)，菌株L8 對不同混糖比的適應(yīng)性較高，即使在葡萄糖濃度高于木糖濃度的發(fā)酵液中，也能實現(xiàn)對木糖的有效利用。由于木糖與葡萄糖比為1∶2 時，發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)菨舛茸畹停〈技翱側(cè)軇┊a(chǎn)量最高，可達到7.87 g/L 和9.23 g/L。因此，最終確定以木糖與葡萄糖比為1∶2 的混糖比進行后續(xù)試驗。

2.4 丁醇脅迫馴化

在眾多育種技術(shù)中，適應(yīng)性實驗室進化（adaptive laboratory evolution，ALE）是為數(shù)不多的無需大型儀器設(shè)備參與的育種技術(shù)之一，其主要通過給予適當(dāng)選擇壓力，利用菌株自發(fā)突變，來達到育種目的，相對其他育種技術(shù)而言，具有操作簡便、定向性強等優(yōu)勢[25]。由于丁醇發(fā)酵過程中，其主要產(chǎn)物丁醇對細胞的毒性最大，當(dāng)丁醇濃度達到20 g/L 時細胞即停止生長[26]。因此，為提高菌株L8的丁醇耐受性及溶劑產(chǎn)量，采用逐級提高丁醇浸泡濃度的馴化方法來處理菌株，初始浸泡濃度設(shè)為10 g/L，按5 g/L 的梯度逐級增加至30 g/L，其每輪次馴化后的丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量見表3。

表3 不同濃度丁醇馴化處理后的溶劑產(chǎn)量比較Tab.3 Comparision of solvent production with different butanol concentration immersion

由表3 可知，逐級提高丁醇浸泡濃度在一定程度上可提高菌株溶劑產(chǎn)量。當(dāng)丁醇浸泡濃度達到25 g/L 時，馴化菌株X8-4 丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量最高，可達到8.64 g/L 和9.99 g/L，較原始菌株分別提高了15.8%及14.6%；而當(dāng)丁醇浸泡濃度提高至30 g/L 時，馴化菌株溶劑產(chǎn)量并無明顯變化，其可能原因是丁醇脅迫馴化雖可模擬生物進化進程，但其對菌株突變頻率的干預(yù)較為有限。通過本次試驗最終確定將菌株X8-4作進一步研究之用。

2.5 ARTP誘變

2.5.1 誘變時間的確定 與傳統(tǒng)物理誘變技術(shù)相比，ARTP誘變技術(shù)可直接對細胞懸液進行處理，有效避免了誘變過程中因抽真空造成的細胞損傷；同時，由于可引起DNA的多種修復(fù)機制，產(chǎn)生豐富的位點錯配，致使ARTP誘變具有更高的突變率[27-28]。本節(jié)試驗為確定最佳誘變時間，以丁醇馴化后的菌株X8-4作為出發(fā)菌株進行ARTP誘變處理，輻照時間分別為40、80、120、160、200、240 s，其具體誘變結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同處理時間下菌株致死率及突變率Fig.2 Mutation rate and lethality by atmospheric and room temperature plasma

圖3 ARTP誘變高產(chǎn)菌株丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量Fig.3 The production of butanol and total solvent by mutant strains

由圖2可知，菌株致死率與處理時間存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，致死率隨處理時間的增加而增加。當(dāng)處理時間為160 s和200 s時，致死率分別為92.3%和96.5%，當(dāng)處理時間達到240 s時，致死率達到100%；另一方面，當(dāng)處理時間在40～160 s時，菌株正突變率隨誘變時間的增加而增加，當(dāng)處理時間在120～160 s時，菌株正突變率高于負突變率，當(dāng)誘變時間為160 s時，正突變率最高，達到5.3%。而隨著處理時間的繼續(xù)增加，菌株正突變率開始下降。綜合考慮菌株致死率及突變率等因素，最終確定最佳誘變時間為160 s。

2.4.2 誘變菌株的選育 將誘變處理后的菌懸液稀釋涂布于篩選平板中，此平板中已加入不同濃度丁醇及刃天青（常作為厭氧培養(yǎng)中的氧化還原指示劑），因此，在此平板上長出菌株的菌落越大說明其丁醇耐受能力越高，同時若褪色圈越大，說明其還原力越強，這樣的菌株一般具有較強的丁醇生產(chǎn)能力，為此，選取菌落及褪色圈較大的單菌落進行發(fā)酵試驗，發(fā)酵結(jié)束后其丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量如圖3所示。

由圖3 可知，經(jīng)誘變處理后，共出現(xiàn)33 個褪色圈較大的單菌落，將它們分別挑出接入發(fā)酵培養(yǎng)中進行發(fā)酵試驗。結(jié)果表明大部分突變菌株的溶劑產(chǎn)量高于出發(fā)菌株。其中，菌株Y10 丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量最高，可達到10.51 g/L 和12.16 g/L，較出發(fā)菌株分別提高了21.6%和21.7%，較原始菌株分別提高了40.9%和39.4%。因此，選取突變菌株Y10作為進一步研究菌株。

2.4.3 突變菌株遺傳穩(wěn)定性實驗 良好的遺傳穩(wěn)定性是所有發(fā)酵菌株應(yīng)具備的基本條件之一。為驗證突變菌株Y10遺傳穩(wěn)定性，對其進行10次傳代培養(yǎng)，其每代溶劑產(chǎn)量見表4。

表4 誘變菌株遺傳穩(wěn)定性試驗Tab.4 Inheritance stability of mutant strain Y10

由表4可知，經(jīng)10次傳代培養(yǎng)后，第10代菌株丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量分別為10.26 g/L和11.81 g/L，較第一代僅分別下降了2.5%和2.9%；同時，在10次傳代培養(yǎng)過程中，丁醇及總?cè)軇┑钠骄a(chǎn)量分別為10.36 g/L和11.96 g/L，與第一代相比僅分別下降了1.6%和1.6%。雖然在10 次傳代培養(yǎng)過程中，菌株丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量略有下降，但總體而言菌株發(fā)酵性能并無明顯變化。因此，從試驗所得結(jié)果可知菌株Y10遺傳穩(wěn)定性能良好。

2.6 原始菌株L8與突變菌株Y10發(fā)酵性能比較

2.6.1 糖利用速率 為進一步研究原始菌株L8 與突變菌株Y10 對不同碳源的利用情況，將其分別接種于葡萄糖、木糖及混糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，研究發(fā)酵過程中碳源的消耗動力學(xué)情況，其結(jié)果如圖4所示。

圖4 原始菌株L8與突變菌株Y10糖利用情況Fig.4 Utilization of different sugarsbyoriginal strain L8 and mutant strain Y10

由圖4可知，三種碳源條件下突變菌株糖利用速率均高于原始菌株。在以單糖為底物發(fā)酵時，突變菌株Y10 對葡萄糖和木糖的利用速率分別為0.60 g/（L·h）和0.58 g/（L·h），較原始菌株分別提高了28.2%和31.8%。同時，葡萄糖利用速率略高于木糖，該結(jié)果與Ezeji等[30]實驗結(jié)果基本一致；而在以混糖為底物發(fā)酵時，其試驗結(jié)果與Ounine等[31]所提出的只有當(dāng)葡萄糖基本耗盡后菌株方可啟動對木糖的利用這一結(jié)論不一致，具體情況是原始菌株L8和突變菌株Y10對木糖的利用均未受葡萄糖影響，木糖與葡萄糖可在發(fā)酵過程中被同步利用。其中，混糖條件下突變菌株Y10對木糖利用速率為0.26 g/（L·h），葡萄糖利用速率為0.35 g/（L·h），總糖利用速率為0.61 g/（L·h），其混糖發(fā)酵的糖利用速率與單糖發(fā)酵基本一致。

2.6.2 溶劑產(chǎn)量 溶劑產(chǎn)量是反應(yīng)菌株發(fā)酵性能最直觀的指標之一，將原始菌株L8 與突變菌株Y10 分別接種于葡萄糖、木糖及混糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，每隔6 h取樣測定其溶劑產(chǎn)量，結(jié)果如圖5所示。

圖5 原始菌株L8與突變菌株Y10在不同碳源條件下的溶劑產(chǎn)量Fig.5 Solvent production by original strain L8 and mutant strain Y10 under different carbon sources

由圖5 可知，突變菌株Y10 利用混糖為底物進行發(fā)酵時，其丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量可達到10.35 g/L 和11.92 g/L，較原始菌株分別提高了38.6%和33.5%；且不論是原始菌株L8 還是突變菌株Y10 其混糖發(fā)酵的溶劑產(chǎn)量均略高于單糖發(fā)酵的溶劑產(chǎn)量，該現(xiàn)象在工程大腸桿菌生產(chǎn)D-葡萄糖二酸中也存在[32]，且張杰等[33]在對拜氏梭菌S3進行發(fā)酵研究時發(fā)現(xiàn)，其混糖發(fā)酵的溶劑產(chǎn)量也略高于葡萄糖發(fā)酵的溶劑產(chǎn)量；另一方面，混糖發(fā)酵過程中，突變菌株Y10的丁醇得率及生產(chǎn)強度可達到0.23 g/g和0.14 g/（L·h），較原始菌株分別提高了10.8%和40%，該試驗結(jié)果進一步證明適應(yīng)性實驗室進化及ARTP誘變是一種提高菌種發(fā)酵性能的有效手段，因此，本試驗結(jié)果可為通過該方法獲得更多優(yōu)良生產(chǎn)菌株提供有益參考。

3 結(jié)論

本試驗采用自行設(shè)計的“三明治”篩選方法，從28份樣品中共篩選出5株丁醇生產(chǎn)菌株。其中，菌株L8 在單糖及混糖發(fā)酵過程中，溶劑產(chǎn)量波動較小且丁醇占比較大，為進一步確定菌株種屬特性，對其進行了16S rDNA 分子鑒定，最終確定為拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）。然后采用丁醇脅迫馴化及ARTP 誘變技術(shù)對菌株L8 進行復(fù)合誘變處理，并結(jié)合理性篩選模型獲得了高產(chǎn)突變菌株Y10，經(jīng)遺傳穩(wěn)定性試驗表明突變菌株溶劑產(chǎn)量較為穩(wěn)定。在混糖發(fā)酵過程中，突變菌株Y10 丁醇得率及生產(chǎn)強度可達到0.23 g/g和0.14 g/（L·h），與原始菌株相比分別提高了10.8%和40%。本試驗所獲得的丁醇生產(chǎn)菌株豐富了丁酵發(fā)酵的菌種普系，所采用的復(fù)合誘變方法及理性篩選模型可為其它試驗或工業(yè)生產(chǎn)中快速獲得優(yōu)良生產(chǎn)菌株提供有益的參考。

木糖作為纖維水解液中第二大可發(fā)酵單糖，若能減少葡萄糖阻遏效應(yīng)，增強菌株對木糖的利用能力，對于丁醇發(fā)酵過程中木質(zhì)纖維素的利用具有重要意義。Jiang 等[34]在研究Clostridium acetobutylicumATCC824對混糖的利用情況時發(fā)現(xiàn)，外源調(diào)控發(fā)酵過程中pH 值可使菌株對木糖的利用率由11.5%提高至31.5%。與之相比，突變菌株Y10 在無外源調(diào)控pH 值的條件下，仍能穩(wěn)定利用木糖進行發(fā)酵生產(chǎn)，同時對混糖發(fā)酵的適應(yīng)性較高，能實現(xiàn)葡萄糖和木糖的同步利用，且菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性，說明突變菌株Y10在利用木質(zhì)纖維生產(chǎn)丁醇方面具有較大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>