精子DNA碎片率和精液常規(guī)參數(shù)與年齡的相關(guān)性研究

陳亞強(qiáng)　吳成亮　邢夢(mèng)雪

[摘要] 目的 分析男性不育患者年齡與精子DNA碎片率和精液常規(guī)參數(shù)的相關(guān)性。 方法 選擇2018年1～12月在本院男科就診的患者725例，按照年齡將患者分為三組。20～29歲組（n=229），30～39歲組（n=371），40～49組（n=125），采用染色質(zhì)擴(kuò)散（SCD）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)精子DNA碎片率，按照《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第5版）中標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)精液常規(guī)各參數(shù)。分析精子DNA碎片率（DNA fragmentation index，DFI）和精子參數(shù)在各組的差異及年齡與精子DNA碎片率和精液參數(shù)的相關(guān)性。 結(jié)果 年齡與DFI之間存在正相關(guān)關(guān)系（r=0.273，P<0.01），與精子活力（r=-0.131，P<0.01）、精液pH（r=-0.080，P<0.05）之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，與精子濃度之間的相關(guān)性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。精液pH與精子濃度之間存在正相關(guān)關(guān)系（r=0.285，P<0.05）。 結(jié)論 伴隨著男性年齡的增長(zhǎng)，精子的活力會(huì)降低，并使男性的生育力下降以及對(duì)子代產(chǎn)生不良影響，精子DFI與精液常規(guī)各參數(shù)無相關(guān)性。故精子DNA碎片檢測(cè)可作為精液常規(guī)分析的補(bǔ)充，進(jìn)一步反映男性的生育能力。

[關(guān)鍵詞] 男性不育;年齡;精子DNA碎片;精液常規(guī)參數(shù)

[中圖分類號(hào)] R698.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2020）25-0033-04

A study of the correlation between age and sperm DNA fragmentation index and the routine semen parameters

CHEN Yaqiang1? ?WU Chengliang1? ?XING Mengxue2

1.Department of Assisted Reproduction， Maternal and Child Health Hospital of Jiujiang in Jiangxi Province， Jiujiang 332000， China; 2.Department of Clinical Laboratory， Maternal and Child Health Hospital of Jiujiang in Jiangxi Province， Jiujiang? ?332000， China

[Abstract] Objective To analyze the correlation between the age of male infertile patients and sperm DNA fragmentation index（DFI） and the routine parameters of semen. Methods 725 patients treated in Department of Andrology of our hospital from January to December 2018 were selected and divided into three groups according to their age. For the group at the age of 20-29（n=229）， the group at the age of 30-39（n=371）， and the group at the age of 40-49（n=125）， the sperm DFI was detected through sperm chromatin dispersion（SCD） test， and the various routine semen parameters were detected according to the standards in "WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen"（The 5th Edition）. The differences of sperm DFI and sperm parameters among the groups and the correlation between age and sperm DFI and the semen parameters were analyzed. Results There was a positive correlation between age and DFI（r=0.273， P<0.01）， and a negative correlation between age and sperm motility（r=-0.131， P<0.01）， age and the semen pH（r=-0.080， P<0.05）， and the difference in the correlation between age and sperm concentration was statistically insignificant. There was a positive correlation between the semen pH and sperm concentration（r=0.285， P<0.05）. Conclusion With the increase of the age of men， sperm motility may decrease， affecting male fertility. Sperm DFI has no correlation with the various routine semen parameters. Therefore， the detection of sperm DNA fragments test can be used as a supplement to routine semen analysis， further reflecting the male fertility.

[Key words] Male infertility; Age; Sperm DNA fragment; Routine semen parameters

據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，近年來不孕不育癥患者增加，其中男性的比例占一半左右[1-2]，男性的年齡對(duì)生育和子代的影響越來越得到關(guān)注。有研究認(rèn)為年齡與男性生育后代的兒童癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及自閉癥相關(guān)[3-5]。精液的常規(guī)檢查已經(jīng)不能滿足臨床需求，約有15%男性精液常規(guī)分析結(jié)果正常仍不育[6]。隨著科學(xué)的進(jìn)步，遺傳物質(zhì)的完整性對(duì)生物的發(fā)育影響逐漸被人們重視。精子DNA碎片率可反映遺傳物質(zhì)的完整性或損傷程度，精子DNA碎片率增加會(huì)導(dǎo)致IVF受精率下降和胚胎發(fā)育異常增加[7-10]，從而降低臨床妊娠率。同時(shí)也增加子代罹患認(rèn)知神經(jīng)疾病、常染色體顯性疾病、先天性疾病和其他疾病的風(fēng)險(xiǎn)[11]。本研究測(cè)定了725例男性患者精子DFI、精子濃度、精子活力和pH等參數(shù)，精子DFI和精液常規(guī)等多參數(shù)與年齡之間相關(guān)性分析，進(jìn)而研究年齡在男性生育能力和對(duì)子代的影響方面的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年1～12月來我院輔助生殖不孕不育科門診就診的患者中725例標(biāo)本，所有DNA碎片率結(jié)果的標(biāo)本。標(biāo)本均符合WHO實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（第5版）要求的精液結(jié)果。按照年齡分成20～29歲組（n=229）、30～39歲組（n=371）、40～49組（n=125）三個(gè)組。排除標(biāo)準(zhǔn)：由支原體、衣原體、細(xì)菌等病原微生物感染所導(dǎo)致精子質(zhì)量受到影響者;存在功能性、器質(zhì)性等原因不育者;最近1個(gè)月內(nèi)有使用過對(duì)精子功能產(chǎn)生影響的相關(guān)藥物進(jìn)行治療者;且三組中無性功能障礙史者;無睪丸、附睪、輸精管等生理和解剖異常問題者;無染色體缺失、重排、異位等異常及性激素紊亂者。禁欲天數(shù)都控制在2～7 d之內(nèi)，精液量完整，分組具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 精液常規(guī)? 所有患者均已禁欲2～7 d，以手淫法留取標(biāo)本于潔凈的一次性塑料容器中，液化后取4.5 μL，以江蘇瑞琪CFT-9202型精子質(zhì)量檢測(cè)分析系統(tǒng)進(jìn)行精液常規(guī)分析。每份標(biāo)本檢測(cè)兩次，每次觀察至少5個(gè)視野且大于200條精子。檢測(cè)各組精液的精子濃度、活力PR+NR級(jí)精子百分率等參數(shù)。

1.2.2 精液pH? 采用上海三愛思試劑有限公司生產(chǎn)精密試紙pH 5.5～9.0。

1.2.3 DFI檢測(cè)? 采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散法SCD（Sperm chromatin dispersion），由深圳華康生物科技有限公司生產(chǎn)的精子DNA碎片檢測(cè)試劑盒，該產(chǎn)品生產(chǎn)許可證編號(hào)：粵食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20030802號(hào)。實(shí)驗(yàn)操作：①室溫調(diào)整至20℃～28℃;試劑盒取出放置室溫平衡30～60 min。②將低熔點(diǎn)瓊脂糖管放入90℃～100℃水浴1～2 min至瓊脂糖凝膠完全熔解，然后將管子放置于37℃水箱至溫度恒定。③稀釋精子密度至5×106～10×106/mL，再吸取60 μL上述已經(jīng)稀釋的精子溶液加到已熔解低熔點(diǎn)瓊脂糖管中，充分混勻。冬天操作應(yīng)防止瓊脂糖凝固，操作應(yīng)迅速。④將含有精子的低熔點(diǎn)瓊脂糖懸浮液取出滴加到水平放置的預(yù)處理載玻片上，最好從一端緩緩蓋上蓋玻片，以避免產(chǎn)生多余氣泡。⑤將帶有上述瓊脂的載玻片置于2℃～8℃冰箱放置4～5 min，以使低熔點(diǎn)瓊脂糖完全凝固。從冰箱取出載玻片，移走蓋玻片。⑥將處理好后的載玻片沒入變性液中充分反應(yīng)，取出載玻片，浸泡在蒸餾水中;之后取出載玻片使其垂直放置，用吸水紙吸干表面多余水珠，勿接觸標(biāo)本區(qū)域;再將載玻片浸入裂解液中準(zhǔn)確反應(yīng)20 min。⑦反應(yīng)完畢后，將預(yù)處理載玻片浸入洗滌液，以除去多余裂解液。由于裂解液為有毒性物質(zhì)，此反應(yīng)中應(yīng)做好防護(hù)，如佩戴護(hù)目鏡、N95口罩、帽子等。之后取出依次浸入70%、90%、100%乙醇溶液中脫水。⑧讓預(yù)處理載玻片自然晾干。⑨用瑞氏染液進(jìn)行染色。將染色液A液與B液按等比倒在棕色玻璃瓶中進(jìn)行混合配制。水平放置預(yù)處理載玻片，將混勻好的染液加到玻片上，使其覆蓋滿整塊載玻片。染色后，看到表面覆蓋一層金黃色薄膜時(shí)，將染色后的載玻片以蒸餾水緩緩沖洗多次以便除去多余的染液殘?jiān)４涓稍锖笤?0倍普通光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。精子DNA碎片判定標(biāo)準(zhǔn)參照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[12]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各年齡組間的精液多種參數(shù)與DFI的比較

將全部725例符合要求的標(biāo)本納入研究，各組精子DFI、精子濃度、精子的活力、精液pH均數(shù)和方差總結(jié)表明，單因素方差分析顯示年齡與DFI、與精子活力、精液pH之間相關(guān)性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與精子濃度之間的相關(guān)性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 年齡、DFI和精液參數(shù)相關(guān)性分析

年齡與精子DFI相關(guān)性分析結(jié)果顯示，年齡與DFI之間存在正相關(guān)關(guān)系（r=0.273，P<0.01），與精子活力之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.131，P<0.01），與精液pH之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.080，P<0.05），與精子濃度之間的相關(guān)性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

精子DFI與精子各參數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果表明，精子DFI與精子濃度之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.083，P<0.05），與精子活力之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.359，P<0.01），與精液pH之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.049，P<0.05）。精液pH與精子濃度之間存在正相關(guān)關(guān)系（r=0.285，P<0.01），與精子活力之間存在正相關(guān)關(guān)系（r=0.082，P<0.05）。見表2。

3 討論

有研究表明[13-15]由于精子DNA作為遺傳信息的載體，遺傳信息的丟失會(huì)對(duì)自然生育或輔助生殖技術(shù)治療結(jié)局產(chǎn)生不良影響，并可能導(dǎo)致胎停、流產(chǎn)、生化妊娠等不良結(jié)局。精子在產(chǎn)生過程中某些程序出現(xiàn)異常，或者機(jī)體內(nèi)環(huán)境、體外環(huán)境發(fā)生改變等多種因素影響下，精子DNA均可能受到損害[16]。目前已知精子DNA損傷的因素[17-21]為：（1）精子發(fā)生過程中某些因素誘導(dǎo)細(xì)胞的非程序性凋亡，從而產(chǎn)生大量DNA結(jié)構(gòu)受損的精子，并且沒有得到及時(shí)清除，促使DFI升高;（2）精子易受自由基攻擊和氧化，活性氧過度產(chǎn)生，超過精子抗氧化的防御能力極限，而體內(nèi)沒有足夠的氧自由基抑制劑，可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)損失精子DNA，細(xì)胞質(zhì)膜等結(jié)構(gòu)被破壞，致使DFI升高;（3）染色質(zhì)包裝的異常，精蛋白（P1，P2）的數(shù)量和比例異常，使得精子DNA雙鏈不完整，引起DFI升高;（4）放射療法和化學(xué)療法等治療方法引起DNA損傷;（5）環(huán)境中的微量元素、化學(xué)毒物等引起的DNA損傷，如微量元素鎬、硒和一些常見的鉛和鐵等。（6）生活方式等，如酗酒、吸煙、外賣食品、久坐、熬夜、肥胖等不良生活方式都會(huì)導(dǎo)致精子DNA異常凋亡。在精子DFI目前的檢測(cè)方法主要有精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定法（Sperm chromatin structure assay，SCSA）、SCD。有實(shí)驗(yàn)表明兩種檢測(cè)方法的均值有顯著差異，而且SCD測(cè)得的精子DFI均值比SCSA較高[22]。本研究采用了SCD法檢測(cè)男性患者的精子DFI，并且用相關(guān)方法對(duì)精液常規(guī)各種參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。本研究對(duì)年齡與精液各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行比較，隨著年齡增加，精子DFI也會(huì)增加，這與劉樹沅等[23]研究結(jié)果一致。對(duì)精子DFI與精液各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行比較，精子DFI與精子濃度、精子活力、精液pH呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，精液pH與精子濃度呈正相關(guān)關(guān)系，這與袁人培等[23]、李非凡等[25]和劉依萍等[26]研究的報(bào)道相一致。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)由于沒有對(duì)禁欲時(shí)間進(jìn)行更加詳細(xì)的分類統(tǒng)計(jì)，可能存在一定不足，會(huì)受到禁欲天數(shù)影響。但也有研究顯示[27]，禁欲時(shí)間與精子DNA完整性關(guān)系并非單純正負(fù)相關(guān)的關(guān)系，故本實(shí)驗(yàn)不具體進(jìn)行分析。

綜上所述，通過本實(shí)驗(yàn)可以看出伴隨著男性年齡的增長(zhǎng)，精子的活力會(huì)降低，使男性的生育力下降并對(duì)子代產(chǎn)生不良影響。常規(guī)精液檢查可以從精子的濃度、活力、活率和形態(tài)對(duì)男性生育力進(jìn)行分析，但隨著時(shí)代的進(jìn)步，常規(guī)精液檢查已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床對(duì)男性生育力評(píng)估的需求。Jennings等[28]對(duì)是否應(yīng)該因?yàn)槟挲g因素做胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（PreImplantation genetic diagnosis，PGD）進(jìn)行了研究，并沒有足夠的證據(jù)支持需要做PGD，而精子DNA碎片檢測(cè)可作為重要的一項(xiàng)檢查，可以較為全面地反映男性的生育能力。有望作為一種常規(guī)檢查，與精液常規(guī)、精子形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)等相關(guān)檢查一起作為進(jìn)行人類輔助生殖技術(shù)治療前的常規(guī)檢測(cè)，從而為臨床提供指導(dǎo)。

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（收稿日期：2020-05-25）