體外誘導小鼠胚胎干細胞產生T譜系潛能造血祖細胞的關鍵步驟

于波，洪平山，胡房曉，夏成祥，蘭雨

暨南大學 基礎醫(yī)學院，廣東 廣州 510632

利用T淋巴細胞構建的嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T-Cell，CAR-T）和基因修飾的T細胞受體T細胞（T cell receptor T-cell，TCR-T）是臨床腫瘤免疫療法的重點方向。胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）及誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）具有無限增殖和分化為成體所有類型細胞的能力，其來源廣泛，可操作性強。利用ESC和iPSC分化產生功能性T細胞，是解決目前臨床治療中所面臨的T細胞來源緊缺難題的理想途徑。

近年來，隨著人們對造血發(fā)育過程中的細胞和分子事件的認識不斷深入，越來越多的研究團隊運用形態(tài)發(fā)生素介導的定向分化、轉錄因子介導的細胞表型轉變、畸胎瘤模型等一種或多種相結合的方法，分別從人和小鼠胚胎干細胞中誘導分化出具有定向譜系潛能的造血祖細胞[1-5]，并且從體外分化7～9 d的生血內皮細胞（hemogenic endothelial cell，HEC）中以Notch依賴的方式從人iPSC和ESC產生了T細胞[3,6-7]，但其在可重復性、移植效率、細胞功能性和自我更新能力等方面仍有待提高。

轉錄因子Runx1和Hoxa9可以促進生血內皮細胞生成，本課題組[8]在小鼠胚胎干細胞體外誘導造血分化的過程中，在內皮向造血細胞誘導階段同時過表達Runx1和Hoxa9，構建iR9-mESC重組細胞，體外誘導分化為iHEC。iHEC與發(fā)育中的胚胎D11主動脈-性腺-中腎區(qū)內皮細胞和造血干細胞前體具有相似的分子表型[9]，并能產生具有T譜系潛能的誘導性造血祖細胞，重要的是，移植到體內產生具有豐富的TCRαβ重排的功能性誘導T細胞。為了進一步提高試驗成功率和誘導T細胞的得率，本研究對ESC培養(yǎng)、擬胚體（embryoid body，EB）形成、HEC誘導分化及分選、細胞移植等關鍵步驟的條件參數(shù)進行比較分析，明確該誘導分化過程的操作技巧和關鍵注意事項，以促進該誘導體系的推廣及應用。

1 材料和方法

1.1 材料

CD45.1+B-NDG小鼠購于百奧賽圖公司［動物質量合格證號：SCXK（蘇）2016-0004］，在中國科學院生物醫(yī)藥與健康研究院無特異性病原（SPF）級動物房飼養(yǎng)［實驗動物飼養(yǎng)設施合格證號：SYXK（粵）2015-0063］；小鼠ESC購于百奧賽公司；AFT024基質細胞來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）。

DMEM高糖培養(yǎng)基、α-MEM購自美國通用電器公司；IMDM、胎牛血清、非必需氨基酸、Gluta-Max、丙酮酸鈉、β巰基乙醇、青鏈霉素、潮霉素B、嘌呤霉素等購自美國英杰生命技術有限公司；PD0325901、Chir99021、白血病抑制因子購自美國Selleck生物科技有限公司；鐵飽和轉鐵蛋白、單硫甘油、抗壞血酸、強力霉素（doxycycline，dox）等購自 美 國 Sigma公司 ；CD31、CD41、CD45、Kit、CD201、CD2、CD3、CD4、CD8、Gr1、Ter119、CD19、NK1.1、TCRγδ、DAPI等購 自 美 國 eBioscience公司；BMP4、VEGF購自美國Peprotech公司；胰酶替代物購自美國熱電公司；細胞核轉染儀（德國Lonza公司）；BDfortessa流式細胞分析儀（美國BD公司）；倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；RS2000 X線輻照儀（美國Rad Source公司）。

胚胎干細胞培養(yǎng)基：胎牛血清（15%），非必需氨基酸（1%），GlutaMax（1%），丙酮酸鈉（1%），β巰基乙醇（0.1 mmol/L），PD0325901（1 μmol/L），Chir99021（3 μmol/L），白血病抑制因子（1000 U/mL），DMEM高糖培養(yǎng)基。

小鼠胚胎成纖維細胞培養(yǎng)基：胎牛血清（10%），非必需氨基酸（1%），DMEM高糖培養(yǎng)基。

OP9-DL1培養(yǎng)基：胎牛血清（20%），α-MEM。

AFT024細胞系培養(yǎng)基：胎牛血清（10%），β巰基乙醇（0.1 mmol/L），丙酮酸鈉（1%），DMEM高糖培養(yǎng)基。

基礎分化培養(yǎng)基（basic differentiation medium，BDM）：胎牛血清（15%），鐵飽和轉鐵蛋白（200 μg/mL），單硫甘油（0.45 mmol/L），GlutaMax（1%），抗壞血酸（50 μg/mL），青鏈霉素（1%），IMDM。

BDM+B培養(yǎng)基：在BDM培養(yǎng)基基礎上加5 ng/mL BMP4。

BDM+BV培養(yǎng)基：在BDM培養(yǎng)基基礎上加5 ng/mL BMP4和5 ng/mL VEGF。

BDM+CM+dox培養(yǎng)基：在BDM培養(yǎng)基基礎上加 AFT024-mIL3、AFT024-mIL6、AFT024-mSCF、AFT024-hFlt3L的培養(yǎng)液上清各2%及1 μg/mL dox。

EM培養(yǎng)基：在BDM+CM+dox培養(yǎng)基基礎上去掉AFT024-mIL6培養(yǎng)液上清，并將IMDM換成α-MEM。

1.2 mESC體外誘導分化步驟

復蘇重組了Runx1和Hoxa9基因的iR9-mESC并傳代2～3次，待細胞長至約80%培養(yǎng)皿時收集細胞，以1×105/mL的細胞密度，每20 μL為1滴，接種至15 cm培養(yǎng)皿蓋中，顛倒皿蓋，在培養(yǎng)皿底部加適量無菌水保持濕潤的培養(yǎng)環(huán)境，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中用BDM+B培養(yǎng)基培養(yǎng)2.5 d誘導形成EB，收集EB接種至6或12孔培養(yǎng)板（6孔板 20～30個/孔，12孔板 15～20個/孔），用BDM+BV培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至第6 d，換為BDM+CM+dox培養(yǎng)基誘導基因表達，11 d時收集細胞，流式分選 iHEC（CD31+CD41lowCD45-Kit+CD201high），以 5×103/孔接種至鋪有 2×104/孔的 OP9-DL1 培養(yǎng)皿，EM培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d誘導分化為特定祖細胞，移植入CD45.1+B-NDG小鼠，4周后檢測T譜系分布和T細胞表型（圖1）。

1.3 流式細胞術分析體外不同培養(yǎng)條件下誘導性生血內皮細胞的含量

以往研究證明具備淋巴譜系分化潛能的造血祖細胞，其發(fā)育潛能在生血內皮細胞階段就已經決定，因此在多能干細胞分化產生淋系細胞的過程中，誘導生成具有淋巴譜系分化潛能的iHEC尤為關鍵。體外不同條件下誘導培養(yǎng)的第11 d細胞用胰酶消化成單細胞懸液，用含2%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液清洗，經生物素標記的CD31抗體冰上孵育15 min，抗生物素磁珠4℃避光孵育25 min富集（對照組未經富集步驟），熒光偶聯(lián)流式抗體染色15 min，用含2%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液清洗后，流式細胞儀分選目的細胞。

1.4 統(tǒng)計學分析

用GraphPad Prism 7軟件分析實驗組和對照組差異的統(tǒng)計學意義。用Flowjo 10.0.7和Adobe Illustrator CS 6軟件處理流式檢測數(shù)據(jù)。P＜0.05示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 提高mESC轉染效率及同源重組iR9-mESC得率技巧

在早期研究中，通過定點打靶方式將外源基因導入Rosa26位點。首先利用同源重組方法將CAG-Pr-rtTA-3×Stop-TRE-Runx1-p2a-Hoxa9-pAPGK Pr-HygroR誘導表達單元定點插入mESCs的Rosa26位點，然后通過在培養(yǎng)基中加入潮霉素B篩選出陽性克隆，構建誘導型Runx1-p2a-Hoxa9小鼠胚胎干細胞株iR9-mESC。在篩選并挑取iR9-mESC克隆后，在培養(yǎng)基中加入dox，qPCR檢測外源性基因Runx1和Hoxa9在mESC內是否可以被誘導表達（圖1）。

在構建iR9-mESC過程中，每一個步驟都可能影響克隆株的成功獲取。我們對該過程中出現(xiàn)的影響因素進行了探索分析，從而提高mESC的轉染效率及同源重組iR9-mESC的得率。

對于電轉時的質粒和細胞濃度，由于同源重組效率低，因此選擇用于電轉的細胞要盡量多一些，以提高重組效率，而為了避免電轉后細胞培養(yǎng)過程中多個克隆長在一起影響胚胎干細胞單克隆的純度，用于電轉的細胞濃度要適宜；另外，線性化質粒的使用量也會影響電轉結果。實驗證明，選擇形態(tài)較好、處于對數(shù)生長期的約1.2×106mESC作為電轉目標，加入核轉染試劑和2～4 μg線性化質粒，電轉后在小鼠胚胎成纖維細胞上培養(yǎng)并經潮霉素B藥篩后，能獲得數(shù)目較多且獨立存在的iR9-mESC克隆株。

在電轉后得到的iR9-mESC培養(yǎng)方面，電轉后的1.2×106mESC鋪在小鼠胚胎成纖維細胞上生長，24 h后加入終濃度為150 μg/mL的潮霉素B篩選陽性細胞克隆7～10 d。電轉后的細胞狀態(tài)較差會導致部分細胞貼壁能力差，以至于24 h后仍有一定量的可能成功構建的iR9-mESC懸浮于細胞培養(yǎng)基中，因此換液時一定要收集上清，離心后重新放進來繼續(xù)培養(yǎng)，否則將會導致目的細胞的丟失。另外，為避免影響細胞生長狀態(tài)，要減少換液次數(shù)，而長時間不換液會導致白血病抑制因子失活，研究得出每2 d換1次培養(yǎng)液既能保證細胞良好生長狀態(tài)又能提供足夠營養(yǎng)。

對于培養(yǎng)iR9-mESC所用的介質選擇，由于mESC只有在飼養(yǎng)層細胞或明膠上才能生長，電轉前的mESC若是培養(yǎng)在小鼠胚胎成纖維細胞上，則電轉前須用0.1%明膠去除小鼠胚胎成纖維細胞，導致處理步驟多，操作時間長，細胞活性不好，但細胞多能性維持較好；而如果將mESC直接培養(yǎng)在明膠上，電轉前不需要進行去除成纖維細胞的步驟，一定程度上提高了細胞活性，但在明膠上生長的mESC容易分化，導致細胞多能性較差。綜合分析，得出電轉前mESC在小鼠胚胎成纖維細胞上培養(yǎng)比在明膠上培養(yǎng)更能保證細胞的多能性狀態(tài)，有利于之后的誘導分化步驟。在提高iR9-mESC活性方面，獲得iR9-mESC之后，需要在小鼠胚胎成纖維細胞上傳代培養(yǎng)2～3次，得到大量對數(shù)生長期的細胞，進行擬胚體誘導培養(yǎng)。而在iR9-mESC培養(yǎng)過程中，對于狀態(tài)不好的細胞可以通過類似去飼養(yǎng)層細胞的方式改善細胞生長狀態(tài)：將含有小鼠胚胎成纖維細胞的iR9-mESC鋪在0.1%明膠上30～40 min（根據(jù)細胞黏附至明膠上的情況而定）后，大部分成纖維細胞和一些抓力強、活性好的iR9-mESC黏附在明膠上，此時可以收集貼壁細胞，離心后繼續(xù)培養(yǎng)即可活躍增殖。此方式雖然大大減少了iR9-mESC數(shù)目，但也去掉了很多生長狀態(tài)差的細胞，繼續(xù)培養(yǎng)時到達相同細胞數(shù)目和相同時期（對數(shù)期）所需的培養(yǎng)天數(shù)與未經歷此步驟培養(yǎng)的iR9-mESC相比明顯縮短。另外，細胞克隆密度對細胞生長狀態(tài)也有一定的影響，iR9-mESC培養(yǎng)時要保證適當?shù)募毎寺〉拿芏龋芏冗^高會使得克隆之間連成一片導致分化現(xiàn)象。

圖1 iR9-mESC細胞系構建步驟

圖2 T譜系潛能造血祖細胞誘導流程圖

2.2 誘導EB生成過程中的關鍵因素和技巧

得到一定量的iR9-mESC之后，首先需要誘導成具有內、中、外三胚層結構的EB，在此基礎上繼續(xù)向造血方向誘導分化（圖2）。胰酶消化iR9-mESC，利用差速貼壁法將細胞加入0.1%明膠包被過的孔板中，40 min后收集上清中的細胞離心，即可去掉成纖維細胞，分離出iR9-mESC。離心后加入BDM+B培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，并將細胞濃度調整為 1×105/mL，按照 20 μL/滴的細胞量將細胞懸液均勻滴在15 cm培養(yǎng)皿蓋的反面，然后顛倒皿蓋進行懸浮培養(yǎng)，此時記作第0 d（D0）。須在培養(yǎng)皿底部加一些無菌水保持濕度，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 d后收集擬胚體離心，用BDM+BV培養(yǎng)基重懸即可為下一步分化做好準備。

誘導過程中，用來誘導形成EB的單個液滴形狀和體積的精確性是關鍵。在懸EB時，液滴一定要呈圓形，垂直滴到培養(yǎng)皿中，液滴形狀不規(guī)則會影響D2.5時EB小球的形狀以及之后的誘導分化過程。并且懸EB時，若移液槍槍頭中有液體殘留，使得液滴體積小于20 μL，會導致得到的EB小球大小不均勻或較小，影響后續(xù)分化過程（圖3）。需要注意的是，在收集iR9-mESC進行EB培養(yǎng)前，需要用DPBS洗滌iR9-mESC以去除iR9-mESC培養(yǎng)液中的小分子抑制劑（如PD、CHIR及Lif等），避免小分子抑制劑對EB后續(xù)分化的抑制。

圖3 擬胚體形態(tài)（白光，5×物鏡）

圖4 擬胚體破碎情況下體外誘導iR9-mESC分化第11 d的誘導性生血內皮細胞分選流式圖

收集EB時，工具使用不當及操作不當也會大大降低之后iHEC的得率。由于得到的EB呈球形，體積較大且內部結構不是特別致密，因而需要使用孔徑較大的巴氏吸管收集EB，如用移液槍收集會導致EB破裂，最終極大地降低后續(xù)iHEC的比例（圖4、5A）。同時，收集EB時離心力要溫和，90×g或自然沉降均可。離心后棄上清過程中動作要輕柔，以免將EB棄掉。

2.3 EB誘導分化以及生血內皮細胞分選過程的技巧

在誘導EB生成生血內皮細胞及生血內皮細胞收集和分選過程中，離心收集好的D2.5 EB須用BDM+BV培養(yǎng)基重懸，種在0.1%明膠包被過的6孔板中誘導分化，在EB培養(yǎng)的D6～D11期間用BDM+CM+dox培養(yǎng)基誘導外源基因Runx1和Hoxa9表達促進生血內皮細胞生成，其間每2 d換1次液。D11時，用0.05% Trypsin-EDTA膠原酶消化擬胚體，充分吹散后收集于50 mL離心管中，用美天旎免疫磁珠試劑盒富集CD31+細胞，染色后流式細胞儀分選iHEC（CD31+CD41lowCD45-Kit+CD201high）。此步操作過程中在以下幾個方面設置了對照實驗。

EB誘導分化過程中，未加dox會降低誘導分化效率，導致iHEC得率低。此步驟添加dox的作用是誘導Runx1和Hoxa9表達，從而促進產生T譜系潛能的iHEC。由于Runx1在產生生血內皮細胞和EHT階段的促進作用，所以Runx1不僅影響iHEC譜系特異性，也影響EB向iHEC的分化。該階段缺少Runx1表達會影響EB分化形成的iHEC得率（圖5）。另外，誘導分化生血內皮細胞的EB鋪板密度要均勻適中，一個15 cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)的約200個EB小球均勻鋪到1塊六孔板中即可，每孔20～30個擬胚體小球，12孔板則每孔10～15個，保證每個EB小球是獨立的，小球間距均勻。D2.5～D6期間對培養(yǎng)基進行半換液或補液500 μL，注意不要大幅度晃動培養(yǎng)皿，否則會導致EB漂浮而停止分化。

收集生血內皮細胞時，0.05%Trypsin-EDTA膠原酶消化時間和操作過程直接影響其得率。消化培養(yǎng)D11的EB時，Trypsin-EDTA膠原酶的作用時間和收集時的耗時是關鍵。酶消化時間過長會導致細胞狀態(tài)變差，收集時反復吹打細胞次數(shù)過多雖然可以減少未吹散細胞團塊而導致的細胞的損失，但吹打產生的氣泡會損失大量細胞，并且處理時間過長也會在很大程度上降低細胞活性，最終降低生血內皮細胞分選時的得率，從正常情況下的16.1%降低至0.1%（圖6、5A）。實驗得出，在收集胰酶消化后的產物時，用移液槍吹打8～10下可較好地實現(xiàn)二者的平衡。另外，收集消化好的細胞離心前需要來回劇烈顛倒離心管，以分散誘導培養(yǎng)過程中產生的黏稠狀的細胞分泌物團塊，利于之后進一步過濾，在后續(xù)用免疫磁珠富集時避免堵塞柱子。

圖5 正常條件下和未加dox條件下體外分化獲得誘導性生血內皮細胞比例的流式圖

圖6 細胞消化過度情況下體外誘導iR9-mESC分化第11 d分選的誘導性生血內皮細胞流式圖

正確的免疫磁珠富集方法可增加生血內皮細胞得率。為了滿足移植所需的造血祖細胞數(shù)量，通常會準備盡可能多的細胞用于產生EB，進而能夠分選得到較多的iHEC，因而D11收集用來分選的細胞量一般較大。在分選前，先進行生物素標記的CD31抗體和抗生物素的磁珠對細胞進行富集，可以避免分選時間過長導致的細胞活性降低，又能減少流式儀器上機成本。需要注意的是，在用微珠之前，須在渦旋器上振蕩混勻，以免使用時微珠濃度和數(shù)量不準確影響吸附效果。并且由于微珠較重，使用時須加大細胞濃度，控制反應液的量，否則會導致微珠沉在底部而不能充分標記細胞。同時，在細胞與微珠孵育過程中，定時多次混勻可增加二者的接觸，其目的是提高富集效果，從而增加生血內皮細胞得率。實驗得出，采用富集后再分選的方式，分選耗時少且細胞活性好，富集后CD31+內皮細胞比例顯著高于未富集時，分別為70.5%和13.2%（圖7）。分選時間過長會導致細胞活性差且與OP9-DL1共培養(yǎng)后細胞增殖較慢，并且流式分選上機成本高。上述不同的培養(yǎng)和操作條件下，iHEC的比例與對照組相比的統(tǒng)計學分析如圖8所示。

2.4 共培養(yǎng)誘導T譜系潛能造血祖細胞的技巧

共培養(yǎng)誘導T譜系潛能造血祖細胞時，細胞密度及與基質細胞的比例是關鍵。分選出的D11的誘導性生血內皮細胞需要與OP9-DL1細胞共培養(yǎng)，從而誘導產生具有譜系特異性的造血祖細胞。共培養(yǎng)過程中需要注意，至少提前1 d（D10時）復蘇OP9-DL1細胞，細胞計數(shù)后，以12孔板的每孔種板2×104OP9-DL1細胞為佳，由于分選出的細胞存在狀態(tài)稍差以及分選時錯讀的可能性，實驗發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)時將分選出的誘導性生血內皮細胞與OP9-DL1細胞以1∶10的比例在EM培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，可保證目的細胞營養(yǎng)獲取充足又有足夠的基質細胞提供分化所需的相關因子，10 d后可獲得較多的造血祖細胞。

圖7 CD31生物素標簽富集前后內皮細胞的比例

2.5 細胞移植方法選擇

體外誘導分化獲得免疫表型的造血祖細胞后須移植到重度免疫缺陷小鼠（NOD-PrkdcscidIL2rgtm1/Bcgen，CD45.1+，B-NDG）體內，于無特異性病原（specefic pathogen free，SPF）環(huán)境中飼養(yǎng)4～8周，流式分析檢測受體胸腺、淋巴結、血液等免疫器官中誘導性T細胞（CD4+/CD8+）的生成情況。該實驗過程中細胞移植是產生有功能的誘導性T細胞成敗的關鍵。其中，在細胞移植方法上一般有尾靜脈移植和眼眶靜脈移植2種選擇。眼眶靜脈移植時，由于操作經驗不同，對注射針頭進入位置和角度把握不準確，以及實驗過程中小鼠受刺激后劇烈運動等突發(fā)情況，會導致部分已注射至眼眶靜脈的珍貴的目的細胞從眼角滲出，降低移植成功率和移植細胞數(shù)目的準確性，并且由于經驗和針頭進入的深度不同，會導致小鼠眼睛不同程度的損傷而逐步失明，極大地影響小鼠身體健康、運動狀態(tài)及移植后受體小鼠的存活率。而通過尾靜脈注射移植時，因尾靜脈易明顯觀察，方便進行準確注射，并且可看到注射后細胞的流向，很少出現(xiàn)大量供體細胞液從尾靜脈流出的現(xiàn)象，增加了移植成功率和移植細胞數(shù)目的準確性，并且對操作難度和經驗性要求較低。

圖8 不同培養(yǎng)條件下實驗組和對照組數(shù)據(jù)差異的統(tǒng)計學分析

3 討論

造血發(fā)育系統(tǒng)內皮起源和中胚層起源學說的興起，體外誘導多能干細胞產生定向譜系的造血干祖細胞大多通過誘導生成具有內、中、外三胚層結構的擬胚體，經歷內皮樣中間體階段，再利用共培養(yǎng)的方法定向誘導馴化為譜系特異的造血干祖細胞，最后通過移植到體內或在體外鑒定代表集落形成能力的集落形成單位，最終確定形成的成熟血液細胞種類及其功能[3,8,10-13]。

研究顯示，生血內皮細胞具有異質性，并且紅-髓祖細胞和造血干細胞來源于不同的生血內皮群體，重要的是，造血譜系潛能在生血內皮細胞階段就已經預先確定[14-15]。最近的研究通過建立胚胎發(fā)育過程中主動脈-性腺-中腎區(qū)從內皮細胞到造血干細胞整個過程的單細胞轉錄組圖譜，追蹤第一波造血干細胞的生成，并鑒定捕獲了具有造血干祖細胞命運和潛能的生血內皮細胞群體[16-17]，說明特定類型iHEC的產生是體外誘導多能干細胞產生造血祖細胞的關鍵，可通過體外誘導多能干細胞產生譜系特異的iHEC從而產生特定潛能的造血祖細胞。本研究中，我們以在誘導過程中細胞培養(yǎng)濃度、操作方法細節(jié)、工具的使用、分選時間、細胞移植等方面設置對照組的方法，分析了影響該誘導體系中mESC活性、iHEC和造血祖細胞的含量以及譜系特異性的關鍵因素，針對各分化步驟和時間節(jié)點精準操作，從而提高實驗過程中iHEC的活性和得率，提高移植效率，最終增加誘導性T細胞的得率。這些針對功能性T細胞再生的策略研究最終將幫助減輕血液系統(tǒng)疾病患者細胞治療過程中T淋巴細胞再生的困難。

志謝：感謝中國科學院生物醫(yī)藥與健康研究院王金勇研究員及其團隊給予本實驗的支持與幫助。