健脾生血顆粒對(duì)腎性貧血模型大鼠的治療作用

譚靜玲， 趙 剛 ， 呂承恬， 熊富良， 陳 興， 張雪瓊

(1. 湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢430064;2. 健民藥業(yè)集團(tuán)兒童藥物研究院，湖北 武漢430052;3. 武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430070)

腎性貧血主要是由于促紅細(xì)胞生成素減少所致，中醫(yī)視為腎精不足。而健脾生血顆粒具有健脾填精、益氣養(yǎng)血之功效，因此，基于精血同源理論，健脾生血顆?？赡軐?duì)治療腎性貧血有效果，但需要通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)通過建立腎性貧血模型，旨在考察健脾生血顆粒對(duì)腎性貧血大鼠模型的治療效果，為健脾生血顆粒的二次開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物 Wistar 大鼠50 只(SPF 級(jí))，購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，合格證號(hào)SCXK2008-0005。于實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)3 d 以適應(yīng)本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室環(huán)境后稱量，大鼠體質(zhì)量為180 ～220 g。

1.2 試劑 健脾生血顆粒(生產(chǎn)批號(hào)20131211，武漢健民藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，相當(dāng)于生藥0.36 g +硫酸亞鐵0.02 g/g);健脾生血浸膏(原處方中藥部分，相當(dāng)于生藥材3.27 g/g);六水合硫酸亞鐵(生產(chǎn)批號(hào)20130116，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 儀器 紫外分光光度計(jì)(SP-1920，上海光譜儀器有限公司);電子稱(JS-S，昆山天金崗金屬制品有限公司);離心機(jī)(TGL-16，常州市萬合儀器制造有限公司);電子天平(FA2004，上海方瑞儀器有限公司);全自動(dòng)血液分析儀(美國(guó)庫爾特);自動(dòng)生化分析儀(CXT，美國(guó)貝克曼);酶標(biāo)儀(BIO-BAD BECHMARK)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模與給藥 大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，腺嘌呤［1］用去離子水配制3%的混懸液，灌胃劑量為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)灌胃6 周，制作腎性貧血模型［2-4］。依據(jù)動(dòng)物劑量換算表設(shè)定，實(shí)驗(yàn)組大鼠等效劑量為人用劑量的6.3 倍，各組給藥劑量按照下列公式計(jì)算。健脾生血組給藥量=6.3 ×0.214 ×大鼠體質(zhì)量(按成人70 kg 計(jì)，每天劑量為15 g，成人每天服藥劑量為0.214 g/kg);健脾生血浸膏組給藥量=6.3 ×0.214 ×0.11 ×大鼠體質(zhì)量(每克顆粒相當(dāng)于浸膏0.11 g);硫酸亞鐵組給藥量=6.3 ×0.214 ×0.0198 ×大鼠體質(zhì)量;正常對(duì)照組和模型組給予等劑量的0.9%氯化鈉溶液，每只大鼠給藥2 mL。6 周后，眼眶采血測(cè)定血象指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)組的血象指標(biāo)均顯著低于正常對(duì)照組水平，即顯示造模成功。

2.2 樣本采集和指標(biāo)測(cè)定

2.2.1 血象指標(biāo) 分別于灌胃給藥前后眼眶采血2 mL，采用全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)RBC、HGB、HCT。

2.2.2 血清中促紅細(xì)胞生成素 (EPO)的測(cè)定 按照ELISA 試劑盒操作說明進(jìn)行EPO 的［5］測(cè)定。取大鼠眼眶血收集于離心管中，將裝有血液的離心管橫在實(shí)驗(yàn)臺(tái)，于室溫下自然凝固，再放入冰箱4 ℃下凝固，離心。仔細(xì)收集上清。檢查上清液如果仍有紅色沉淀，應(yīng)吸取上清液再次離心［6-8］。

2.2.3 腎功能檢查 眼眶采血后，采用Beckmann 自動(dòng)生化分析儀測(cè)定BUN 及Cr［9-12］，進(jìn)行腎功能檢查。

2.2.4 紅細(xì)胞脆性試驗(yàn) 麻醉后處死大鼠，眼眶取血，立即取0.9%氯化鈉、0.44%氯化鈉和純水各2.5 mL，分別加入全血50 μL 混勻，離心，取上清液在紫外分光光度法波長(zhǎng)575.2 nm 處測(cè)定，計(jì)算紅細(xì)胞溶解率［13］。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以±s 表示，各組之間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為有顯著性差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

3.1.1 對(duì)外周血紅細(xì)胞(RBC)的影響 造模6 周后，與正常對(duì)照組相比，其余組RBC 水平顯著較低(P ＜0.05)，即示造模成功。灌胃給藥后，除模型組外，其余各組RBC水平均顯著上升(P ＜0.05)，且健脾生血顆粒組和健脾生血浸膏組恢復(fù)至正常對(duì)照組水平。硫酸亞鐵組RBC 水平有所恢復(fù)但尚未恢復(fù)到正常水平。健脾生血顆粒組明顯高于其他各組(見表1)。

3.1.2 對(duì)大鼠血紅蛋白(HGB)的影響 造模后，與正常對(duì)照組比較，其余組明顯低于正常對(duì)照組(P ＜0.05)。給藥后，各組水平均有上升，且各組間差別顯著 (P ＜0.05)。硫酸亞鐵組有所上升但尚未恢復(fù)到正常水平(見表1)。

3.1.3 對(duì)大鼠紅細(xì)胞比容(HCT)的影響 造模后，除正常對(duì)照組外，各組HCT 水平顯著下降，(P ＜0.05)。給藥后，除硫酸亞鐵組外，其余各組與正常對(duì)照相比均顯著升高(P ＜0.05)。各組間相比，HCT 差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。健脾生血顆粒組效果明顯高于健脾生血浸膏組和硫酸亞鐵組，升高情況有顯著性差別(P ＜0.05)(見表1)。

表1 大鼠給藥后對(duì)血常規(guī)的影響(±s，n=8)

表1 大鼠給藥后對(duì)血常規(guī)的影響(±s，n=8)

注:與正常對(duì)照組比較，▲P ＜0.05，與模型組比較，*P ＜0.05

組別 時(shí)間 RBC/(×1012·L -1) HGB/(g·L -1) HCT/%模型組 給藥前 5.13 ±0.28▲ 95.73 ±2.74▲ 28.48 ±1.18▲給藥后 5.07 ±0.53 97.25 ±2.70 28.43 ±1.86▲正常對(duì)照組 給藥前 6.91 ±0.24 99.00 ±2.38 33.40 ±1.51給藥后 7.00 ±0.24* 121.10 ±2.50* 34.23 ±0.93*健脾生血顆粒組 給藥前 5.00 ±0.31▲ 95.73 ±3.77▲ 31.42 ±1.51▲給藥后 8.68 ±0.36* 137.67 ±4.59* 39.70 ±1.48▲＊健脾生血浸膏組 給藥前 5.05 ±0.35▲ 94.82 ±1.50▲ 27.27 ±0.70▲給藥后 7.44 ±0.15* 125.50 ±1.49* 36.37 ±0.70▲＊硫酸亞鐵組 給藥前 5.02 ±0.22▲ 95.58 ±2.66▲ 25.92 ±1.12▲給藥后 6.84 ±0.33* 119.90 ±5.14* 35.07 ±1.11*

3.2 對(duì)大鼠EPO 的影響 給藥后，取大鼠眼眶血收集于離心管中，將裝有血液的離心管橫在實(shí)驗(yàn)臺(tái)，自然凝固，再放入4 ℃下凝固，離心。收集上清。檢查上清液若仍有紅色沉淀，應(yīng)吸取上清液再次離心。健脾生血顆粒組大鼠EPO 的量低于正常對(duì)照組，但顯著高于健脾生血浸膏組和硫酸亞鐵組(P ＜0.05)，各組大鼠EPO 含有量見表2。

表2 大鼠給藥后對(duì)EPO 的影響(±s，n=8)

表2 大鼠給藥后對(duì)EPO 的影響(±s，n=8)

注:與正常對(duì)照組比較，▲P ＜0.05;與模型組比較，* P ＜0.05

組別 給藥前/(mmol·L -1)給藥后/(mmol·L -1)模型組 10.66 ±0.24▲ 10.16 ±0.93正常對(duì)照組 16.88 ±0.90 16.64 ±0.92*健脾生血顆粒組 10.73 ±0.16▲ 14.64 ±0.88*健脾生血浸膏組 10.60 ±0.22▲ 13.32 ±0.83*硫酸亞鐵組 10.55 ±0.17▲ 12.03 ±0.56*

3.3 對(duì)大鼠腎功能的影響 給藥后，除模型組外，各組大鼠BUN 的量均有所下降，提示三組大鼠腎功能均有所恢復(fù)。三組間BUN 的量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中健脾生血顆粒組BUN 的量最低，健脾生血浸膏組、硫酸亞鐵組稍高，但均未降低到正常對(duì)照組水平。大鼠肌酐(Cr)水平變化趨勢(shì)與BUN 變化趨勢(shì)基本吻合。進(jìn)一步印證了大鼠腎功能的變化。大鼠BUN、Cr 的量如表3、表4。

3.4 對(duì)大鼠紅細(xì)胞脆性的影響 麻醉后處死大鼠，眼眶取血，立即取0.9%氯化鈉、0.44%氯化鈉和純水各2.5 mL，分別加入全血50 μL 混勻，離心，取上清液在紫外分光光度法波長(zhǎng)575.2 nm 處測(cè)定，計(jì)算紅細(xì)胞溶解率。大鼠通過灌胃健脾生血顆粒和健脾生血浸膏恢復(fù)至正常水平。雖然硫酸亞鐵組大鼠紅細(xì)胞溶解率未恢復(fù)到正常值，但給藥后仍降低，接近正常值。見表5。

表3 大鼠給藥后對(duì)BUN 的影響(±s，n=8)

表3 大鼠給藥后對(duì)BUN 的影響(±s，n=8)

注:與正常對(duì)照組比較，▲P ＜0.05;與模型組比較，*P ＜0.05

組別 給藥前/(mmol·L -1)給藥后/(mmol·L -1)模型組 26.71 ±5.44▲ 26.05 ±6.74正常對(duì)照組 10.37 ±0.59 10.40 ±0.61*健脾生血顆粒組 25.13 ±5.41▲ 11.87 ±2.04*健脾生血浸膏組 26.23 ±4.99▲ 16.00 ±2.89*硫酸亞鐵組 25.39 ±5.52▲ 17.56 ±2.27*

表4 大鼠給藥后對(duì)Cr 的影響(±s，n=8)

表4 大鼠給藥后對(duì)Cr 的影響(±s，n=8)

注:與正常對(duì)照組比較，▲P ＜0.05;與模型組比較，*P ＜0.05

組別 給藥前/(μmol·L -1)給藥后/(μmol·L -1)模型組 140.17 ±11.14▲ 144.89 ±11.26正常對(duì)照組 76.77 ±8.86 79.54 ±8.26*健脾生血顆粒組 141.90 ±11.28▲ 90.90 ±6.57*健脾生血浸膏組 143.47 ±10.56▲ 101.22 ±7.18*硫酸亞鐵組 141.57 ±8.93▲ 112.88 ±6.24*

4 討論

本實(shí)驗(yàn)考察腎性貧血大鼠給藥前后血象指標(biāo)(RBC、HGB、HCT)、EPO、腎功能指標(biāo)(BUN、Cr)、紅細(xì)胞脆性，給藥后，除模型組外，實(shí)驗(yàn)組三組大鼠的外周血象指標(biāo)水平均已基本恢復(fù)至正常對(duì)照組水平，且健脾生血顆粒組、健脾生血浸膏組和硫酸亞鐵組間血象指標(biāo)水平存在顯著差異。健脾生血顆粒效果優(yōu)于其余兩組。由此可見，健脾生血顆粒能明顯提高EPO 的量，降低BUN、Cr 的量，有效治療大鼠腎性貧血并能改善腎功能，并可降低紅細(xì)胞脆性。健脾生血顆粒中的中藥浸膏部分和硫酸亞鐵部分均可改善腎性貧血，但單獨(dú)使用效果不如健脾生血顆粒，可以初步推測(cè)，健脾生血顆粒中藥部分與硫酸亞鐵協(xié)同作用于腎性貧血大鼠的治療。

表5 大鼠給藥后對(duì)紅細(xì)胞溶血率的影響(±s，n=8)

表5 大鼠給藥后對(duì)紅細(xì)胞溶血率的影響(±s，n=8)

注:與正常對(duì)照組比較，▲P ＜0.05;與模型組比較，* P ＜0.05

組別 給藥前/% 給藥后/%模型組 64.50 ±2.37▲ 64.20 ±1.90正常對(duì)照組 53.45 ±2.78 53.87 ±2.34*健脾生血顆粒組 64.03 ±1.97▲ 54.07 ±6.15*健脾生血浸膏組 64.97 ±2.12▲ 54.27 ±4.99*硫酸亞鐵組 64.55 ±2.50▲60.95 ±2.14

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