• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    大鼠Klotho蛋白水平隨血壓升高而降低

    2020-11-16 03:26:48王彥琛楊偉張瑋羅丹蘇顯明
    生物技術(shù)通訊 2020年4期
    關(guān)鍵詞:收縮壓內(nèi)皮細(xì)胞血壓

    王彥琛,楊偉,張瑋,羅丹,蘇顯明

    1.咸陽(yáng)市中心醫(yī)院 老年病科,陜西 咸陽(yáng) 712000;

    2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 老年心血管內(nèi)科,陜西 西安 710061

    高血壓是一種發(fā)病率高、可導(dǎo)致全身組織器官產(chǎn)生多種嚴(yán)重并發(fā)癥的慢性疾病,不僅給患者自身帶來(lái)病痛,而且給患者及家庭也帶來(lái)嚴(yán)重的心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),已成為全球健康問(wèn)題[1-2]。目前高血壓的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡述清楚。研究發(fā)現(xiàn),Klotho(kl)蛋白能夠修復(fù)受損內(nèi)皮細(xì)胞,通過(guò)內(nèi)皮釋放含一氧化氮(NO)的體液途徑來(lái)保護(hù)心血管系統(tǒng)免受損傷,推測(cè)與高血壓發(fā)生有一定的關(guān)系[3-4]。我們?cè)诮⒏哐獕捍笫竽P秃?,檢測(cè)了血漿中kl蛋白和NO水平隨血壓水平變化的規(guī)律,以明確kl蛋白與高血壓發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    7周齡雄性SD大鼠(體質(zhì)量200±10 g)由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,隨機(jī)分為高血壓組和對(duì)照組,每組24只。造模組給予N'-硝基-L-精氨酸98 mg/d連續(xù)灌胃[5],對(duì)照組給予等體積生理鹽水灌胃1/d,共28 d。

    大鼠腎小管上皮細(xì)胞、大鼠腎小管上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基購(gòu)于普諾賽公司;N'-硝基-L-精氨酸購(gòu)于凡科維公司;PBS購(gòu)于上海雙螺旋生物科技有限公司;kl蛋白、血栓素(TXA2)、內(nèi)皮素(ET)酶聯(lián)免疫法、NO一步法、丙二醛(MDA)TAB法、超氧化物歧化酶(SOD)WST-1法試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;倒置相差顯微鏡為OLYMPUS公司產(chǎn)品;酶標(biāo)儀購(gòu)于上海賽默飛世爾科技有限公司;BP-300A全自動(dòng)大小鼠無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)購(gòu)于成都秦盟軟件有限公司。

    1.2 樣本采集與處理

    實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前先分別用 0、100、200 μmol/L 的N'-硝基-L-精氨酸干預(yù)大鼠腎小管上皮細(xì)胞,24 h后Real-time PCR檢測(cè)kl基因的表達(dá)變化。

    分別于造模成功停藥后第 7、14、21、28 d稱重,測(cè)安靜狀態(tài)下大鼠尾動(dòng)脈血壓3次,取平均值,每組抽取6只體質(zhì)量相近的大鼠,用10%水合氯醛按0.35 mL/100 g麻醉,取腹主動(dòng)脈血EDTA抗凝,離心血漿,-20℃保存,用于檢測(cè)kl蛋白、TXA2、ET、MDA、NO含量及SOD活力。采血后立即處死大鼠,快速取出胸主動(dòng)脈,生理鹽水沖洗,10%甲醛固定,常規(guī)石蠟切片,分別用于HE染色、免疫組化CD31標(biāo)記。

    1.3 PCR檢測(cè)kl基因的表達(dá)

    將腎小管上皮細(xì)胞傳代、計(jì)數(shù)、凍存,細(xì)胞生長(zhǎng)至密度80%左右進(jìn)行加藥處理,各組加入N'-硝基-L-精氨酸的濃度為 0、100、200 μmol/L,培養(yǎng)24 h后提供細(xì)胞進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。檢測(cè)所需的kl及β-actin引物從萬(wàn)科生物科技公司訂購(gòu),引物序列見(jiàn)表1。

    1.4 血漿kl蛋白、TXA2、ET含量測(cè)定

    采用ELISA試劑盒,酶標(biāo)儀測(cè)定D450nm值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度及濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度。

    1.5 血漿NO、MDA含量及SOD活力測(cè)定

    分別采用試劑盒測(cè)定血漿NO、MDA含量及SOD活力。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示,采用t檢驗(yàn)比較2組大鼠實(shí)驗(yàn)初始的收縮壓。采用析因設(shè)計(jì)方差分析干預(yù)后2組大鼠收縮壓的變化。采用兩因素多水平析因設(shè)計(jì)對(duì)2組大鼠的kl蛋白濃度,NO、ET、TXA2、MDA含量及SOD活力進(jìn)行分析整理。

    2 結(jié)果

    2.1 動(dòng)物模型的建立

    實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前用不同濃度的N'-硝基-L-精氨酸干預(yù)大鼠腎小管上皮細(xì)胞,Real-time PCR檢測(cè),結(jié)果顯示N'-硝基-L-精氨酸影響kl基因的表達(dá),因此在干預(yù)藥物停藥1周后測(cè)定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),避免造模藥物影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性經(jīng)擴(kuò)增曲線及熔解曲線確定(圖1),用2-△△Ct法計(jì)算mRNA表達(dá)水平(圖2)。

    表1 引物及序列

    表2 2組大鼠用藥前收縮壓比較(n=48)

    圖1 kl基因(A)和β-actin(C)的熔解曲線及kl基因(B)和β-actin(D)的擴(kuò)增曲線

    2.2 血壓水平結(jié)果

    實(shí)驗(yàn)初始分別檢測(cè)48只大鼠的收縮壓,2組大鼠的收縮壓差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.820,P=0.417)(表2)。經(jīng)藥物干預(yù)后,分別在停藥后的第7、14、21、28 d測(cè)量2組大鼠的收縮壓,結(jié)果見(jiàn)表3。采用析因設(shè)計(jì)方差分析2組大鼠的收縮壓(表4)。在α=0.05水準(zhǔn)上,校正模型檢驗(yàn)F=171.841,P=0.000,模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在是否用藥與時(shí)間的交互作用統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果中,F(xiàn)=19.706,P=0.00,需要進(jìn)一步闡釋。在分析是否用藥的單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果中,F(xiàn)=1126.251,P=0.000,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即高血壓組的收縮壓與對(duì)照組的收縮壓的影響有顯著性差異,且高血壓組的收縮壓明顯高于對(duì)照組。進(jìn)一步分析7、12、21、28 d的收縮壓變化情況,結(jié)果表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.064,P=0.000),而且隨著時(shí)間的推移,血壓不斷升高。

    2.3 各組 kl蛋白、NO、TXA2、ET、MDA 含量及SOD活性的變化

    采用N'-硝基-L-精氨酸誘導(dǎo)大鼠高血壓實(shí)驗(yàn)?zāi)P汀樵u(píng)估實(shí)驗(yàn)?zāi)P偷挠行?,?shí)驗(yàn)中引入TXA2、ET、MDA含量及SOD活力檢測(cè)。

    對(duì)2組大鼠的kl蛋白、NO、ET、TXA2、MDA含量及SOD活力進(jìn)行分析、整理。通過(guò)血壓、干預(yù)后持續(xù)時(shí)間2個(gè)因素進(jìn)行多水平析因設(shè)計(jì),血壓分對(duì)照組、高血壓組2個(gè)水平,干預(yù)后持續(xù)時(shí)間分為7、14、21、28 d共4個(gè)水平,采用兩因素多水平析因設(shè)計(jì),共8種組合,每組6例,共48例。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),kl蛋白、NO、ET、TXA2、MDA含量及SOD活力情況分別見(jiàn)表5、圖3、圖4。

    圖2 不同濃度N'-硝基-L-精氨酸干預(yù)大鼠腎小管上皮細(xì)胞kl表達(dá)情況

    表3 2組大鼠用藥后收縮壓變化情況

    表4 2組大鼠用藥后收縮壓變化的方差分析結(jié)果

    圖3 2組大鼠ET、TXA2、MDA含量及SOD活力隨時(shí)間變化趨勢(shì)

    表5 2組大鼠用藥后kl蛋白、NO、ET、TXA2、MDA含量及SOD活力情況描述

    從析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果(表6)可以看到,在α=0.05水準(zhǔn)上,kl蛋白、NO、ET、TXA2、MDA含量及SOD活力的P值均<0.05,說(shuō)明模型均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血壓、時(shí)間之間的交互作用對(duì)kl蛋白、NO、ET、MDA含量及SOD活力的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05),但對(duì)TXA2含量的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。就血壓的單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果來(lái)看,單獨(dú)血壓對(duì)NO、ET、TXA2、MDA含量的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05),對(duì)kl蛋白濃度、SOD 活力的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。就時(shí)間的單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果來(lái)看,單獨(dú)時(shí)間對(duì)NO、ET、TXA2、MDA含量及SOD活力的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05),對(duì)kl蛋白濃度的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    圖4 2組大鼠kl蛋白、NO隨時(shí)間變化趨勢(shì)

    表6 2組大鼠用藥后kl蛋白、NO、ET、TXA2、MDA含量及SOD活力析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果

    2.4 血壓變化與主動(dòng)脈壁HE染色及CD31標(biāo)記

    HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈管壁隨時(shí)間變化,細(xì)胞核的大小、排列、管壁厚度未見(jiàn)明顯的病理改變;高血壓組大鼠隨著高血壓的發(fā)生,主動(dòng)脈壁彈力纖維增生、排列紊亂,細(xì)胞核逐漸增大變形,中膜逐漸增厚(圖5)。

    CD31標(biāo)記顯示,對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞隨時(shí)間無(wú)明顯變化,邊緣連續(xù)、光整,各時(shí)期無(wú)顯著差別;模型組大鼠隨著高血壓的發(fā)生,內(nèi)皮細(xì)胞受損,逐漸減少、脫落,部分完全缺失(圖6)。

    3 討論

    kl基因是Kuro等在1997年研究自發(fā)型高血壓時(shí)發(fā)現(xiàn)的與衰老有關(guān)的新基因[6]。研究發(fā)現(xiàn),人和大鼠的kl基因有83%的同源性,主要在腎臟和腦表達(dá)。該基因敲除鼠出生后4周齡左右出現(xiàn)動(dòng)脈硬化和異位鈣化,并隨增齡而加重[7]。將kl雜合子鼠和野生型鼠同時(shí)放在高壓環(huán)境下20 h后,雜合子鼠主動(dòng)脈對(duì)乙酞膽堿松弛反應(yīng)的有效劑量增高,小動(dòng)脈對(duì)乙酞膽堿所引起的舒血管反應(yīng)明顯減弱[3],推斷kl蛋白能夠通過(guò)內(nèi)皮釋放NO產(chǎn)物的體液途徑來(lái)保護(hù)心血管系統(tǒng)免受損傷。另有研究發(fā)現(xiàn),kl蛋白可以減少過(guò)氧化氫所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和衰老,并增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性,降低 caspase-3、caspase-9 的活性[8]。缺乏 kl基因的小鼠,其骨髓、外周血中的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)數(shù)量明顯下降,而EPC的生理作用是當(dāng)血管受損時(shí)可以遷移、黏附到受損部位,通過(guò)增殖、分化作用為內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)受損的血管,因此考慮kl可能與EPC相互作用,參與血管損傷修復(fù)[9]。本課題組既往臨床研究[10]了高血壓組與非高血壓組人群的kl蛋白與NO水平,發(fā)現(xiàn)高血壓患者血清中kl蛋白隨NO的增加而增加,kl蛋白與NO之間存在正相關(guān),推斷kl蛋白的降低可引起NO減少,而NO減少使NO/NOS系統(tǒng)功能低下,造成血管收縮、舒張不平衡,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生,最終導(dǎo)致高血壓的發(fā)生。

    本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察非高血壓和高血壓大鼠生長(zhǎng)發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中kl蛋白、NO的變化,進(jìn)一步推測(cè)kl與NO之間的關(guān)系。通過(guò)上述數(shù)據(jù)的分析(表6),我們可以觀察到,僅血壓的單獨(dú)效應(yīng)或者僅時(shí)間的單獨(dú)效應(yīng)對(duì)kl蛋白的影響無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但血壓及時(shí)間交互作用后對(duì)kl蛋白的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明kl的表達(dá)變化在高血壓發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中有時(shí)間累積效應(yīng),而非受短期血壓波動(dòng)影響。我們發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)、血壓的逐漸升高,kl蛋白發(fā)生了規(guī)律性變化:kl總體呈逐漸下降趨勢(shì),但7~21 d高血壓組大鼠kl蛋白水平明顯高于對(duì)照組大鼠,21~28 d高血壓大鼠kl蛋白水平低于對(duì)照組。高血壓早期的病理生理變化是血管內(nèi)皮損傷,而既往研究顯示,kl蛋白在一定條件下可以與機(jī)體內(nèi)的多種血管活性物質(zhì)發(fā)生作用,使血管的舒張作用加強(qiáng),抑制動(dòng)脈硬化的發(fā)生,最終達(dá)到對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用[11-12]。且該蛋白可以與VEGFR-2受體發(fā)生作用,保持內(nèi)皮細(xì)胞的完整性[7]。因此推測(cè)在高血壓初期,kl蛋白可能因?yàn)檠獕荷摺⒎答伇磉_(dá)增加,發(fā)揮其保護(hù)血管內(nèi)皮、降低血壓的作用;而隨著血壓的穩(wěn)定高水平,kl蛋白濃度顯著降低,低于對(duì)照組水平,說(shuō)明長(zhǎng)期高血壓可影響kl蛋白合成。因kl蛋白主要表達(dá)于腎臟遠(yuǎn)曲小管及脈絡(luò)膜[13],遠(yuǎn)曲小管是離子轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌的重要場(chǎng)所,其功能受醛固酮和抗利尿激素的調(diào)節(jié),有研究發(fā)現(xiàn)RASS系統(tǒng)中血管緊張素Ⅱ可抑制kl mRNA表達(dá),故在RASS系統(tǒng)對(duì)腎臟kl表達(dá)調(diào)節(jié)中,Ang應(yīng)發(fā)揮著主導(dǎo)作用,因此高血壓發(fā)生時(shí),RASS系統(tǒng)激活,抑制kl基因的表達(dá),kl蛋白最終減低,支持我們所觀察到的kl蛋白表達(dá)水平變化趨勢(shì)。

    從上述數(shù)據(jù)可以看出,NO在血壓、時(shí)間及其2組之間交互影響時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們發(fā)現(xiàn)2組大鼠的NO也存在顯著差異:NO水平隨血壓升高及時(shí)間延長(zhǎng)總體趨勢(shì)逐漸降低,與血壓呈負(fù)相關(guān);但7~14 d高血壓組大鼠NO水平明顯高于對(duì)照組大鼠,14~28 d高血壓組大鼠NO水平低于對(duì)照組(圖4)。已知內(nèi)皮細(xì)胞是血管中NO的主要來(lái)源,內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)合成和分泌的NO來(lái)參與調(diào)節(jié)血管張力、血壓和血管重塑等生理作用。高血壓早期內(nèi)皮細(xì)胞受損,NO產(chǎn)生減少。但是我們觀察到在高血壓發(fā)生的7~14 d NO水平高于對(duì)照組,與kl蛋白的波動(dòng)趨勢(shì)一致,結(jié)合上述kl蛋白升高的原因,我們考慮kl蛋白通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)影響體內(nèi)NO的含量,共同調(diào)節(jié)血壓水平。

    另有研究表示[14],kl基因缺陷的小鼠在出生4周后即可出現(xiàn)動(dòng)脈硬化,并隨增齡而加重,表現(xiàn)為主動(dòng)脈嚴(yán)重鈣化,肌性中動(dòng)脈中層鈣化、內(nèi)膜增厚,腎臟小動(dòng)脈嚴(yán)重鈣化等,這些血管變化與人類(lèi)動(dòng)脈硬化非常相似。把外源性正常kl cDNA轉(zhuǎn)導(dǎo)給kl基因缺陷小鼠后,其動(dòng)脈硬化程度可顯著改善。本實(shí)驗(yàn)的病理切片也發(fā)現(xiàn),隨著高血壓的發(fā)生,出現(xiàn)了血管管壁彈力纖維增厚、排列紊亂,彈力纖維板層結(jié)構(gòu)破壞;免疫組化CD31標(biāo)記明確顯示內(nèi)皮細(xì)胞不連續(xù),逐漸變薄、缺失等內(nèi)皮損傷改變,且在28 d時(shí)內(nèi)皮缺失,這與我們觀察到的21~28 d時(shí)kl蛋白及NO顯著降低一致。

    以上研究結(jié)果說(shuō)明,在高血壓發(fā)生發(fā)展中,RASS系統(tǒng)激活,kl基因表達(dá)減低,伴隨kl蛋白減少,血管內(nèi)皮受損、動(dòng)脈硬化加重,NO進(jìn)一步產(chǎn)生減少,血管收縮舒張功能失調(diào),氧化應(yīng)激加強(qiáng),最終導(dǎo)致血壓進(jìn)一步升高。提示kl蛋白可能通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)NO的途徑參與血壓調(diào)節(jié)過(guò)程,參與高血壓的發(fā)生發(fā)展。

    猜你喜歡
    收縮壓內(nèi)皮細(xì)胞血壓
    清醒時(shí)不同時(shí)間血壓水平預(yù)測(cè)夜間高血壓的價(jià)值
    穩(wěn)住血壓過(guò)好冬
    淺議角膜內(nèi)皮細(xì)胞檢查
    老年人群收縮壓與射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭預(yù)后的關(guān)系
    血壓偏低也要警惕中風(fēng)
    血壓的形成與降壓
    解放軍健康(2017年5期)2017-08-01 06:27:34
    健康年輕人收縮壓高會(huì)增加動(dòng)脈硬化風(fēng)險(xiǎn)
    雌激素治療保護(hù)去卵巢對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的初步機(jī)制
    改良的心血管健康行為和因素評(píng)分與老年人短時(shí)收縮壓變異性的關(guān)系
    細(xì)胞微泡miRNA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控
    91国产中文字幕| xxx大片免费视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 看十八女毛片水多多多| 日韩视频在线欧美| 欧美成人午夜免费资源| 99热6这里只有精品| 99久久精品国产国产毛片| 美女内射精品一级片tv| 亚洲国产精品一区三区| 欧美精品国产亚洲| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲伊人久久精品综合| 久久免费观看电影| 少妇丰满av| 伊人亚洲综合成人网| 中文字幕人妻丝袜制服| 伦理电影大哥的女人| 国产在视频线精品| 一区二区三区四区激情视频| 久久久久久人妻| 欧美人与善性xxx| 中文天堂在线官网| 成人国产av品久久久| 免费黄色在线免费观看| 午夜影院在线不卡| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 久久久久久人妻| 久久亚洲国产成人精品v| 精品人妻偷拍中文字幕| 高清av免费在线| 高清欧美精品videossex| 久久久久久久国产电影| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 岛国毛片在线播放| 国产国语露脸激情在线看| 一级二级三级毛片免费看| 国产成人aa在线观看| tube8黄色片| 一级黄片播放器| 亚洲丝袜综合中文字幕| 美女大奶头黄色视频| 黑人高潮一二区| 在线观看三级黄色| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 91久久精品国产一区二区成人| 桃花免费在线播放| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 桃花免费在线播放| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 色吧在线观看| 亚洲精品色激情综合| 成人国产av品久久久| 亚洲第一区二区三区不卡| 26uuu在线亚洲综合色| 国产综合精华液| 欧美xxxx性猛交bbbb| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 九九在线视频观看精品| 国产成人免费观看mmmm| 曰老女人黄片| 黄色欧美视频在线观看| 中文天堂在线官网| 欧美少妇被猛烈插入视频| av在线播放精品| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲精品美女久久av网站| 成人手机av| 在线观看国产h片| 亚洲欧美一区二区三区国产| 18+在线观看网站| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 欧美另类一区| 99热全是精品| 午夜福利,免费看| 亚洲精品,欧美精品| 精品一区在线观看国产| 久久99热6这里只有精品| 国产不卡av网站在线观看| 一级,二级,三级黄色视频| 午夜久久久在线观看| 国产 精品1| 两个人免费观看高清视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 日韩三级伦理在线观看| 丝袜脚勾引网站| 亚洲第一av免费看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 午夜av观看不卡| 免费大片18禁| 日韩一区二区三区影片| 久久鲁丝午夜福利片| 国产精品一国产av| 日本av手机在线免费观看| 欧美 日韩 精品 国产| 久久久国产精品麻豆| 少妇人妻久久综合中文| 免费观看的影片在线观看| 日韩视频在线欧美| 只有这里有精品99| 国产成人免费无遮挡视频| 久久久久久久国产电影| 色网站视频免费| 国产一区二区在线观看av| 一区二区三区乱码不卡18| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 少妇丰满av| 美女福利国产在线| 日韩电影二区| 亚洲精品,欧美精品| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲精品国产av蜜桃| 免费av不卡在线播放| 精品一区二区免费观看| 曰老女人黄片| 熟女av电影| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产精品一区二区在线不卡| 国产深夜福利视频在线观看| 欧美三级亚洲精品| 777米奇影视久久| 人妻少妇偷人精品九色| 日韩成人伦理影院| 欧美日韩在线观看h| 久久青草综合色| 九九爱精品视频在线观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产精品人妻久久久影院| 午夜影院在线不卡| 日韩人妻高清精品专区| 一级毛片电影观看| 九九爱精品视频在线观看| 免费高清在线观看日韩| 亚洲欧洲日产国产| 国产精品国产三级国产专区5o| 中国美白少妇内射xxxbb| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区 | 午夜视频国产福利| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| videossex国产| 国产精品久久久久久久久免| 久久亚洲国产成人精品v| 我的老师免费观看完整版| 少妇人妻 视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 国产成人aa在线观看| 日韩成人伦理影院| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 最近最新中文字幕免费大全7| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲国产色片| 亚洲第一av免费看| 国产成人精品久久久久久| 午夜久久久在线观看| 免费观看性生交大片5| 国产黄片视频在线免费观看| 国产成人精品久久久久久| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 大陆偷拍与自拍| 观看av在线不卡| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 欧美成人精品欧美一级黄| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 搡老乐熟女国产| 久久久久网色| 少妇精品久久久久久久| 免费观看av网站的网址| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产亚洲精品久久久com| 久久久久久久国产电影| 久久久国产精品麻豆| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产成人免费无遮挡视频| 另类精品久久| 在线精品无人区一区二区三| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 色哟哟·www| 国模一区二区三区四区视频| 男女无遮挡免费网站观看| av.在线天堂| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产精品久久久久久av不卡| 老女人水多毛片| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲国产最新在线播放| av线在线观看网站| 久久99一区二区三区| 成人国产av品久久久| 大码成人一级视频| 丝袜脚勾引网站| 久久久a久久爽久久v久久| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲av.av天堂| 大码成人一级视频| 人妻人人澡人人爽人人| 久久久久精品性色| 青春草视频在线免费观看| 国产精品一区二区在线观看99| 看非洲黑人一级黄片| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | av黄色大香蕉| 色5月婷婷丁香| 久久久久久伊人网av| 一区二区三区乱码不卡18| 97在线人人人人妻| 高清午夜精品一区二区三区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久99热6这里只有精品| 久久av网站| 国产精品成人在线| 午夜免费鲁丝| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 免费大片18禁| 免费黄色在线免费观看| 久久av网站| 黄片无遮挡物在线观看| 丝袜脚勾引网站| 亚洲人成网站在线观看播放| 桃花免费在线播放| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 老女人水多毛片| 成人毛片60女人毛片免费| 国产亚洲欧美精品永久| 99热全是精品| 黄色一级大片看看| 亚洲国产精品专区欧美| 另类精品久久| 波野结衣二区三区在线| 一区在线观看完整版| 日本爱情动作片www.在线观看| 99热全是精品| 91成人精品电影| 精品视频人人做人人爽| 91久久精品电影网| 国产精品欧美亚洲77777| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 少妇人妻精品综合一区二区| 国产毛片在线视频| 女人久久www免费人成看片| 国产黄频视频在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 久久狼人影院| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 丰满乱子伦码专区| 中文字幕制服av| 九九在线视频观看精品| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产毛片在线视频| 成人国产麻豆网| 午夜福利影视在线免费观看| 蜜桃在线观看..| 99热国产这里只有精品6| 国产精品人妻久久久影院| 在线观看三级黄色| 久久99热这里只频精品6学生| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 九九在线视频观看精品| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产 精品1| 欧美人与善性xxx| 日韩av不卡免费在线播放| 草草在线视频免费看| 91国产中文字幕| 天天操日日干夜夜撸| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 人成视频在线观看免费观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 久久国产精品大桥未久av| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 亚洲欧洲国产日韩| 精品一区二区三区视频在线| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲av中文av极速乱| 久久人人爽av亚洲精品天堂| videos熟女内射| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 欧美最新免费一区二区三区| 精品一区在线观看国产| 一边摸一边做爽爽视频免费| 夫妻性生交免费视频一级片| 中文字幕最新亚洲高清| 久久婷婷青草| 男人操女人黄网站| 久久97久久精品| 亚洲不卡免费看| 一本久久精品| 岛国毛片在线播放| 精品国产一区二区久久| 欧美丝袜亚洲另类| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲精品自拍成人| 在线观看免费高清a一片| 国产色婷婷99| 国产日韩欧美在线精品| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲色图综合在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 女性生殖器流出的白浆| 黑人高潮一二区| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲精品成人av观看孕妇| 精品一品国产午夜福利视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 男男h啪啪无遮挡| 在线观看人妻少妇| 亚洲av欧美aⅴ国产| 日韩强制内射视频| 国产在线一区二区三区精| 色94色欧美一区二区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 一区二区三区四区激情视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| av网站免费在线观看视频| 搡老乐熟女国产| 免费看av在线观看网站| 国产精品久久久久久久电影| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 男女免费视频国产| 高清不卡的av网站| 久久 成人 亚洲| 久久狼人影院| 日本vs欧美在线观看视频| 各种免费的搞黄视频| 亚洲图色成人| 超色免费av| 成人亚洲欧美一区二区av| 一边亲一边摸免费视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久久久久久亚洲中文字幕| 美女国产高潮福利片在线看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 男女无遮挡免费网站观看| 伊人亚洲综合成人网| 一级毛片电影观看| 下体分泌物呈黄色| 赤兔流量卡办理| 视频区图区小说| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲av综合色区一区| 精品熟女少妇av免费看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 一本一本综合久久| 乱码一卡2卡4卡精品| 免费看光身美女| 最新的欧美精品一区二区| 国产精品久久久久成人av| 欧美人与善性xxx| 国产精品免费大片| 十八禁高潮呻吟视频| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| av天堂久久9| 51国产日韩欧美| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产黄片视频在线免费观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 永久免费av网站大全| 国产精品熟女久久久久浪| 男人添女人高潮全过程视频| 欧美三级亚洲精品| 午夜91福利影院| 国产毛片在线视频| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲人成网站在线播| 国产熟女欧美一区二区| 久久青草综合色| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 成人二区视频| 999精品在线视频| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲,一卡二卡三卡| 五月开心婷婷网| 欧美少妇被猛烈插入视频| tube8黄色片| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产在视频线精品| .国产精品久久| 日韩强制内射视频| 成年av动漫网址| 国产成人午夜福利电影在线观看| 欧美日韩综合久久久久久| 伦理电影免费视频| 久久久久久久久久久丰满| 久久女婷五月综合色啪小说| 日日爽夜夜爽网站| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产亚洲欧美精品永久| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 精品一品国产午夜福利视频| av福利片在线| 久久久久网色| 国产精品国产av在线观看| 午夜老司机福利剧场| 9色porny在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 久久精品夜色国产| 考比视频在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 妹子高潮喷水视频| 91久久精品电影网| 中文欧美无线码| 精品少妇内射三级| 大香蕉久久网| 观看美女的网站| 亚洲国产最新在线播放| 女性生殖器流出的白浆| 国精品久久久久久国模美| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产成人精品久久久久久| 亚洲欧美一区二区三区国产| 黑丝袜美女国产一区| 99视频精品全部免费 在线| 中文字幕av电影在线播放| 国产不卡av网站在线观看| 22中文网久久字幕| 最黄视频免费看| 亚洲经典国产精华液单| 黑丝袜美女国产一区| 色吧在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 久热这里只有精品99| 成人黄色视频免费在线看| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲高清免费不卡视频| 成年av动漫网址| 蜜桃久久精品国产亚洲av| www.av在线官网国产| 成人国产av品久久久| 国产 一区精品| 黄片播放在线免费| 国产日韩欧美在线精品| 26uuu在线亚洲综合色| 韩国av在线不卡| 不卡视频在线观看欧美| 搡老乐熟女国产| 精品一区二区三卡| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲五月色婷婷综合| 中文欧美无线码| 久久99热6这里只有精品| 美女大奶头黄色视频| 一本大道久久a久久精品| 国产一级毛片在线| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲综合色惰| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美人与善性xxx| 成人黄色视频免费在线看| 高清在线视频一区二区三区| 日韩中字成人| 国产视频内射| 日韩一本色道免费dvd| 丝袜美足系列| 免费黄色在线免费观看| √禁漫天堂资源中文www| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 91成人精品电影| 男女边摸边吃奶| 久久 成人 亚洲| kizo精华| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲精品视频女| 国产av国产精品国产| 午夜影院在线不卡| 高清午夜精品一区二区三区| 国产精品欧美亚洲77777| 飞空精品影院首页| 99精国产麻豆久久婷婷| 精品久久久久久久久av| 国产视频内射| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产黄频视频在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 久久这里有精品视频免费| 少妇人妻 视频| 国产精品蜜桃在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 最新的欧美精品一区二区| 简卡轻食公司| 男女免费视频国产| 少妇的逼好多水| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲天堂av无毛| 在线观看免费高清a一片| 亚洲经典国产精华液单| 9色porny在线观看| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产黄频视频在线观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 人成视频在线观看免费观看| www.色视频.com| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲成色77777| 国模一区二区三区四区视频| 三级国产精品欧美在线观看| 日本欧美国产在线视频| 欧美三级亚洲精品| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 丝瓜视频免费看黄片| 22中文网久久字幕| 国产老妇伦熟女老妇高清| 男的添女的下面高潮视频| 热99国产精品久久久久久7| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 中文字幕最新亚洲高清| 蜜桃在线观看..| 少妇丰满av| 久久精品国产a三级三级三级| 人人妻人人澡人人看| 日本黄色片子视频| 欧美精品一区二区免费开放| 国产精品一区www在线观看| 91国产中文字幕| 欧美 日韩 精品 国产| xxx大片免费视频| 老熟女久久久| 在线观看www视频免费| 最近的中文字幕免费完整| 97超碰精品成人国产| 欧美+日韩+精品| 日韩一本色道免费dvd| 久久人人爽人人片av| 亚洲一区二区三区欧美精品| 乱人伦中国视频| 免费观看a级毛片全部| 青春草视频在线免费观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 成人影院久久| 欧美激情国产日韩精品一区| 9色porny在线观看| 黄色一级大片看看| 春色校园在线视频观看| 男人操女人黄网站| 特大巨黑吊av在线直播| 日韩人妻高清精品专区| 另类精品久久| 日本午夜av视频| 婷婷色av中文字幕| 精品久久久久久久久亚洲| 香蕉精品网在线| 在线观看免费日韩欧美大片 | av国产久精品久网站免费入址| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲四区av| 亚洲一区二区三区欧美精品| 老女人水多毛片| 九色成人免费人妻av| 婷婷色av中文字幕| 国产极品天堂在线| 国产精品久久久久久精品电影小说| 中文字幕久久专区| 国产精品免费大片| 亚洲精品一区蜜桃| 在线观看免费日韩欧美大片 | 国产日韩欧美亚洲二区| 我的女老师完整版在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲欧洲国产日韩| 人妻系列 视频| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 夫妻午夜视频| 色5月婷婷丁香| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲三级黄色毛片| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 这个男人来自地球电影免费观看 | 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 免费看不卡的av| 一区在线观看完整版| 中文字幕免费在线视频6| 日韩伦理黄色片| 91成人精品电影| 一级,二级,三级黄色视频| 一个人免费看片子| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 三上悠亚av全集在线观看| 久久久久久伊人网av| 免费看光身美女| 街头女战士在线观看网站| 婷婷成人精品国产| 亚洲国产av影院在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲av.av天堂| 99热6这里只有精品| 母亲3免费完整高清在线观看 |