HPLC法測定鼻通丸中黃芩苷的含量*

覃 亮，彭梅妃，吳堅毅，張清杰，馮 娟

(1 肇慶學院食品與制藥工程學院，廣東 肇慶 526061；2 茂名市食品藥品檢驗所，廣東 茂名 525000；

鼻通丸，由蒼耳子、辛夷、白芷、鵝不食草、薄荷、黃芩、甘草七味中藥加工制成。清風熱，解熱毒，通鼻竅之功效[1]。本品主要用于外感風寒而引起的風寒風熱、感冒，鼻塞流涕，頭痛流淚以及慢性鼻炎[2]。方中黃芩雖為臣藥，但其藥理作用非常重要，藥典標準沒有黃芩的定量指標.本方法參照《中國藥典》2010年版一部[3]，對鼻通丸中黃芩苷進行含量測定。為了使其內在的質量得到更好地控制，本試驗采取高效液相色譜法對本品中黃芩的有效成分黃芩苷的含量進行了研究和分析，以更好地控制產品質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津司；BT125D電子天平(十萬分之一)，瑞士梅特勒-托利多公司；KQ-500DA數(shù)控超聲波清洗器，昆明市超聲儀有限公司；UV-2450紫外分光光度計，日本島津；HY-5回旋式振蕩器，上海一恒科學儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；UPW-20NE超純水純水器，沃特爾有限公司。

1.2 試 劑

鼻通丸，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠；黃芩苷對照品，中國藥品生物制品鑒定所；HPLC所用試劑為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱定含量為93.3%的黃芩苷對照品6.11 mg，置于200 mL的容量瓶中，加入70%的乙醇適量，使其溶解，并稀釋至刻度，制成每1 mL中含有30.55 μg黃芩苷的溶液，搖勻，用0.45 μm濾頭濾過，作為對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

取本品大蜜丸適量，約1.0 g，剪碎，精密稱定，置于100 mL含塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇90 mL，密塞，稱定整體重量，進行超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)，經過30 min處理后，放置回旋式振蕩器上振蕩(使冷卻，振搖使溶解均勻)，再稱定其重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾3 mL置于10 mL的容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，用0.45 μm的濾頭濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.3 陰性溶液的制備

按照處方配比，取除了黃芩以外的其他六味藥材，粉碎成細粉，過篩，混勻備用。按照供試品溶液的制備方法，制成缺少黃芩的陰性樣品溶液，用0.45 μm濾頭濾過，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：十八硅烷鍵合硅膠為填充劑[4]；流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液=45:55；流速：0.9 mL/min；柱子：Diamonsil C8(250 mm×4.6 mm，5 μL)色譜柱；柱溫：35 ℃；泵壓不大于25 MPa；定量方法：外標法；進樣量：10 μL；檢測波長為277 nm。理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計算應不低于2000。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性實驗

吸取鼻通丸供試品溶液、黃芩苷對照品溶液以及陰性對照品溶液各10 μL，分別注入色譜儀，驗證陰性是否有干擾。經測定，鼻通丸中黃芩苷在擬定的色譜條件中檢測出黃芩苷峰，陰性溶液無干擾，表明該法專屬性良好。結果見圖1。

圖1 A黃芩苷對照品(tR=7.200, n=5405)；B供試品(tR=7.298,n=5197)；C陰性對照

2.3.2 線性關系考察

精密量取黃芩苷對照品(30.5500 μg/mL)溶液2、4、6、8、9、10 mL，分別置于10 mL的容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖動均勻，即得6個濃度(6.1100 μg/mL、12.2200 μg/mL、18.3300 μg/mL、24.4400 μg/mL、27.4910 μg/mL、30.5500 μg/mL)的對照品溶液，各進樣10 μL，注入液相色譜儀中測定[5]。以對照品濃度(μg/mL)為橫坐標(x)，峰面積為縱坐標(y)，繪制標準曲線，得y=36080x-1890.9，R2=0.9998回歸方程，結果表明黃芩苷在6.1100～30.5500 μg/mL范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.3.3 精密度試驗

取同一濃度(30.5500 μg/mL)的對照品溶液，按擬定的色譜條件連續(xù)進樣6次，測得黃芩苷的色譜圖峰面積。實驗結果顯示樣品峰面積大小接近，RSD=0.15%(n=6)，小于3%，精密度良好,結果見表1。

表1 精密度試驗結果

2.3.4 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液，按照含量測定方法，分別在0、4、8、12、16、24 h進樣10 μL進行測定，記錄色譜圖峰面積。實驗結果顯示不同時段測得黃芩苷的峰面積平均值是1425062，RSD%=1.16%(n=6)，(見表2)說明本品制備后24 h內穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性試驗結果

2.3.5 重復性試驗

取同一批號樣品，按照“2.3.2”項下的方法制備供試品溶液6份，平行地進行6次試驗測試，記錄色譜圖峰面積。實驗結果顯示，6份鼻通丸中含有黃芩苷的量均在10.8154～10.9575 mg/g之間，平均值為10.8867，RSD=1.05%，相對標準偏差較小，不超過規(guī)定范圍RSD%=3%，結果表明本方法重現(xiàn)性良好(見表3)。

表3 重復性試驗結果

2.3.6 加樣回收試驗

取同一已知含量(含量10.8867 mg)的供試品6份，每份取樣量是供試品(1 g)的50%，分別精密加入黃芩苷對照品6.0010 mg，按“2.3.2”項下供試品溶液的制備方法制備溶液，再按照上述相同的色譜條件進行含量測定，記錄色譜圖，按外標法計算黃芩苷的平均加樣回收率。結果表明，6次同一供試品溶液中測得黃芩苷的平均回收率為98.70%，RSD%=0.2%，所測得結果不超過規(guī)定的平均回收率95%～105%范圍，表明該方法可行(見表4)。

表4 加樣回收試驗結果

2.3.7 樣品含量測定

取三個不同批號的樣品，每一個批號的供試品平行取兩份，根據(jù)“2.3.2”項下的方法制備供試品溶液，分別吸取已有的對照品和供試品各10 μL注入液相色譜儀中進行測定，記錄測定的圖譜數(shù)據(jù)。結果顯示，三個批號的鼻通丸中黃芩苷的含量略有不同，但是RSD%都較小，表明該方法穩(wěn)定，且可行(見表5)。

表5 鼻通丸含量測定結果

3 結 論

經過試驗，確立了利用高效液相測定鼻通丸中黃芩苷含量的方法。本法采用Diamonsil C8(250 mm×4.6 mm，5 μL)色譜柱，甲醇-0.4%磷酸溶液=45:55作為流動相，277 nm為檢測波長，流速為0.9 mL/min，測定鼻通丸中黃芩苷的含量，黃芩苷的線性關系良好，精密性，重現(xiàn)性，穩(wěn)定性試驗結果良好。