礬根‘萊姆里基’愈傷組織誘導(dǎo)及快速繁殖技術(shù)

侯非凡，程宵婧，荊曉楠，王榮梅，王金耀，亢秀萍，李森*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷030801；2.設(shè)施園藝工程技術(shù)研究中心，山西 太谷030801；3.山西省設(shè)施蔬菜提質(zhì)增效協(xié)同創(chuàng)新中心，山西太谷030801）

礬根（Heuchera micrantha）又名珊瑚玲，是虎耳草科礬根屬彩葉草本花卉，原產(chǎn)于美洲地區(qū)，國內(nèi)90年代初開始引進(jìn)并應(yīng)用于工程花卉方面［1］。其對生長環(huán)境要求簡單，在半蔭（40%遮光度）、全光、干旱、寒冷（?15℃）的條件下都能正常生長，具有抗病蟲和吸收重金屬的能力［2～4］。礬根葉色豐富，有深紫色，明黃、橙紅色等單色系，也有多種類型的復(fù)色系，花朵小，花期集中在4～6月［5］。優(yōu)越的生理特性讓礬根擁有廣闊的應(yīng)用市場，如可作室內(nèi)觀賞植物應(yīng)用于盆栽，也可以應(yīng)用于花壇、花境、庭院綠化、立體造景等園林綠化。

礬根繁殖方式因品種而異，主要有播種、葉插、分株、組織培養(yǎng)等，但前3種方式受繁殖速度慢、養(yǎng)護(hù)難度大、成活比率低、成苗規(guī)模小等缺點限制了優(yōu)良新品種的推廣和應(yīng)用［6～8］。已有多種研究表明，組織培養(yǎng)是實現(xiàn)快速繁殖種苗和保留良種優(yōu)勢的最佳途徑［9］?，F(xiàn)已開展了許多礬根品種的組織培養(yǎng)研究，分別建立了以‘瀑布’、‘飴糖’、‘紫色宮殿’3個礬根品種的莖尖［10］，礬根雜種‘銀王子’帶頂芽和腋芽的幼嫩莖段或葉鞘［11］，礬根‘莓果’的葉片和葉柄［12］，礬根‘葡萄蘇打’帶有腋芽的莖段［13］等為外植體的組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)。由于基因型不同，品種之間有一定的差異，仍有大部分礬根品種的組織快繁技術(shù)體系尚未成功建立。

礬根‘萊姆里基’（Heuchera micrantha‘Lemriki’）葉色黃綠，生命力旺盛，清新明亮的顏色使其在與其他葉色較暗植物進(jìn)行園林配置時發(fā)揮了重要作用。此前還沒有關(guān)于礬根‘萊姆里基’品種組織培養(yǎng)方面的研究，本研究通過對礬根‘萊姆里基’幼嫩莖段、葉柄、葉片為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，明確不同消毒時間的滅菌效果以及對3個外植體愈傷誘導(dǎo)的影響，研究不同配比的激素對3個外植體愈傷組織誘導(dǎo)，對莖段不定芽及不定根誘導(dǎo)的影響。旨在初步建立一套礬根‘萊姆里基’快速繁殖體系，為解決礬根傳統(tǒng)繁殖方式速度慢的難題，促進(jìn)礬根標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；a(chǎn)和新品種的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以山西農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉實踐教學(xué)基地盆栽礬根‘萊姆里基’為試驗材料，分別取其幼嫩莖段，葉片及葉柄作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。

1.2 外植體預(yù)處理

礬根‘萊姆里基’爆盆后，取其新萌芽的分枝，從根莖交接處切開取其幼嫩莖段和健康完整葉在流水中輕輕揉搓沖洗，洗凈后浸泡在無菌水中放置于超凈工作臺備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同消毒時長對不同外植體污染率、褐化率和愈傷率的影響

采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計，選擇預(yù)處理后的幼嫩莖段、葉片、葉柄分別作為外植體材料，首先用75%的酒精浸泡30 s，無菌水沖洗2～3次，再用0.1%的升汞溶液浸泡不同時間（6 min、8 min、10 min）后無菌水沖洗6～8次，分別切成3～5 mm厚的莖段，1 cm左右長的葉柄，約1 cm×1 cm的葉片接 種 于4.8 g·L-1MS粉+1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+5.3 g·L-1瓊脂，pH：5.8～6.2的培養(yǎng)基上，每瓶接種6個外植體，重復(fù)3次，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計其污染率、褐化率和愈傷率。

1.3.2 不同濃度激素對葉柄和葉片誘導(dǎo)愈傷的影響

參考孫翊等［14］對礬根葉柄或葉片作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)研究結(jié)果，篩選激素濃度范圍。采用兩因素完全隨機(jī)設(shè)計細(xì)化不同激素濃度6-BA（0.1、0.5、1.0 mg·L-1）和NAA（0.01、0.05、0.10 mg·L-1）組合分別對葉柄、葉片誘導(dǎo)愈傷的影響，每瓶接種6個外植體，重復(fù)3次，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計其愈傷率和生長狀況。

1.3.3 不同濃度激素對莖段誘導(dǎo)愈傷和不定芽的影響

參考陳宏等［15］對礬根莖段作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)研究的結(jié)果，篩選激素濃度范圍。采用兩因素完全隨機(jī)設(shè)計研究不同激素濃度6-BA（0.1 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1）和NAA（0.01 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.10 mg·L-1）對莖段誘導(dǎo)愈傷和不定芽的影響。每瓶接種3個外植體，重復(fù)3次，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計其愈傷率和不定芽率。

1.3.4 不同濃度激素對莖段不定芽誘導(dǎo)生根的影響

選取生長狀況良好的莖段不定芽作為生根培養(yǎng)的試驗材料，以1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計，選取植物激素IBA（0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1）和NAA（0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1）分別對莖段不定芽誘導(dǎo)生根，其它條件設(shè)置為蔗糖30 g·L-1，瓊脂5.3 g·L-1，MS粉4.8 g·L-1，pH：5.8～6.2，每瓶接種2個芽，每個處理重復(fù)4次，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計其生根率和根系狀況。

1.3.5 培養(yǎng)條件

組培室溫度維持在21℃，誘導(dǎo)初期進(jìn)行遮光處理，出現(xiàn)愈傷組織或不定芽后，每日光照16 h，黑暗8 h。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

污染率=污染外植體數(shù)/總外植體數(shù)

褐化率=褐化外植體數(shù)/總外植體數(shù)

愈傷率=產(chǎn)生愈傷外植體數(shù)/總外植體數(shù)

不定芽率=產(chǎn)生不定芽外植體數(shù)/總外植體數(shù)

生根率=生根芽數(shù)/接種芽數(shù)

使用Excel 2019和SAS 9.2分別進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時長對不同外植體污染率、褐化率和愈傷率的影響

隨著消毒時間的增加，各處理中污染率逐漸降低，褐化率逐漸增加，愈傷率的大小因外植體材料而異（表1）。由表1可見，當(dāng)葉柄為外植體時，消毒10 min污染率（3.70%）極低于其它處理，褐化率（27.78%）稍高于其它處理，但愈傷率（66.67%）最高，消毒6 min時，褐化率（3.70%）和愈傷率（56.79%）最低，污染率（37.07%）偏高，所以葉柄的最佳消毒時長為10 min。當(dāng)莖段為外植體時，消毒時間6 min污染率（18.51%）偏高，但愈傷率（66.67%）明顯高于其它處理，褐化率（24.69%）明顯低于其它處理，所以依據(jù)本試驗?zāi)康?，消? min是莖段的最佳消毒時長。當(dāng)葉片為外植體時，消毒時間6 min時所有材料褐化，不能進(jìn)行下階段試驗。消毒8 min愈傷率（62.22%）約為消毒10 min的2倍，污染率（22.22%）偏高，但褐化率（4.44%）極低，所以消毒8 min為葉片的最佳消毒時長。

表1 不同消毒時長對不同外植體污染率、褐化率和愈傷率的影響Table 1 Effect of different disinfection duration on pollution rate，browning rate and callus rate of different explants

2.2 不同濃度激素對葉柄誘導(dǎo)愈傷的影響

由表2可見，處理2、處理3、處理8、處理9的愈傷率較其它處理高，都達(dá)到90%以上，其中處理2、處理8誘導(dǎo)出的愈傷組織玻璃化程度嚴(yán)重，處理3、處理9誘導(dǎo)出愈傷組織色綠緊密通透，未出現(xiàn)玻璃化，處理9愈傷率（91.11%）高于處理3。葉柄愈傷組織誘導(dǎo)最佳激素配比為處理9，最佳培養(yǎng)基配方為：4.8 g·L-1MS粉+1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗 糖+5.3 g·L-1瓊 脂，pH：5.8～6.2，愈傷率為91.11%。圖1為色綠緊密通透的不同時期葉柄愈傷組織。

表2 不同濃度激素對葉柄誘導(dǎo)愈傷的影響Table 2 Effects of different concentrations of hormones on callus induction from petiole

2.3 不同濃度激素對葉片誘導(dǎo)愈傷的影響

不同激素配比對葉片作為外植體誘導(dǎo)愈傷的差異顯著。由表3可見，通過對比分析在6-BA濃度 相 同 時，當(dāng)NAA濃 度 為0.1 mg·L-1愈 傷 率 最高，當(dāng)NAA濃度為0.01 mg·L-1愈傷率最低；處理6與處理9愈傷組織深綠，體積大；且處理9愈傷率最高，達(dá)90%。葉片愈傷組織誘導(dǎo)最佳激素配比為處理9，最佳培養(yǎng)基為：4.8 g·L-1MS粉+1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗 糖+5.3 g·L-1瓊脂，愈傷率為90%。圖2為礬根‘萊姆里基’葉片綠色致密愈傷組織。

圖1 不同時期的礬根‘萊姆里基’葉柄愈傷組織Fig.1 Petiole callus of Heuchera micrantha‘Lemriki’at different stages

表3 不同濃度激素對葉片誘導(dǎo)愈傷的影響Table 3 Effects of different concentrations of hormones on callus induction from leaf

圖2 礬根‘萊姆里基’葉片愈傷組織Fig.2 Callus of Heuchera micrantha‘Lemriki’leaves

2.4 不同濃度激素對莖段誘導(dǎo)愈傷、不定芽、生根的影響

2.4.1 不同濃度激素對莖段誘導(dǎo)愈傷和不定芽的影響

不同激素配比對莖段作為外植體誘導(dǎo)的影響差異顯著。由表4可見，6-BA濃度為0.1～0.5 mg·L-1時，外植體可以直接誘導(dǎo)出不定芽，當(dāng)激素配比為處理2時，不定芽率（72.20%）最高。當(dāng)6-BA濃度為1 mg·L-1時，外植體則誘導(dǎo)出愈傷組織，NAA濃度為0.05 mg·L-1時，愈傷率（75.00%）最高。6-BA濃 度 高 于0.5 mg·L-1時，隨著NAA濃度的升高，芽上葉片開始出現(xiàn)水腫，形狀扭曲，6-BA濃度高于1 mg·L-1時，葉片形狀幾乎完全扭曲，傷口處出現(xiàn)大量愈傷組織。莖段最佳愈傷誘導(dǎo)激素配比為處理8，培養(yǎng)基為：4.8 g·L-1MS粉+1 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+5.3 g·L-1瓊脂，愈傷率為75.00%。莖段不定芽誘導(dǎo)的最佳激素配比為處理2，最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基 為：4.8 g·L-1MS粉+0.1 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗 糖+5.3 g·L-1瓊脂，誘導(dǎo)率高達(dá)72.20%。圖3為礬根‘萊姆里基’莖段誘導(dǎo)的不定芽。

2.4.2 不同濃度激素對不定芽誘導(dǎo)生根的影響

不同激素種類生根效果不同，生根率差異較大，根系狀況不一。由表5可以看出，處理2、處理3根系狀況良好，但生根率較低，處理4、處理5根系狀況略差，但生根率最高，說明在添加NAA時，根系健壯，須根密集，但生根率較差，添加IBA時，誘導(dǎo)率最高，主根較粗，雖須根較稀疏，但很健壯，當(dāng)IBA濃 度 達(dá) 到1 mg·L-1時，生 根 率 可 達(dá) 到100%。生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為：2.4 g·L-1MS粉+1.0 mg·L-1IBA的+30 g·L-1蔗糖+5.3 g·L-1瓊脂。圖4為礬根‘萊姆里基’莖段不定芽的根系。

表4 不同濃度激素對莖段誘導(dǎo)愈傷和不定芽的影響Table 4 Effects of different hormone concentrations on stem callus and adventitious bud induction

圖3 礬根‘萊姆里基’莖段誘導(dǎo)的不定芽Fig.3 Adventitious buds induced by stem segments of Heuchera micrantha‘Lemriki’

3 討論與結(jié)論

消毒時間對礬根不同部位的消毒效果影響顯著，本試驗得出礬根‘萊姆里基’葉柄、莖段和葉片的最佳消毒時間分別為：0.1%升汞6 min，8 min，10 min。礬根葉片表面有絨毛，徹底消毒所需時間最長，葉柄和莖段表面光滑，消毒時間稍短于葉片。外植體消毒不僅要求殺菌劑能把材料表面上的各種微生物殺滅，同時又不能損傷或只輕微損傷組織材料而不影響其生長。預(yù)試驗中使用2%次氯酸鈉為消毒液時，處理時間為3 min時外植體傷口處開始出現(xiàn)褐化，6 min時傷口處完全褐化，這可能與次氯酸鈉溶液的堿性很強(qiáng)，對植物材料有強(qiáng)大的破壞作用有關(guān)［16］，所以2%次氯酸鈉不適宜礬根‘萊姆里基’品種的消毒，但2%次氯酸鈉在‘歐布西迪昂’、‘紅貝露’等礬根品種組培外植體消毒過程中仍然適用［17，18］，礬根品種與消毒方式的選擇影響很大。

表5 不同濃度激素對生根的影響Table 5 Effects of different hormone types and concentrations on root system

圖4 礬根‘萊姆里基’莖段不定芽根系Fig.4 Root system of adventitious buds in stem segment of Heuchera micrantha‘Lemriki’

培養(yǎng)基中激素的配比對植物的分化與生長具有重要的調(diào)節(jié)作用，是影響植物離體快繁的重要因素之一。本試驗得出礬根‘萊姆里基’葉柄和葉片的最佳愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：4.8 g·L-1MS粉+1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30g·L-1蔗 糖+5.3 g·L-1瓊脂，愈傷率為91.11%、90.00%。莖段最佳愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：4.8 g·L-1MS粉+1 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗 糖+5.3 g·L-1瓊脂，愈傷率為75%。陳宏等［15］研究的礬根‘布朗尼’帶莖尖幼嫩莖段的最佳愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng) 基 為MS+0.5 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA，王晶等［8］研究的礬根‘香茅’和‘飴糖’芽最佳愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA，激素比例差異明顯，這表明不同品種和不同外植體愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基種類差異極大。

礬根‘萊姆里基’莖段可以直接誘導(dǎo)出不定芽，省去了由愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的時間，提高了組培育苗的效率。本試驗中莖段可以直接誘導(dǎo)出不定芽，最佳不定芽誘導(dǎo)導(dǎo)培養(yǎng)基為：4.8 g·L-1MS粉+0.1 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗 糖+5.3 g·L-1瓊 脂，誘 導(dǎo) 率 高 達(dá)72.2%。邵雅東等［12］研究發(fā)現(xiàn)礬根‘莓果’不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA。這說明高濃度的6-BA和低濃度的NAA更適于植物組織不定芽的誘導(dǎo)。

礬根‘萊姆里基’莖段不定芽最佳生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：2.4 g·L-1MS粉+1.0 mg·L-1IBA+30 g·L-1蔗糖+5.3 g·L-1瓊脂，生根率可達(dá)100%，且根系健壯。除礬根‘花毯’的生根最佳基本培養(yǎng)基為MS固體培養(yǎng)基外［19］，其余都是1/2 MS固體培養(yǎng)基。田莉等［20］研究發(fā)現(xiàn)礬根‘巴黎’不定芽的最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+1.0 mg·L-1IBA，生根率高達(dá)100%，孫翊［14］等研究發(fā)現(xiàn)礬根‘紫色宮殿’的最適生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基是1/2 MS+0.2 mg·L-1NAA，生根率為100%。IBA和NAA都是人工合成生長激素，添加IBA處理可有效提高組培苗生根率，促進(jìn)產(chǎn)生較多根系數(shù)量；NAA可使根系直徑變大［21，22］?？梢姡谏囵B(yǎng) 基中單獨(dú)使用IBA或NAA都能達(dá)到最佳的生根效果。