響應(yīng)面法優(yōu)化針葉櫻桃總黃酮的提取工藝及其抗氧化活性研究

楊 志，李文義，，*，高云濤，熊華斌，陳毅堅(jiān)，楊慧娟

(1.云南民族大學(xué) 云南省跨境民族地區(qū)生物質(zhì)資源清潔利用國(guó)際聯(lián)合研究中心，云南 昆明 650500； 2.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500； 3.中國(guó)計(jì)量大學(xué) 標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)院，浙江 杭州 310018)

針葉櫻桃(Acerola cherry)是金虎尾科小灌木果樹(shù)的果實(shí)，原產(chǎn)美洲熱帶地區(qū)，之后引種至印度等熱帶及亞熱帶地區(qū)。近年來(lái)，我國(guó)云南、臺(tái)灣、廣東等地也開(kāi)始大面積種植。針葉櫻桃口感美味、維生素C含量豐富且具有觀賞性，因而深受消費(fèi)者喜愛(ài)，在食品保健品、化妝品等領(lǐng)域有廣闊的市場(chǎng)需求。據(jù)分析，每100 g針葉櫻桃果實(shí)的可食用部分中，維生素C含量高達(dá)1 910～2 976 mg，是目前已知維生素C含量最高的果樹(shù)果實(shí)。因此，針葉櫻桃有“植物維C果王”之稱[1]。值得關(guān)注的是，針葉櫻桃富含黃酮類營(yíng)養(yǎng)素，黃酮可提高針葉櫻桃中維生素C的吸收和利用率。目前，關(guān)于針葉櫻桃果實(shí)中總黃酮的相關(guān)研究報(bào)道較少。

黃酮類化合物是廣泛存在于某些植物和漿果中的一類天然產(chǎn)物，是植物中最重要的活性成分之一。研究表明，黃酮類化合物具有抗氧化、抗衰老、消炎殺菌、改善血液循環(huán)、降低膽固醇等功效[2-5]。本研究采用有機(jī)溶劑對(duì)針葉櫻桃中的總黃酮進(jìn)行提取，選用毒害作用小且經(jīng)濟(jì)的乙醇作為溶劑，參考已有文獻(xiàn)確定的提取溫度71 ℃、提取時(shí)間1.6 h條件下，研究櫻桃破碎目數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比等因素對(duì)黃酮提取率的影響[6-8]，并利用響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，之后再進(jìn)一步探究針葉櫻桃果實(shí)中總黃酮的抗氧化活性[9-11]，以期為針葉櫻桃的開(kāi)發(fā)利用提供相關(guān)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

針葉櫻桃果粉，西安瑞盈生物科技有限公司；蘆丁(Rutin)標(biāo)準(zhǔn)品，妍謹(jǐn)生物科技有限公司；DPPH，美國(guó)Sigma公司；Trolox粉(水溶VE)，合肥博美生物科技有限公司；無(wú)水乙醇和AlCl3，云南科儀化玻有限公司；VE標(biāo)準(zhǔn)品，洛陽(yáng)氚坤化工儀器有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

8453紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)安捷倫公司；SHJ-4恒溫水浴鍋，慈溪市天東衡器廠；SHZ-DШ循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；FA2004分析天平，上海上平儀器公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總黃酮提取

取一定量針葉櫻桃粉末，過(guò)篩除雜，71 ℃恒溫水浴浸泡提取1.6 h，其他因素控制具體按單因素設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得浸提液用循環(huán)水真空泵進(jìn)行抽濾，得到樣品，置于冰箱保鮮儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總黃酮含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取20 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用純水溶解并定容至100 mL容量瓶中，搖勻，置陰涼處備用。分別移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于6個(gè)25 mL的具塞比色管中，分別加入1%的AlCl3溶液5 mL，再用純水定容至10 mL，在室溫下靜置25 min。在415 nm吸收波長(zhǎng)下，以試劑空白為參比測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得回歸方程為y=2.812 5x-0.017 6，R2=0.999 2，線性良好。

取5.0 mL供試品倒入25 mL比色管中，再加入1%的AlCl3溶液5 mL，在415 nm吸收波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取率。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

本研究涉及櫻桃破碎目數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比三個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的影響，在探討某個(gè)單因素的影響時(shí)，固定其余兩個(gè)參數(shù)的數(shù)值。設(shè)計(jì)工藝參數(shù)：櫻桃破碎目數(shù)為30、40、50、60、70；乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%、30%、40%、50%、60%；液料比為20、30、40、50。固定參數(shù)取值：櫻桃破碎目數(shù)50，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，液料比30。研究不同提取條件對(duì)針葉櫻桃總黃酮提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)

根據(jù)優(yōu)化軟件Design Expert(7.0.1)中Box-Behnken的實(shí)驗(yàn)方法，以櫻桃破碎目數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比為相應(yīng)因素，以針葉櫻桃黃酮提取量為響應(yīng)值，設(shè)立三個(gè)因素三個(gè)水平的響應(yīng)面分析進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)。

表1 響應(yīng)面因素水平及編碼Table 1 Factor levels and coding

1.3.5 針葉櫻桃總黃酮抗氧化活性測(cè)定

針葉櫻桃總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除作用參照文獻(xiàn)[12-13]進(jìn)行測(cè)定。用Trolox溶液對(duì)DPPH自由基進(jìn)行測(cè)定實(shí)驗(yàn)，計(jì)算自由基清除率，得線性回歸方程：y=274.58x-0.9695，R2=0.992。

再將響應(yīng)面圖等高線分析得到的最佳提取工藝參數(shù)作為實(shí)驗(yàn)組，設(shè)立對(duì)照組1(實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：櫻桃破碎目數(shù)55、乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、液料比25)和對(duì)照組2(實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：櫻桃破碎目數(shù)65、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、液料比35)，對(duì)提取液進(jìn)行DPPH自由基測(cè)定，得出DPPH自由基當(dāng)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013整理匯總實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用Design Expert(7.0.1)軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，采用Microsoft Excel 2013作圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 破碎目數(shù)對(duì)針葉櫻桃黃酮提取率的影響

如圖1所示，在相同條件下，開(kāi)始時(shí)隨著針葉櫻桃破碎目數(shù)的升高，總黃酮的提取率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)櫻桃破碎目數(shù)為60時(shí)提取率最高，之后隨著破碎目數(shù)的繼續(xù)增加，提取率開(kāi)始下降?？赡苁怯捎谄扑槟繑?shù)的增加，有助于黃酮的溶出；但過(guò)度的破碎可能會(huì)使針葉櫻桃黃酮類衍化物受到破壞。故選取櫻桃破碎目數(shù)為55～65用于進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖1 破碎目數(shù)對(duì)針葉櫻桃黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of different mesh number on extraction efficiency of flavonoids of Acerola cherry

2.1.2 液料比對(duì)針葉櫻桃黃酮提取率的影響

如圖2所示，在相同條件下，當(dāng)溶劑與針葉

圖2 液料比對(duì)針葉櫻桃黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of different liquid-solid ratio on extraction efficiency of flavonoids of Acerola cherry

櫻桃的比例比值在20～30時(shí)，針葉櫻桃中總黃酮的提取率隨著比值的增大而提高，之后稍有下降的趨勢(shì)并趨于平穩(wěn)。所以，選取溶劑與針葉櫻桃的比例為25～35用于進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)針葉櫻桃總黃酮提取率的影響

如圖3所示，在相同條件下，針葉櫻桃總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大逐漸上升，說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，有助于針葉櫻桃中總黃酮的溶出，因而提取效果越好，可以通過(guò)適當(dāng)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)來(lái)提高針葉櫻桃中總黃酮類物質(zhì)的浸提效率。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)針葉櫻桃黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol volumn fraction on extraction efficiency of flavonoids of Acerola cherry

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與優(yōu)化分析

2.2.1 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面分析結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸和二次項(xiàng)方程擬合，得到的黃酮提取率(y)對(duì)櫻桃破碎目數(shù)(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)和液料比(C)的二次多項(xiàng)式回歸方程為y=87.08+0.16A-0.45B-0.45C-0.35AB+0.18AC-0.48BC-5.44A2-5.60B2-5.21C2。方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表2 響應(yīng)面分析結(jié)果Table 2 Results of response surface analysis

表3 響應(yīng)面方差分析Table 3 Analysis of variance for response surface quadratic model

此外，二次項(xiàng)破碎目數(shù)(A2)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B2)和液料比(C2)的P值<0.05對(duì)黃酮提取率回歸模型有極顯著影響，交互項(xiàng)AB、BC、AC的P值>0.05不顯著，說(shuō)明破碎目數(shù)(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)和液料比(C)之間的相互作用對(duì)針葉櫻桃黃酮提取率的影響較弱。

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化及工藝驗(yàn)證

采用優(yōu)化軟件Design Expert(7.0.1)繪制響應(yīng)面分析圖，結(jié)果如圖4至圖6所示。由圖4的3D曲面圖和等高平面圖可知，極值點(diǎn)存在于近圓心處，說(shuō)明黃酮提取率在適當(dāng)?shù)臋烟移扑槟繑?shù)和乙醇體積分?jǐn)?shù)下有極大值；響應(yīng)面的坡度較小且為圓形，說(shuō)明櫻桃破碎目數(shù)和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用的相關(guān)性不高，對(duì)黃酮提取率影響不明顯。

圖4 櫻桃破碎目數(shù)和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用對(duì)黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface of mesh number and ethanol volumn fraction interaction effects on the extraction of flavonoids

由圖5的3D曲面圖和等高平面圖可知，在圓心的位置可看到有極值點(diǎn)，說(shuō)明黃酮提取率在適當(dāng)?shù)臋烟移扑槟繑?shù)和液料比下可得到極大值；響應(yīng)面的坡度較小且為圓形，說(shuō)明提取黃酮時(shí)，櫻桃破碎目數(shù)與乙醇體積分?jǐn)?shù)的相關(guān)性不顯著。

圖5 櫻桃破碎目數(shù)和液料比的交互作用對(duì)黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of mesh number and liquid-solid ratio interaction effects on the extraction of flavonoids

由圖6可知，響應(yīng)面的極值點(diǎn)存在于圓心處，說(shuō)明黃酮提取率在適當(dāng)?shù)囊掖俭w積分?jǐn)?shù)和液料比下有極大值；響應(yīng)面的坡度較小且為形狀圓形，說(shuō)明提取黃酮時(shí)，液料比與乙醇體積分?jǐn)?shù)的相關(guān)性不顯著。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比的交互作用對(duì)黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface of ethanol volumn fraction and liquid-solid ratio interaction effects on the extraction of flavonoids

結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析，在優(yōu)化條件下，黃酮提取率在預(yù)測(cè)模型中最佳的工藝條件為：櫻桃破碎目數(shù)63.13、乙醇體積分?jǐn)?shù)49.71%、液料比為29.85，此時(shí)黃酮提取率的預(yù)測(cè)值為85.07 mg·100g-1。根據(jù)最佳工藝條件的參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，為便于開(kāi)展，改為櫻桃破碎目數(shù)63、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、液料比為30的條件下，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得到的平均黃酮提取率為86.9 mg·100g-1，與預(yù)測(cè)值大致相符合，說(shuō)明模型具有較好的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。

2.3 黃酮提取液抗氧化活性測(cè)定

對(duì)在櫻桃破碎目數(shù)63、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、液料比為30的條件下得到的黃酮提取液進(jìn)行DPPH抗氧化活性測(cè)定，得到的DPPH抗氧化平均當(dāng)量為73.38。如表4所示，用同樣的方法進(jìn)行對(duì)照組1(櫻桃破碎目數(shù)55、乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、液料比25)實(shí)驗(yàn)，得出的DPPH抗氧化當(dāng)量為54.83；對(duì)照組2(櫻桃破碎目數(shù)65、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、液料比35)得到的DPPH抗氧化當(dāng)量為46.83。提取液總黃酮含量越高，得到的DPPH抗氧化當(dāng)量越高，其抗氧化能力越明顯，說(shuō)明針葉櫻桃果實(shí)中的黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

表4 黃酮提取液抗氧化活性測(cè)定Table 4 Determination of antioxidant activity of flavonoids extracts

3 討論

本研究選取有機(jī)溶劑提取法進(jìn)行針葉櫻桃中總黃酮的提取，通過(guò)查閱對(duì)比文獻(xiàn)及初步實(shí)驗(yàn)考查，選用了毒害副作用小且較為經(jīng)濟(jì)的乙醇作為溶劑[6-8]，研究了櫻桃破碎目數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比等因素對(duì)黃酮提取率的影響，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，之后再進(jìn)一步探究了針葉櫻桃果實(shí)中總黃酮的抗氧化活性。研究得出的最佳工藝條件為：櫻桃破碎目數(shù)63.13、乙醇體積分?jǐn)?shù)49.71%、液料比29.85，此時(shí)黃酮提取率的預(yù)測(cè)值為85.07 mg·100 g-1。在進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后，得到的平均黃酮提取率為86.9 mg·100g-1，與預(yù)測(cè)值大致相符，說(shuō)明模型具有較好的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，響應(yīng)面分析法可用于優(yōu)化針葉櫻桃總黃酮的提取工藝。

響應(yīng)面優(yōu)化分析法以實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，采用多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，并通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)優(yōu)化工藝參數(shù)，從而解決多變量的研究問(wèn)題；具有預(yù)測(cè)準(zhǔn)確、精度高等優(yōu)點(diǎn)，已有較為廣泛的應(yīng)用[14-17]。

這種通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，結(jié)合軟件分析來(lái)優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物的提取實(shí)驗(yàn)參數(shù)，可分析自變量對(duì)響應(yīng)變量的影響，能更精準(zhǔn)地評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)提取條件的優(yōu)劣，并建立可描述實(shí)驗(yàn)過(guò)程的數(shù)學(xué)模型[18]。

另外，黃酮類化合物的提取有多種可用方法，除本文使用的有機(jī)溶劑提取法以外，還有超聲波提取法、壓力溶劑萃取法、大孔樹(shù)脂吸附法、超臨界CO2萃取法、酶法提取法等常用方法[8]。因研究?jī)?nèi)容及時(shí)間所限，本文未使用其他方法來(lái)研究總黃酮的提取效果，后續(xù)可采用多種方法就針葉櫻桃中總黃酮的提取進(jìn)行研究比對(duì)，以期篩選出更好的實(shí)驗(yàn)方法與工藝方案。同時(shí)，黃酮類化合物具有抗氧化、抗衰老、消炎殺菌、改善血液循環(huán)、降低膽固醇等功效[2-5]，對(duì)治療相關(guān)疾病有著重要的作用，開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力巨大[8]，對(duì)于黃酮類化合物的提取、性能及應(yīng)用方面的相關(guān)研究應(yīng)不斷深入。