決明子抗氧化作用機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

李 磊，趙花金，伍子燾，李升和，姜錦鵬，劉 暢

(安徽科技學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部豬肉質(zhì)量安全控制重點實驗室，動物營養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點實驗室，安徽 鳳陽 233100)

氧化應(yīng)激是指在各種應(yīng)激條件下機體氧化還原反應(yīng)失衡，體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成水平超過機體抗氧化系統(tǒng)對ROS的清除能力，導(dǎo)致氧自由基在體內(nèi)聚積，進而引發(fā)細胞受損甚至死亡，是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、癌癥和衰老等過程的主要原因之一[1-4]。增強機體抗氧化能力可有效提高機體抗病能力，具有多重保健作用。近年來發(fā)現(xiàn)，多種中藥均含有大量抗氧化成分，對于治療氧化應(yīng)激引發(fā)的相關(guān)疾病具有獨到的優(yōu)勢[5]。目前，對傳統(tǒng)中藥及其有效成分抗氧化作用的研究發(fā)現(xiàn)，核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、核因子紅系2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)、Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH associated protein 1，Keap1)等信號通路是調(diào)控機體抗氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵途徑[6]，受到研究者的大量關(guān)注。

決明子是豆科植物決明(CassiaobtusifoliaL.)或小決明(CassiatoraL.)的干燥成熟種子，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為最常見的藥食同源中藥材[7]。研究發(fā)現(xiàn)，決明子的活性成分主要包括蒽醌、萘并吡喃酮、脂肪酸、多糖、氨基酸等，具有極高的藥用與營養(yǎng)價值[8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，決明子具有良好的降壓、降脂、降糖、保肝、明目、抗氧化等多重藥理活性[8-10]，其水提物能夠有效清除羥自由基、超氧陰離子自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基[9]。此外，決明子可降低衰老小鼠腦組織、CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠血清丙二醛水平，同時提高超氧化物歧化酶水平而發(fā)揮抗氧化作用[8]。鑒于中藥成分復(fù)雜，目前關(guān)于決明子的藥理研究主要集中于藥效評價，對于其作用機制的深入研究仍較少[7，11]。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)策略從系統(tǒng)生物學(xué)角度揭示決明子抗氧化應(yīng)激作用機制，以期為深入研究決明子藥理作用機制及其臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 決明子活性化合物及其對應(yīng)靶點的獲取

通過文獻和中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫TCMSP[12](http://www.tcmspw.com/tcmsp.php)獲取中藥決明子的所有化學(xué)成分。根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug-likeness，DL)將每個化學(xué)成分的篩選閾值分別設(shè)為OB≥30%，DL≥0.18，找出決明子的活性化合物及其對應(yīng)靶點。運用Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫[13](http://www.uniprot.org)將靶點名稱轉(zhuǎn)化為基因名稱，將檢索的條件物種(Organism)設(shè)置為Homosapiens，得到?jīng)Q明子潛在作用靶點。

1.2 構(gòu)建決明子抗氧化成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫[14](https://www.genecards.org)查找與抗氧化(anti-oxidant)有關(guān)的標靶基因。將決明子活性成分靶點與抗氧化有關(guān)的靶點基因映射。再將獲得的決明子有效成分與靶點信息通過Cytoscape 3.6.0軟件[15]構(gòu)建決明子抗氧化成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.3 蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將上述決明子抗氧化作用靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫[16](https://string-db.org)，將篩選物種設(shè)置為Homosapiens。初步得到?jīng)Q明子作用于抗氧化的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，下載蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)，輸入Cytoscape 3.6.0軟件，構(gòu)建決明子抗氧化作用靶點蛋白—蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并對網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析。

1.4 靶點的GO功能富集分析與KEGG信號通路富集分析

將所得到的決明子作用于抗氧化的核心靶點蛋白導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫[17-18](https://david.ncifcrf.gov)，物種選擇為Homosapiens，得到基因本體論(gene ontology，GO)富集分析與京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析。選擇假定值(P-value)小于0.05的條目作為顯著富集的GO條目或KEGG通路。

1.5 分子對接

通過PubChem數(shù)據(jù)庫下載決明子成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)SDF文件，利用Chem 3D軟件將其能量最小化并另存為mol2格式文件。從PDB數(shù)據(jù)庫檢索并下載靶點的PDB文件，分別輸入AutoDockTools 1.5.6將藥物分子與靶點蛋白經(jīng)過去水、加氫等處理并轉(zhuǎn)化為PDBQT文件。設(shè)置對接參數(shù)為默認值，運用AutoDock 4.2軟件[19]進行分子對接，將對接結(jié)果輸入LigPlot+軟件[20]分析藥物分子與靶點間相互作用類型，用于評價決明子化學(xué)成分與其對應(yīng)靶點的結(jié)合能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 決明子有效化合物及其對應(yīng)靶點

通過檢索文獻和TCMSP數(shù)據(jù)庫得到中藥決明子共有68個化學(xué)成分，符合篩選條件的成分共14個(表1)。其中，紅鐮霉素沒有對應(yīng)靶點，其余13種化學(xué)成分對應(yīng)靶點經(jīng)去重處理后共得到67個靶點，選擇物種為人類，去除掉1個非人源靶點，最終得到?jīng)Q明子活性成分對應(yīng)靶點基因66個。

表1 決明子有效成分與靶點信息Table 1 Ingredients and targets of Cassia semen

2.2 決明子抗氧化有效成分—靶點網(wǎng)絡(luò)

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫找到抗氧化的標靶基因813個，與決明子活性成分對應(yīng)靶點交集為34個。利用Cytoscape 3.6.0軟件將決明子活性成分與抗氧化相關(guān)靶點構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型(圖1)。其中，11個紅色節(jié)點為決明子潛在抗氧化活性成分，34個綠色節(jié)點為決明子抗氧化作用的潛在靶點。以上結(jié)果表明，決明子抗氧化作用可能由大黃酸、蘆薈大黃素、橙黃決明素、決明素等11個有效成分作用于PTGS1、PTGS2、TP53、JUN、CASP3、ESR1等34個靶點實現(xiàn)。

紅色三角形節(jié)點表示決明子抗氧化作用有效成分，綠色橢圓形節(jié)點表示決明子的潛在抗氧化作用靶點。The red triangular nodes represented the active ingredients of Cassia semen， and the green elliptical nodes represented the anti-oxidative associated targets of Cassia semen.圖1 決明子“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Components-targets network of the main ingredients of Cassia semen

2.3 決明子抗氧化的蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將決明子抗氧化作用靶點信息輸入STRING數(shù)據(jù)庫得到這些靶點間的互作關(guān)系，通過Cytoscape構(gòu)建靶點PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2)。圖中包括34個節(jié)點、177條邊線。節(jié)點的顏色和大小反映了靶點的連接度(degree)，顏色由綠變紅、節(jié)點越大表示該靶點degree越大，說明該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中具有更重要的作用。邊的線條粗細反映了靶點間結(jié)合分值(combine score)的大小，線條越粗表示2個靶點的結(jié)合分值越大。在該網(wǎng)絡(luò)中degree排在前10位的靶點依次為TP53(25)、MYC(22)、CASP3(21)、ESR1(20)、JUN(20)、CDKN1A(18)、PTGS2(16)、TNF(16)、CCNB1(15)、MAPK14(14)。

節(jié)點顏色由綠變紅、由小變大表示節(jié)點連接度(degree)逐漸增大；節(jié)點間聯(lián)系由細變粗表示節(jié)點間結(jié)合分值(combine score)逐漸增大。The nodes in the network represented the potential targets， and the edges represented the interaction between the targets. The color from green to red and the size from small to big represented larger degree of targets， and the thickness of the line indicated the combine score of the targets.圖2 決明子抗氧化作用靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network of anti-oxidative targets of Cassia semen

2.4 GO富集分析結(jié)果

將決明子抗氧化靶點輸入DAVID數(shù)據(jù)庫，進行GO富集分析，設(shè)置P-value<0.05，全部34個靶點共富集到76條GO條目中，其中包含Ras蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Ras protein signal transduction)、細胞增殖調(diào)控(regulation of cell proliferation)、正調(diào)控?zé)崃可?positive regulation of fever generation)、正調(diào)控成纖維細胞增生(positive regulation of fibroblast proliferation)、肽-絲氨酸磷酸化(peptidyl-serine phosphorylation)、氧化還原過程(oxidation-reduction process)、正調(diào)控活性氧代謝過程(positive regulation of reactive oxygen species metabolic process)等51條與生物過程(biological process，BP)相關(guān)的GO條目(圖3，僅列出排名靠前的20條GO條目)。這些靶點還富集到胞漿(cytosol)、細胞外泌體(extracellular exosome)、中心體(centrosome)、PCNA-p21復(fù)合體(PCNA-p21complex)、線粒體外膜(mitochondrial outer membrane)、線粒體(mitochondrion)等14個與細胞組分(cellular components，CC)相關(guān)的GO條目中(圖4)。另外，這些靶點還可富集到染色質(zhì)結(jié)合(chromatin binding)、核心啟動子結(jié)合(core promoter sequence-specific DNA binding)、RNA多聚酶II轉(zhuǎn)錄因子活性(RNA polymerase II transcription factor activity)等11個與分子功能(molecular functions，MF)相關(guān)的GO條目中(圖5)。表明決明子有效成分可以通過調(diào)控細胞內(nèi)多種部位、多種功能的多種生物學(xué)過程進而發(fā)揮其抗氧化作用。

圖3 GO生物過程富集分析氣泡圖Fig.3 Bubble plot of GO enrichment analysis of biological process

圖4 GO細胞組分富集分析氣泡圖Fig.4 Bubble plot of GO enrichment analysis of cellular components

圖5 GO分子功能富集分析氣泡圖Fig.5 Bubble plot of GO enrichment analysis of molecular functions

2.5 KEGG富集分析結(jié)果

將決明子34個抗氧化靶點輸入DAVID數(shù)據(jù)庫，設(shè)置P-value<0.05，這些靶點可富集到154條信號通路中，其中排名前20的通路如圖6所示。在排名前20的通路中，共28個靶點富集到與癌癥、內(nèi)分泌與代謝疾病，以及感染性疾病等與人類疾病相關(guān)的12條通路，12個靶點富集到細胞增殖和死亡等與細胞過程(cellular processes)相關(guān)的2條通路，12個基因富集到信號傳導(dǎo)等與環(huán)境信息處理(environmental information processing)相關(guān)的2條通路；另外有19個靶點富集到與生物系統(tǒng)(organismal systems)相關(guān)的4條通路，其中乙型肝炎相關(guān)通路(Hepatitis B)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease)和癌癥信號通路(pathway in cancer)等均與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)，表明決明子可以通過多種途徑對抗機體氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖6 KEGG富集分析氣泡圖Fig.6 Bubble plot of KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子對接結(jié)果

為了驗證預(yù)測靶點的可靠性，采用分子對接技術(shù)驗證了排名前5的靶點與相應(yīng)成分之間的相互作用(表2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘆薈大黃素可與TP53蛋白TRP1495、TYR1502、PHE1519、ASP1521、TYR1523、LEU1547、ALA1585等殘基形成疏水相互作用，同時與MET1584(2.73 ?)形成氫鍵，保證了其與TP53具有較強的結(jié)合能力(圖7-A)；同時，蘆薈大黃素可占據(jù)MYC蛋白HIS51、GLY53、ALA55、PRO57、ASN59等殘基形成疏水活性空腔，并與HIS50(2.87 ?)、ALA55(2.99 ?)、GLU58(2.83 ?)形成氫鍵而發(fā)生結(jié)合(圖7-B)。此外，CASP3蛋白GLU191、ASN195、LEU196可形成疏水空腔，蘆薈大黃素一方面可與該空腔結(jié)合，同時能與THR192(2.63 ?)、ALA361(3.01 ?)、ASP362O(3.28 ?)、ASP362N(3.21 ?)、LEU357(3.08 ?)、LYS358(2.85 ?)等殘基形成氫鍵(圖7-C)，保證了二者的結(jié)合能力。

表2 決明子部分成分與靶點分子對接結(jié)果Table 2 Results of molecular docking for ingredients of Cassia semen and associated targets

類似地，決明內(nèi)酯能夠占據(jù)由LEU346、ALA350、ASP351、LEU354、TRP383、MET421、LEU525、VAL533、VAL534、PRO535共10個殘基形成的ESR1疏水活性空腔，并與ESR1蛋白MET343(2.99 ?)、THR347(3.04 ?)氨基酸殘基形成氫鍵(圖7-D)。小分子9，10-二羥基-7-甲氧基-3-亞甲基-4H-苯并[g]異色烯-1-酮與ESR1蛋白的相互作用與決明內(nèi)酯類似(圖7-E)。

大黃酸與JUN蛋白的MET313殘基可形成疏水作用，并與LYS309(2.73 ?)、VAL312(2.79 ?)、ASN314(3.07 ?)、TYR315(3.26 ?，2.88 ?)4個氨基酸殘基形成5個氫鍵(圖7-F)。以上結(jié)果進一步驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對決明子抗氧化作用靶點預(yù)測的可靠性。

蘆薈大黃素與(A)TP53、(B)MYC、(C)CASP3的分子對接結(jié)果；D、E為決明內(nèi)酯、9， 10-dihydroxy-7-methoxy-3-methylene-4h-benzo[g]isochromen-1-one分別與ESR1分子對接的結(jié)果；F為大黃酸與JUN的分子對接結(jié)果。Molecular docking results of alon-emodin with TP53(A)， MYC(B)， CASP3(C); Toralactone (D) and 9，10-dihydroxy-7-methoxy-3-methylene-4h-benzo[g]isochromen-1-one (E) docking with ESR1; Rhein docking with JUN(F).圖7 分子對接結(jié)果Fig.7 Results of molecular docking

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析了決明子抗氧化作用機制，對決明子有效成分、抗氧化作用靶點進行了預(yù)測，構(gòu)建了決明子抗氧化作用靶點網(wǎng)絡(luò)，并對這些靶點進行了GO與KEGG富集分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，決明子中11種有效成分可以作用于分布在細胞胞漿、細胞核、線粒體等多個細胞組分中的34個相關(guān)靶點，這些靶點可以通過參與細胞氧化還原反應(yīng)、調(diào)控活性氧代謝、調(diào)控細胞增殖等多種途徑發(fā)揮抗氧化作用。

已發(fā)現(xiàn)的決明子成分約有68個化合物，經(jīng)過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其中11個成分為潛在抗氧化作用有效成分，其中，大黃酸、蘆薈大黃素、豆甾醇、決明內(nèi)酯等成分的抗氧化活性已有報道。如嗜脂性蒽醌類化合物大黃酸具有保肝、保腎、抗炎、抗氧化、抗癌和抗菌活性。Zhong等[21]報道，大黃酸通過下調(diào)BID、CASP3、CAPS8、CASP9基因表達，并增加SOD、GSH-PX等抗氧化酶活性來保護過氧化氫誘導(dǎo)的HUVEC細胞氧化損傷。蘆薈大黃素也屬于蒽醌類化合物，其中含有酚羥基，而酚羥基是許多天然抗氧化劑的功能基團，這使得蘆薈大黃素對氧自由基有較強的清除能力[22]；同時，蘆薈大黃素抗氧化作用可能與其抑制MYC、NF-κB，提高BAX、FAS、TP53、CASP3、ERK1/2等蛋白表達水平有關(guān)；另外，蘆薈大黃素可作用于MAPKs、PKC、NF-κB、ROS-JNK、PI3K/AKT/mTOR和線粒體信號通路，這些通路均與調(diào)控機體氧化還原反應(yīng)密切相關(guān)：因此，也可能是蘆薈大黃素抗氧化作用的主要機制[23]。在本研究中，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測得到的蘆薈大黃素抗氧化作用靶點與上述研究高度重合，并且通過分子對接驗證了蘆薈大黃素與TP53、MYC、CASP3的相互作用(圖7)，證明了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的可靠性。豆甾醇是天然植物中的一種活性化合物，不同濃度的豆甾醇均具有一定的抗氧化活性[24]。Sun等[25]報道，豆甾醇可通過減輕氧化應(yīng)激和自噬保護缺血再灌注損傷造成的神經(jīng)損傷。決明內(nèi)酯屬于萘并吡喃酮類化合物，具有保肝、抗突變和降脂作用[26]。Seo等[27]報道，決明內(nèi)酯可以通過Nrf2介導(dǎo)的抗氧化信號通路對抗叔丁基過氧化氫誘導(dǎo)的肝損傷。

在決明子抗氧化作用靶點網(wǎng)絡(luò)中，TP53、MYC、CASP3、ESR1、JUN等5個靶點的連接度較高(大于所有連接度中位數(shù)的2倍)，屬于該網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點，可能是決明子抗氧化作用的關(guān)鍵靶點，為此，我們采用分子對接技術(shù)進行了驗證(表2)。研究發(fā)現(xiàn)，TP53參與調(diào)控機體氧化還原反應(yīng)，對于維持氧化還原平衡至關(guān)重要。當TP53基因發(fā)生突變時，往往伴隨嚴重的氧化應(yīng)激損傷，如在癌細胞中，突變的TP53基因與野生型基因相比抗氧化作用消失，導(dǎo)致癌細胞中ROS含量增加，促進了癌細胞存活[28-30]。MYC是一種編碼核磷蛋白的原癌基因，在細胞周期、細胞凋亡與細胞轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。正常情況下，MYC主要參與調(diào)控胚胎發(fā)育和組織修復(fù)，但異常表達的MYC可以促進細胞惡性轉(zhuǎn)化。在癌細胞中異常表達的MYC可以引起基因的非線性擴增，使某些mRNA異常表達，導(dǎo)致細胞代謝失衡，誘發(fā)細胞氧化應(yīng)激，促進了細胞死亡或腫瘤的形成和發(fā)展[31-32]。TP53與MYC間存在負相關(guān)關(guān)系，TP53可在轉(zhuǎn)錄水平抑制MYC的表達，其下游基因p21也可以抑制MYC表達；另外，TP53還可以通過調(diào)控miR-145、miR-34b進而抑制MYC表達[33]。JUN是組成轉(zhuǎn)錄因子AP-1的重要亞基，可與DNA上的特異序列結(jié)合調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，JUN是TP53表達與激活的負調(diào)控因子，在c-jun-/-成纖維細胞中TP53的表達顯著高于正常細胞，當在c-jun-/-細胞中穩(wěn)定表達c-jun后，TP53的表達水平顯著降低，這表明JUN可以負調(diào)控TP53的表達[34]。對決明子抗氧化靶點進行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，TP53、CDKN1A、MAPK14、MAOA、MAOB、PTGS1、NOS2等基因可以富集到氧化還原過程(oxidation-reduction process)、正調(diào)控活性氧代謝過程(positive regulation of reactive oxygen species metabolic process)等生物過程中；而KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，決明子抗氧化作用靶點主要富集在癌癥相關(guān)通路(如p53 signaling pathway，pathway in cancer，proteoglycans in cancer，viral carcinogenesis，colorectal cancer等)和肝損傷相關(guān)通路(如hepatitis B，non-alcoholic fatty liver disease)。氧化應(yīng)激是癌癥與肝損傷等疾病的共同原因，緩解機體氧化應(yīng)激損傷是治療癌癥與肝損傷等疾病的常用策略。網(wǎng)絡(luò)藥理分析發(fā)現(xiàn)，決明子中的多種成分可經(jīng)多個靶點在抗癌與保肝方面發(fā)揮作用，可能具有一定的應(yīng)用前景。

決明子作為藥食兩用中藥，日常生活中?？纱栾?，其保肝降脂功效已被人們熟知并認可[35-36]。目前，關(guān)于決明子及其有效成分基于抗氧化應(yīng)激途徑的抗癌作用研究尚未見報道，可作為今后研究的方向加以探索。本研究從系統(tǒng)藥理學(xué)角度預(yù)測了決明子的抗氧化作用機制，但仍需通過體內(nèi)、外試驗進一步驗證。