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    輔酶NADH與色氨酸共振能量轉(zhuǎn)移的熒光動(dòng)力學(xué)研究

    2020-11-13 09:37:42王夢(mèng)雨曹思敏李昊陽(yáng)張夢(mèng)婕趙澤楠徐建華
    關(guān)鍵詞:能量轉(zhuǎn)移丙酮酸色氨酸

    王夢(mèng)雨,曹思敏,李昊陽(yáng),張夢(mèng)婕,李 棟,趙澤楠,徐建華

    (華東師范大學(xué)精密光譜科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200241)

    輔酶還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的還原態(tài),產(chǎn)生于糖酵解和細(xì)胞呼吸作用中的檸檬酸循環(huán),在維持細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和細(xì)胞保護(hù)以及氧化還原反應(yīng)和能量代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[1].色氨酸(Trp)作為20種氨基酸之一,是氨基酸中最主要的熒光發(fā)色團(tuán),屬于非極性的芳香族氨基酸,可直接參與生物體中蛋白質(zhì)的合成,是絕大多數(shù)蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光的主要來(lái)源[2].

    采用熒光壽命成像顯微鏡(FLIM)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù),通過(guò)色氨酸和NADH之間的相互作用可以了解癌細(xì)胞內(nèi)的代謝活性.癌細(xì)胞中葡萄糖的攝取和糖酵解進(jìn)行的速度大約是正常細(xì)胞的10倍,因此,通過(guò)分析色氨酸和NADH的熒光壽命分布及兩者之間的能量轉(zhuǎn)移效率(Eτ,%)并與正常細(xì)胞比較,來(lái)分析癌細(xì)胞在葡萄糖刺激下的糖酵解活性,并且用抗癌藥物阿霉素對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行治療,觀察治療前后癌細(xì)胞的代謝活性.研究發(fā)現(xiàn),癌細(xì)胞在葡萄糖刺激下,結(jié)合型NADH/游離型NADH比率以及色氨酸和NADH之間的能量轉(zhuǎn)移效率增加,高于正常細(xì)胞.色氨酸和NADH之間能量轉(zhuǎn)移效率的增加也表明了色氨酸被猝滅,壽命減小.阿霉素治療后,結(jié)合型NADH/游離型NADH比率減小,糖酵解和代謝活性下降.結(jié)果表明,色氨酸、NADH的熒光壽命分布以及色氨酸與NADH之間的能量轉(zhuǎn)移效率都可以作為生物標(biāo)志物用來(lái)觀察癌細(xì)胞的代謝活性[3~5].

    細(xì)胞內(nèi)有多種結(jié)構(gòu)類型的色氨酸,包括單體色氨酸以及多種蛋白質(zhì)內(nèi)的色氨酸[2],是否所有類型的色氨酸都能和NADH產(chǎn)生相互作用尚未見(jiàn)報(bào)道.并且,大多數(shù)蛋白質(zhì)肽鏈上通常含有不止一個(gè)色氨酸分子,每個(gè)色氨酸分子對(duì)蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)-NADH之間相互作用的熒光貢獻(xiàn)也不同,因而系統(tǒng)地分析色氨酸在不同狀態(tài)下與NADH的相互作用非常必要.

    熒光光譜測(cè)量技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于獲取與受體反應(yīng)前后的生物分子(供體)的熒光壽命變化的信息[6,7].本文從時(shí)間分辨熒光光譜出發(fā),結(jié)合紫外-可見(jiàn)吸收光譜和穩(wěn)態(tài)熒光光譜,對(duì)不同環(huán)境下的色氨酸和輔酶NADH之間的共振能量轉(zhuǎn)移熒光動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究,并且通過(guò)熒光衰減相關(guān)光譜(DAS)對(duì)乳酸脫氫酶內(nèi)色氨酸不同壽命的熒光衰減與NADH能量轉(zhuǎn)移效率進(jìn)行了分析.

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 試劑與儀器

    β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-NADH,純度98%)和丙酮酸(Pyruvic acid,純度98%)購(gòu)于上海Aladdin公司;Tris-base(純度≥99.9%)和濃鹽酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)37%)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;色氨酸(L-Tryptophan,純度≥99.5%)、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA,純度≥98%)和兔肌肉乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH,600~1200 u/mg)購(gòu)于上海 Sigma-Aldrich公司;實(shí)驗(yàn)用水為18.2MΩ·cm去離子水.所有試劑均用Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl,pH=7.35)配置.

    TU1901型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司);FluoroMax-4型熒光分光光度計(jì)(日本Horiba公司);時(shí)間分辨熒光測(cè)量系統(tǒng):激發(fā)光源是由PDL 800-D型驅(qū)動(dòng)器(德國(guó)PicoQuant公司)控制的PLS 298型亞納秒脈沖LED(德國(guó)PicoQuant公司),熒光衰減曲線由PMA165A-N-M型光電倍增探測(cè)器和PicoHarp 300型時(shí)間單光子技術(shù)模塊(德國(guó)PicoQuant公司)探測(cè)獲得.

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 樣品濃度的測(cè)定 分別配制1 mmol/L Trp的溶液,200 μmol/L BSA的溶液和40 μmol/L LDH的溶液,并分別稀釋至所需濃度.將Trp和NADH以摩爾比1∶1(100 μmol/L Trp+100 μmol/L NADH)混合,BSA 和 NADH 以摩爾比 1∶3(15 μmol/L BSA+45 μmol/L NADH)以及摩爾比 1∶6(15 μmol/L BSA+90 μmol/L NADH)混合,LDH和NADH以摩爾比1∶3(15 μmol/L LDH+45 μmol/L NADH)混合. 配制完成后,將樣品移取至石英比色皿中,采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量,探測(cè)范圍為190~500 nm.Trp,BSA和LDH的濃度分別根據(jù)它們?cè)?80 nm處的摩爾消光系數(shù)(εTrp=5540 L·mol—1·cm—1[8],εBSA=43824L·mol—1·cm—1[9],εLDH=2×105L·mol—1·cm—1[10])測(cè)定 .

    1.2.2 穩(wěn)態(tài)熒光光譜的測(cè)定 取NADH溶液以及Trp-NADH,BSA-NADH,LDH-NADH混合溶液,測(cè)量NADH的穩(wěn)態(tài)熒光光譜,激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為340 nm,光譜分辨率設(shè)為2 nm.

    1.2.3 時(shí)間分辨熒光光譜的測(cè)定 Trp,BSA以及LDH的熒光壽命由基于時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)技術(shù)的時(shí)間分辨熒光測(cè)量系統(tǒng)得到.激發(fā)波長(zhǎng)為298 nm,重復(fù)頻率為10 MHz.系統(tǒng)儀器響應(yīng)函數(shù)通過(guò)檢測(cè)水中質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.34%SiO2納米顆粒激發(fā)光的瑞利散射獲得,為0.2 ns.數(shù)據(jù)擬合的準(zhǔn)確性采用非線性最小二乘法χ2的大小來(lái)判斷[11],擬合越準(zhǔn)確,χ2越接近1.本文所有曲線數(shù)據(jù)擬合其χ2數(shù)值均在1.0左右. 分子熒光壽命的平均值(τavg)計(jì)算[6]如下:

    式中,αi為與第i個(gè)熒光壽命時(shí)間常數(shù)τi對(duì)應(yīng)的歸一化振幅.

    DAS的構(gòu)建:通過(guò)擬合不同波長(zhǎng)下各個(gè)壽命的熒光衰減曲線,再用穩(wěn)態(tài)熒光光譜數(shù)據(jù)對(duì)擬合的結(jié)果進(jìn)行歸一化得到[7].

    2 結(jié)果與討論

    2.1 水溶液中單體色氨酸和NADH之間的相互作用

    FRET是兩個(gè)分子的電子激發(fā)態(tài)之間的一種與距離相關(guān)的相互作用,被激發(fā)的供體分子可以將其能量轉(zhuǎn)移至(一個(gè))受體分子[11].Heikal[12]的研究表明,單體色氨酸的發(fā)射光譜和NADH的吸收光譜顯著重疊;加入NADH后,單體色氨酸熒光會(huì)發(fā)生顯著猝滅,由此判斷NADH和單體色氨酸之間能夠發(fā)生FRET.

    圖1(A)給出了加入NADH前后單體色氨酸的時(shí)間分辨熒光衰減曲線,IRF為儀器響應(yīng)函數(shù).可見(jiàn),NADH加入前后單體色氨酸的熒光衰減曲線并未發(fā)生明顯變化,供體與受體的濃度均為100 μmol/L.對(duì)衰減曲線采用了雙指數(shù)函數(shù)進(jìn)行擬合,擬合數(shù)據(jù)列于表1.單體色氨酸熒光的2個(gè)壽命成分分別為0.57和3 ns,占比分別為23.5%和76.5%,與文獻(xiàn)結(jié)果一致[13,14].但是,加入NADH后,單體色氨酸的兩個(gè)壽命及其對(duì)應(yīng)的成分占比均未發(fā)生明顯變化,平均壽命基本不變(表1).實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明水溶液中單體色氨酸和NADH之間并未發(fā)生明顯的FRET.將單體Trp的濃度提高至1 mmol/L,NADH濃度從100 μmol/L逐漸提高至600 μmol/L,仍與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同.因此,從單體色氨酸和NADH光譜重疊以及單體色氨酸的熒光被猝滅(加入NADH后)的現(xiàn)象[12]來(lái)判斷二者之間發(fā)生FRET不正確.單體色氨酸的熒光猝滅并不是因?yàn)镕RET,而是由于重吸收(內(nèi)濾效應(yīng))所致,即Trp的發(fā)射光譜和NADH的吸收光譜有著顯著的重疊,Trp發(fā)出的熒光會(huì)被NADH重吸收,進(jìn)而導(dǎo)致Trp熒光強(qiáng)度下降.除了滿足光譜重疊的條件外,實(shí)現(xiàn)供受體分子之間的FRET還要滿足以下兩個(gè)條件:(1)分子間距需足夠近,也就是供受體分子的距離在1~10 nm間;(2)供體分子的發(fā)射態(tài)偶極矩和受體分子的吸收態(tài)偶極矩以及它們的向量要滿足一定的條件[11].供受體之間的距離對(duì)于兩者之間能否發(fā)生FRET尤其重要.

    Fig.1 Fluorescence lifetime decay curves of tryptophan(A)and steady?state fluorescence spectra of NADH(B)

    Table 1 Fluorescence lifetimes(τi),the average(τavg)and the fluorescence decay parameters(αi)of Trp,BSA and LDH with NADH and pyruvic acid

    研究發(fā)現(xiàn),NADH和各種脫氫酶的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致NADH的熒光光譜峰值發(fā)生藍(lán)移[15~17],因此NADH熒光光譜的位移可以間接反映其與配體的結(jié)合情況.由圖1(B)可見(jiàn),單體色氨酸與NADH混合后,NADH穩(wěn)態(tài)熒光峰值未發(fā)生任何位移,表明單體色氨酸和NADH之間處在相對(duì)游離狀態(tài),僅僅依靠擴(kuò)散作用難以發(fā)生FRET.

    2.2 牛血清白蛋白和NADH之間的相互作用

    大多數(shù)蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光來(lái)源主要是色氨酸.對(duì)于蛋白質(zhì)熒光特性的研究主要是對(duì)色氨酸熒光特性的研究[2].圖1(A)已表明單體色氨酸和NADH之間無(wú)法發(fā)生明顯的FRET.為了研究含有色氨酸殘基的蛋白質(zhì)與NADH間的FRET,研究了BSA和NADH之間的相互作用.BSA是一種較大的球狀蛋白,是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)之一.每個(gè)BSA上含有Trp-212和Trp-134 2種色氨酸殘基.Trp-212位于蛋白質(zhì)內(nèi)的化學(xué)微環(huán)境中,Trp-134位于蛋白質(zhì)的表面[18,19].

    圖2給出了加入不同濃度NADH前后15 μmol/L BSA的時(shí)間分辨熒光衰減曲線.可見(jiàn),NADH加入后,BSA的熒光衰減曲線基本無(wú)變化.對(duì)曲線采用雙指數(shù)函數(shù)進(jìn)行擬合,結(jié)果如表1所示.BSA表現(xiàn)出2.08和6.31 ns 2個(gè)壽命成分,占比分別為21.6%和78.4%.加入不同濃度NADH后,BSA的壽命大小及其占比均未發(fā)生明顯變化,平均壽命基本不變.這一現(xiàn)象表明了BSA和NADH之間并未發(fā)生明顯的FRET.

    由圖1(B)可見(jiàn),BSA與NADH混合后,NADH的穩(wěn)態(tài)熒光光譜也未發(fā)生明顯位移,表明BSA和NADH在溶液中也是處于相對(duì)游離的狀態(tài).NADH和BSA上的色氨酸之間未發(fā)生FRET.

    Fig.2 Fluorescence lifetime decay curves of BSA in the absence and presence of NADH

    2.3 乳酸脫氫酶和NADH之間的相互作用

    LDH在人體內(nèi)通常以四聚體的形式存在,具有4個(gè)完全等價(jià)的NADH結(jié)合位點(diǎn),同時(shí)每個(gè)單體上都含有6個(gè)色氨酸(Trp-150,Trp-190,Trp-203,Trp-225,Trp-248,Trp-323).乳酸脫氫酶中至少有3種色氨酸,其中兩種可以被NADH猝滅[20].由于LDH上存在4個(gè)NADH的結(jié)合位點(diǎn),所以在LDH-NADH溶液中采用1∶3的濃度比就足以觀察到猝滅現(xiàn)象,即15 μmol/L LDH+45 μmol/L NADH.

    圖3為L(zhǎng)DH的時(shí)間分辨熒光衰減曲線.可見(jiàn),加入NADH后,LDH的時(shí)間分辨熒光衰減曲線明顯下降.數(shù)據(jù)表明,LDH的熒光衰減曲線至少需要3個(gè)壽命才能較好地?cái)M合,所以采用三指數(shù)函數(shù)進(jìn)行擬合(χ2<1.05),擬合結(jié)果見(jiàn)表1.單獨(dú)LDH中色氨酸的3個(gè)壽命為0.74,3.64和7.35 ns,占比分別為18.4%,23.8%和57.8%,平均壽命為6.56 ns,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[20].加入NADH后,色氨酸3種壽命大小及其占比均發(fā)生了不同程度的變化,平均壽命降至5.28 ns.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,LDH和NADH之間發(fā)生了FRET.

    Fig.3 Fluorescence lifetime decay curves of LDH in the absence and presence of NADH and pyruvic acid

    LDH熒光壽命的衰減主要來(lái)源于色氨酸到NADH的能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象.Eτ(%)的計(jì)算[6]如下:

    式中,τDA為受體存在時(shí)的供體的平均壽命;τD為供體單獨(dú)存在時(shí)的壽命.計(jì)算結(jié)果表明,45 μmol/L NADH加入后,LDH和NADH之間的能量轉(zhuǎn)移效率達(dá)到20%.

    為了更加直觀地描述LDH 3種壽命成分的變化趨勢(shì),根據(jù)時(shí)間分辨熒光衰減曲線以及穩(wěn)態(tài)熒光光譜,構(gòu)建了加入NADH前后LDH的DAS光譜,結(jié)果如圖4所示.

    Fig.4 Decay?associated spectra of 15μmol/L LDH(A),15μmol/L LDH+45μmol/L NADH(B)and 15μmol/L LDH+45μmol/L NADH+50μmol/L pyruvic acid(C)

    DAS光譜常被用于區(qū)分溶劑弛豫和基態(tài)異質(zhì)性,在色氨酸和NADH領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用[21,22].藍(lán)端為正、紅端為負(fù)的DAS通常反映為溶劑弛豫信號(hào),而全部波長(zhǎng)為正的DAS則與基態(tài)異質(zhì)性有關(guān).從圖4(A)可見(jiàn),LDH的3個(gè)壽命成分對(duì)應(yīng)的DAS在所有測(cè)量波長(zhǎng)處都為正值,表明這3個(gè)壽命與基態(tài)異質(zhì)性相關(guān),反映了LDH中存在至少3種不同微環(huán)境下的色氨酸熒光壽命成分[20].

    由圖4(B)可見(jiàn),隨著NADH的加入,長(zhǎng)壽命成分(7.35 ns)的相對(duì)振幅從57.8%顯著下降至30.2%,曲線明顯下降.壽命衰減(至6.89 ns)的同時(shí)還伴隨著振幅的顯著下降,一部分色氨酸被強(qiáng)烈猝滅(完全猝滅或猝滅至較短壽命成分的水平),從而引起振幅減少;而另一部分色氨酸則表現(xiàn)出了適度猝滅,從而引起壽命的減小.LDH的短壽命成分略有下降,其相對(duì)振幅則隨著NADH的加入而顯著增加(從18.4%增長(zhǎng)至36.3%),振幅的顯著上升是由于其約7 ns的長(zhǎng)壽命成分被強(qiáng)烈猝滅至接近約0.7 ns的水平.約4 ns的壽命成分也表現(xiàn)出了一定猝滅的特性,其振幅的增加則表明長(zhǎng)壽命成分的猝滅對(duì)其也有一定貢獻(xiàn).可以看出,在色氨酸的3種壽命成分中,長(zhǎng)壽命成分(7.35 ns)的衰減占據(jù)整體衰減的主要部分.同時(shí),NADH與LDH混合后,NADH的熒光光譜峰值藍(lán)移了近37 nm,如圖1(B)所示,表明LDH和NADH處在結(jié)合狀態(tài)[15~17].LDH和NADH結(jié)合后,NADH被固定在LDH的結(jié)合位點(diǎn)上,與LDH上的6個(gè)色氨酸之間的距離被確定,每個(gè)色氨酸和NADH之間距離均不相同.LDH-NADH復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)表明[20],雖然這6個(gè)色氨酸與NADH之間的距離都小于能量轉(zhuǎn)移特征距離(R0,2.34 nm),但是在6個(gè)色氨酸中,只有Trp-248和NADH之間距離最近(1.31 nm),兩者發(fā)生了顯著的FRET.對(duì)比單體色氨酸和BSA與NADH之間的相互作用,單體色氨酸-NADH和BSA-NADH都處在相對(duì)游離的狀態(tài),僅僅依靠分子擴(kuò)散作用,色氨酸和NADH之間并不能發(fā)生FRET.由此表明,蛋白結(jié)合位點(diǎn)的存在是NADH和色氨酸之間能夠發(fā)生FRET的前提條件.為了進(jìn)一步證實(shí)此結(jié)論,采用丙酮酸來(lái)阻斷LDH和NADH之間的FRET通道.

    研究發(fā)現(xiàn),LDH上除了有輔酶NADH的結(jié)合位點(diǎn)外,還存在底物丙酮酸的結(jié)合位點(diǎn)[23].當(dāng)丙酮酸和NADH連接到LDH上后,在LDH的催化作用下兩者之間發(fā)生反應(yīng),形成非熒光的乳酸和NAD+[24].NAD+是NADH的氧化態(tài).由圖3可見(jiàn),在LDH-NADH溶液中加入50 μmol/L丙酮酸后,LDH的時(shí)間分辨熒光衰減曲線回升,與單獨(dú)LDH的時(shí)間熒光衰減曲線基本重合.LDH-NADH溶液中加入丙酮酸后,色氨酸的3種熒光壽命和相對(duì)振幅都普遍增加,平均壽命增至6.55 ns,與單獨(dú)LDH的色氨酸平均壽命相同.同樣,為了更加直觀地描述色氨酸3種壽命成分的相對(duì)振幅變化趨勢(shì),構(gòu)建了在LDH-NADH溶液中加入丙酮酸后,LDH的DAS譜圖,如圖4(C)所示.加入丙酮酸后,色氨酸長(zhǎng)壽命成分的相對(duì)振幅從30.2%顯著增至52.9%,曲線明顯上升,短壽命成分的相對(duì)振幅從36.3%降至19.5%,與單獨(dú)LDH壽命成分的相對(duì)振幅相近.同時(shí),在LDH-NADH溶液中加入丙酮酸后,pH值為7.20,同之前單獨(dú)LDH的pH值(pH=7.35)無(wú)顯著差別,LDH的結(jié)構(gòu)不會(huì)因?yàn)榧铀岫l(fā)生改變.DAS譜圖中峰值所在波長(zhǎng)的穩(wěn)定也表明了LDH的結(jié)構(gòu)并未發(fā)生改變.

    可見(jiàn),丙酮酸的加入未對(duì)LDH的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響.LDH中色氨酸熒光壽命回升是由于丙酮酸阻斷了LDH和NADH之間發(fā)生FRET,證實(shí)了結(jié)合位點(diǎn)是LDH和NADH之間發(fā)生FRET的前提條件.

    綜上所述,本文采用時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)技術(shù),探討了不同結(jié)構(gòu)類型的色氨酸和NADH之間的熒光動(dòng)力學(xué).通過(guò)時(shí)間分辨熒光光譜對(duì)單體色氨酸、BSA、LDH與NADH之間的相互作用進(jìn)行了分析.結(jié)果表明,加入NADH后,3種物質(zhì)只有LDH中色氨酸的熒光壽命發(fā)生明顯衰減,且能量轉(zhuǎn)移效率Eτ增加.根據(jù)LDH的DAS譜圖的構(gòu)建,對(duì)LDH中色氨酸的3個(gè)壽命成分對(duì)色氨酸與NADH之間的發(fā)生FRET的具體貢獻(xiàn)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)LDH中色氨酸長(zhǎng)壽命成分的衰減占據(jù)整體衰減的主要部分.以丙酮酸作為阻斷劑,阻斷LDH和NADH之間的相互作用,證實(shí)LDH上存在NADH結(jié)合位點(diǎn)是色氨酸與NADH之間發(fā)生FRET的前提條件.乳酸脫氫酶LDH是與細(xì)胞代謝相關(guān)的酶,利用脫氫酶和NADH之間的能量轉(zhuǎn)移特性能為深入研究細(xì)胞代謝提供新思路.

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