甘露糖-6-磷酸/胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ受體介導(dǎo)PEDV感染作用的初步驗(yàn)證

班艷芳，董建國(guó)，2，范蘭蘭，于林洋，劉獻(xiàn)輝，張鵬飛，劉燕玲，張樂(lè)宜，王磊，宋長(zhǎng)緒*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 5106422.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一種高度接觸性腸道傳染病，以腹瀉、嘔吐、脫水和對(duì)哺乳仔豬高致死率為主要特征[1]。自2010年10月以來(lái)，PEDV變異毒株廣泛流行于國(guó)內(nèi)不同地區(qū)，對(duì)2周齡以內(nèi)仔豬的危害尤為嚴(yán)重，其發(fā)病率和死亡率甚至高達(dá)90%～100%，嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，給全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。

PEDV為冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)的成員，病毒形態(tài)呈球形，在糞便中的病毒粒子常呈現(xiàn)多形態(tài)，平均直徑為130 nm(95～190 nm)[4]。PEDV基因組為單股正鏈RNA，長(zhǎng)度約為28 kb。基因組分別編碼S蛋白(纖突蛋白)、M蛋白(膜糖蛋白)、E蛋白(小包膜糖蛋白)、N蛋白(核衣殼蛋白)、16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp1～nsp16)和ORF3蛋白[5]。其中S蛋白是PEDV主要抗原蛋白，可分為S1和S2結(jié)構(gòu)域，在PEDV入侵過(guò)程中，S1結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞受體相互作用，S2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的膜融合過(guò)程[3]。鑒定受體是了解病毒的跨種傳播、致病機(jī)制和制定干預(yù)策略的關(guān)鍵，PEDV的受體研究一直為研究者所青睞[6]。目前有文獻(xiàn)報(bào)道豬氨基肽酶N(pAPN)是PEDV的一個(gè)功能性受體[7]。然而也有研究發(fā)現(xiàn)，pAPN蛋白仍不能解釋PEDV感染中存在的相關(guān)理論問(wèn)題，Vero細(xì)胞系常用于PEDV毒株的分離和增殖，但這些細(xì)胞并不表達(dá)pAPN[8]。這提示PEDV可能不僅僅依賴于pAPN蛋白感染宿主細(xì)胞，也可能存在pAPN以外的受體蛋白[9]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，pAPN缺失的新生仔豬可預(yù)防豬傳染性胃腸炎病毒，但對(duì)豬流行性腹瀉病毒無(wú)保護(hù)作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了pAPN不是PEDV的受體[10]。

迄今為止，PEDV相關(guān)的侵入機(jī)制和免疫機(jī)理尚未明確，因此，對(duì)PEDV受體的研究具有重要的科學(xué)意義。有研究發(fā)現(xiàn)，甘露糖-6-磷酸/胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ受體(M6P/IGF2R，簡(jiǎn)稱M6PR)在人類醫(yī)學(xué)中關(guān)于輪狀病毒的研究比較多，大多數(shù)輪狀病毒株需要與不依賴于陽(yáng)離子的M6PR(CI-M6PR)才能進(jìn)入細(xì)胞[11]。CI-M6PR的胞質(zhì)外區(qū)有一個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)，由15個(gè)連續(xù)的重復(fù)組成，每個(gè)重復(fù)約147個(gè)氨基酸[12]。然而在豬等其他動(dòng)物體的研究卻鮮有報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)通過(guò)病毒鋪覆蛋白印跡技術(shù)(VOPBA)和質(zhì)譜(MS)技術(shù)，初步探索了不依賴于陽(yáng)離子的M6P/IGF2R對(duì)PEDV感染的影響，為進(jìn)一步研究PEDV感染細(xì)胞的機(jī)制和防控PED提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細(xì)胞和質(zhì)粒

PEDV GDgh毒株為本實(shí)驗(yàn)室保存；豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2、非洲綠猴腎細(xì)胞Vero E6為實(shí)驗(yàn)室保存；pCMV-PEDV S2-HA質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；鼠源抗PEDV S1單克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑

同源重組試劑盒(Vazyme，南京)；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收純化試劑盒(Promega，北京)；LipofectamineTMRNAiMAX Transfection Reagent、LipofectamineTMLTX Reagent with PLUSTMReagent 轉(zhuǎn)染試劑、DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、SuperScriptTMIV First-Strand Synthesis System反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、PierceTMBCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))；鼠源抗Flag、HA單克隆抗體(Sigma，德國(guó))；QuickBlockTMWestern一抗稀釋液(Beyotime，上海)；組織細(xì)胞RNA提取試劑盒(Magen，廣州)；Premix PrimesSTAR HS高保真酶(TaKaRa，大連)。

1.1.3 主要儀器

超速離心機(jī)(貝克曼Optima XPN-100)；場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(型號(hào)為Talos F200S，Thermo Fisher Scientific)；激光掃描共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM710)。

1.2 方法

1.2.1 病毒鋪覆蛋白結(jié)合試驗(yàn)(VOPBA)

取7日齡三元雜交(杜長(zhǎng)大)仔豬的新鮮小腸，輕輕刮取上皮黏膜組織，進(jìn)行蛋白裂解后測(cè)定蛋白濃度，制備豬小腸上皮黏膜蛋白。同時(shí)制備2塊SDS-PAGE，一塊轉(zhuǎn)印至PVDF膜，另一塊留作分析。小腸上皮黏膜蛋白上樣量為80～100μg/孔，進(jìn)行SDA-PAGE蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜，在室溫條件下，用含5%脫脂乳的含磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)封閉膜2 h，用含1%脫脂乳的PBS洗滌1次，最后用緩沖液(含1%脫脂乳的PBS,220 mmol/L NaCl)洗滌，將PVDF膜在緩沖液中4 ℃條件下過(guò)夜孵育純化的PEDV(20μg總蛋白質(zhì)/mL)，未孵育PEDV為空白對(duì)照。將PVDF膜清洗3次，用含0.05% Tween-20的PBST孵育PEDV S1單抗，室溫孵育3 h，孵育羊抗小鼠二抗，然后曝光。將在PVDF膜上獲得的蛋白印跡對(duì)應(yīng)膠條切下轉(zhuǎn)移至EP管，送至華大基因公司進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建

參照GenBank已發(fā)表的Sus scrofa M6P/IGF2R(AF339885.1)基因序列，通過(guò)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其胞外區(qū)。由于M6P/IGF2R蛋白分子較大，將其分為三段進(jìn)行擴(kuò)增，M6P/IGF2R1：1～750 aa，M6P/IGF2R2：678～1546 aa，M6P/IGF2R3：1486～2287 aa，擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。設(shè)計(jì)同源引物分別擴(kuò)增M6P/IGF2R 1～3和pCDNA3.1-3×flag載體，采用同源重組試劑，將M6P/IGF2R三段基因克隆于載體pCDNA3.1-3×flag，同源引物見(jiàn)表2。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆并送測(cè)序，正確陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取。

表1 用于擴(kuò)增M6P/IGF2R的引物序列

表2 同源重組引物序列

1.2.3 Western blot

Vero E6細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時(shí)轉(zhuǎn)染，應(yīng)用LipofectamineTMLTX Reagent with PLUSTMReagent將構(gòu)建好的pcDNA3.1-M6P/IGF2R重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，具體轉(zhuǎn)染操作參照說(shuō)明書，24 h后收樣，Western blot分析表達(dá)情況。

1.2.4 siRNA干擾試驗(yàn)

IPEC-J2細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，細(xì)胞融合達(dá)50%～70%時(shí)轉(zhuǎn)染，應(yīng)用LipofectamineTMRNAiMAX Transfection Reagent將M6P/IGF2R siRNA和陰性對(duì)照NC siRNA(吉瑪基因公司合成)轉(zhuǎn)染IPEC-J2細(xì)胞。具體轉(zhuǎn)染操作參照公司手冊(cè)，siRNA轉(zhuǎn)染量為10 pmol/孔。M6P/IGF2R-siRNA正義序列：5′-CCGAGACACCUGUCUGUAATT-3′，反義序列：5′- UUACAGACAGGUGUCUCGGTT-3′。陰性對(duì)照NC siRNA正義序列:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義序列：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞收集，進(jìn)行定時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)干擾效果。細(xì)胞分別命名為：NC組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照 siRNA)、siRNA干擾組(轉(zhuǎn)染M6P/IGF2R siRNA)。

1.2.5 激光共聚焦試驗(yàn)

Vero E6細(xì)胞接種到共聚焦皿中，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，將重組質(zhì)粒M6P/IGF2R1～3分別和PEDV S2進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，36 h后棄去培養(yǎng)基，PBS漂洗一次；4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS漂洗3次，10 min/次；0.5Triton X-100室溫透化15 min，PBS漂洗3次；2%BSA室溫封閉30 min，PBS漂洗一次；用一抗稀釋液稀釋一抗(1∶2 000)，4 ℃過(guò)夜孵育；PBS漂洗3次；用PBST稀釋熒光標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，PBS漂洗3次；用DAPI等核酸染料染核，工作濃度為1 μg/mL；PBS漂洗3次，最后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.6 病毒吸附試驗(yàn)

Vero E6細(xì)胞接種到24孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～90%，將構(gòu)建的M6P/IGF2R1～3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞進(jìn)行過(guò)表達(dá)；IPEC-J2細(xì)胞接種到24孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至50%～70%，轉(zhuǎn)染干擾M6P/IGF2R基因的siRNA。轉(zhuǎn)染36 h后將PEDV按照感染比(MOI)=0.1接種分別在4 ℃孵育3 h和37 ℃孵育1 h，在4 ℃孵育時(shí)，細(xì)胞需提前預(yù)冷1 h。孵育完成后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞RNA，取500 ng RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)病毒拷貝數(shù)，基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt。RT-qPCR引物見(jiàn)表3。

表3 用于檢測(cè)PEDV RNA拷貝數(shù)及內(nèi)參的RT-qPCR引物序列

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.000 1為差異極顯著，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 VOPBA篩選受體相關(guān)蛋白

VOPBA結(jié)果顯示，PEDV附著于分子質(zhì)量為250～300 kDa的蛋白條帶之間，未孵育PEDV的對(duì)照組未見(jiàn)反應(yīng)(圖1)。為了鑒定該蛋白，將凝膠中對(duì)應(yīng)的蛋白條帶切除，用質(zhì)譜法(MS)分析肽質(zhì)量。將質(zhì)譜數(shù)據(jù)與蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，在所獲得的肽段中，初步篩選到豬M6P/IGF2R，其分子質(zhì)量與在硝化纖維素膜上檢測(cè)到的蛋白大小相似。

圖1 VOPBA結(jié)果

2.2 Western blot分析M6P/IGF2R1～3表達(dá)情況

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒M6P/IGF2R1～3分別轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，條帶大小分別為90、104和96 kDa，與預(yù)期相符。

圖2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞Western blot檢測(cè)結(jié)果

2.3 siRNA干擾M6P/IGF2R表達(dá)

IPEC-J2細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾M6P/IGF2R的siRNA，收集細(xì)胞進(jìn)行M6P/IGF2R mRNA的RT-qPCR試驗(yàn)，檢測(cè)干擾效果，如圖3所示，與NC組相比，M6P/IGF2R siRNA可顯著降低M6P/IGF2R的mRNA表達(dá)水平。

注：****表示兩組間差異極顯著(P<0.000 1)圖3 M6P/IGF2R siRNA干擾效果

2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察M6P/IGF2R與PEDV在細(xì)胞中表達(dá)共定位

將構(gòu)建的M6P/IGF2R1～3重組質(zhì)粒分別和PEDV S2共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后36 h固定細(xì)胞，進(jìn)行激光共聚焦試驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示，分別共轉(zhuǎn)染M6P/IGF2R1和PEDV S2、M6P/IGF2R2和PEDV S2以及M6P/IGF2R3和PEDV S2的細(xì)胞中均出現(xiàn)特異性綠色熒光和紅色熒光，而Mock組細(xì)胞沒(méi)有出現(xiàn)特異性熒光，DAPI的單色圖中均可見(jiàn)清晰的細(xì)胞核，在Merge合成圖中，可見(jiàn)綠色熒光和紅色熒光相重疊，表明M6P/IGF2R和PEDV在細(xì)胞中表達(dá)共定位，這從一個(gè)側(cè)面反映了兩者之間存在相互作用。

圖4 激光共聚焦結(jié)果

2.5 M6P/IGF2R對(duì)病毒吸附的影響

2.5.1 過(guò)表達(dá)M6P/IGF2R促進(jìn)PEDV吸附Vero E6細(xì)胞

Vero細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染M6P/IGF2R1～3重組質(zhì)粒后，檢測(cè)PEDV吸附細(xì)胞的病毒拷貝數(shù)，結(jié)果如圖5所示，37 ℃條件下轉(zhuǎn)染M6P/IGF2R1～3和M6P/IGF2R123的細(xì)胞中，PEDV的含量相比于對(duì)照組有顯著提高，轉(zhuǎn)染M6P/IGF2R2和轉(zhuǎn)染M6P/IGF2R3的細(xì)胞中PEDV含量與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。4 ℃條件下分別轉(zhuǎn)染M6P/IGF2R1～3和共同轉(zhuǎn)染M6P/IGF2R123時(shí)，PEDV在Vero E6細(xì)胞上吸附的病毒含量相比于對(duì)照組均有顯著提高，表明M6P/IGF2R有促進(jìn)PEDV吸附的作用。

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns表示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。下同圖5 37 ℃(A)和4 ℃(B)條件下過(guò)表達(dá)M6P/IGF2R對(duì)PEDV吸附的影響

2.5.2 干擾M6P/IGF2R抑制PEDV吸附IPEC-J2細(xì)胞

在IPEC-J2細(xì)胞中干擾M6P/IGF2R基因表達(dá)后，PEDV吸附結(jié)果如圖6所示，相比對(duì)照組，干擾M6P/IGF2R組的PEDV含量在37℃和4℃時(shí)均顯著降低，表明M6P/IGF2R有促進(jìn)PEDV吸附的作用。

圖6 37 ℃(A)和4 ℃(B)條件下干擾M6P/IGF2R對(duì)PEDV吸附的影響

3 討論

病毒感染細(xì)胞的第一步即病毒與細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合，受體決定病毒的組織細(xì)胞嗜性，識(shí)別與病毒結(jié)合的宿主細(xì)胞分子將有助于了解病毒的生命周期及其致病機(jī)制[13]。M6PRs是一種多功能蛋白，在細(xì)胞表面與兩種不同的配體結(jié)合，即攜帶蛋白的甘露糖6-磷酸(M6P)和IGF-II[14]，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡[15]。CD-M6PR(結(jié)合活性依賴二價(jià)離子)和CI-M6PR在皰疹病毒(HSV)1型和2型以及水痘帶狀皰疹病毒在進(jìn)入細(xì)胞和細(xì)胞間傳播過(guò)程中都起著細(xì)胞受體的作用[16]。研究結(jié)果表明，細(xì)胞中有大量的M6PR，主要分布在反面高爾基體網(wǎng)絡(luò)(trans-Golgi network，TGN)、早期內(nèi)吞體、循環(huán)中的內(nèi)吞體、晚期內(nèi)吞體及質(zhì)膜，溶酶體中很少或沒(méi)有M6PR分布。細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)部的M6PR構(gòu)成了細(xì)胞的M6PR池，細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)部的M6PR量保持動(dòng)態(tài)平衡，二者可相互轉(zhuǎn)換[17]。

VOPBA試驗(yàn)利用病毒與受體具有高度親和力的特點(diǎn)和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印原理，直接鑒定與病毒結(jié)合的細(xì)胞膜受體蛋白，是近年來(lái)用于細(xì)胞膜表面病毒受體研究的重要方法。病毒與宿主細(xì)胞表面受體分子的結(jié)合是發(fā)生病毒侵染細(xì)胞的先行條件，病毒在受體的介導(dǎo)下最終進(jìn)入宿主細(xì)胞，從而出現(xiàn)一系列反應(yīng)[18]。鑒于此，本試驗(yàn)從質(zhì)譜結(jié)果中篩選與VOPBA結(jié)果條帶大小相符且屬于質(zhì)膜的蛋白來(lái)探索潛在的靶分子。

本試驗(yàn)通過(guò)VOPBA和質(zhì)譜篩選到目標(biāo)蛋白M6P/IGF2R，初步將其胞外區(qū)分為3段進(jìn)行擴(kuò)增，并構(gòu)建到pcDNA3.1-3×flag真核表達(dá)質(zhì)粒上。本試驗(yàn)激光共聚焦結(jié)果顯示，綠色熒光和紅色熒光能夠重合，表明M6P/IGF2R的3個(gè)片段均與PEDV S2蛋白存在共定位現(xiàn)象，說(shuō)明兩者可能存在相互作用。

PEDV引起的病變主要集中在豬的小腸組織，病毒主要在豬小腸上皮細(xì)胞內(nèi)增殖。因此，小腸上皮細(xì)胞作為固有層免疫細(xì)胞與外環(huán)境間的天然屏障構(gòu)成腸道的第一道免疫防線，但目前在體外培養(yǎng)中，Vero細(xì)胞是分離培養(yǎng)PEDV的最適細(xì)胞系[19]。本試驗(yàn)選取最適分離培養(yǎng)PEDV的且易于轉(zhuǎn)染的Vero細(xì)胞系進(jìn)行過(guò)表達(dá)M6P/IGF2R對(duì)PEDV吸附的影響試驗(yàn)，選取IPEC-J2宿主細(xì)胞進(jìn)行干擾M6P/IGF2R后驗(yàn)證其對(duì)PEDV吸附的影響。結(jié)果證實(shí)，過(guò)表達(dá)M6P/IGF2R可以促進(jìn)PEDV吸附細(xì)胞，干擾M6P/IGF2R?？梢越档蚉EDV的細(xì)胞吸附，這一結(jié)果與Díaz-Salinasa等[20]研究輪狀病毒的感染結(jié)果一致，所有經(jīng)轉(zhuǎn)染M6P/IGF2R siRNA的細(xì)胞中，病毒的傳染性均顯著降低30%～60%。由此提示，M6P/IGF2R在PEDV侵入細(xì)胞過(guò)程中可能起著細(xì)胞受體的作用。

綜上，本試驗(yàn)通過(guò)VOPBA和質(zhì)譜分析篩選到M6P/IGF2R，激光共聚焦結(jié)果顯示其與PEDV存在共定位現(xiàn)象；通過(guò)過(guò)表達(dá)和干擾M6P/IGF2R后檢測(cè)病毒吸附結(jié)果證實(shí)，M6P/IGF2R能夠促進(jìn)PEDV的吸附。本研究為進(jìn)一步研究PEDV的受體提供理論參考。