重樓皂苷G通過CIP2A/PP2A信號(hào)通路抑制淋巴瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)凋亡及自噬的機(jī)制研究

劉雪文，向雨晨，劉洋洋，司 淵,4，劉 瑩,3,4*，郭 陽,3,4*

1湖北醫(yī)藥學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2湖北醫(yī)藥學(xué)院 武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3湖北醫(yī)藥學(xué)院 胚胎干細(xì)胞湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4湖北醫(yī)藥學(xué)院 生物醫(yī)藥研究院，十堰 442000

惡性淋巴瘤是一種具有較高異質(zhì)性的腫瘤，發(fā)生在淋巴結(jié)中。由于淋巴系統(tǒng)遍布全身，淋巴瘤是一種全身性疾病，可影響體內(nèi)幾乎所有組織和器官[1]。2018年，全球約有589 530例新淋巴瘤病例和274 891例與淋巴瘤相關(guān)的死亡[2]。幾乎90%的淋巴瘤病例是B細(xì)胞起源的，但是淋巴瘤也可以來源于T細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞[3]。目前，化學(xué)療法，放射療法，外周血干細(xì)胞移植，利妥昔單抗和靶向療法均被用于治療淋巴瘤。然而，仍有一些更具侵略性的淋巴瘤類型具有較低的存活率[4]。因此，發(fā)現(xiàn)新的有效治療方法對(duì)于提高淋巴瘤患者的生存期是必要的。

蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)的癌性抑制因子(cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A，CIP2A)是一種癌基因，可抑制PP2A的磷酸酶活性，進(jìn)而阻遏PP2A對(duì)下游分子(包括Akt、ERK等)的去磷酸化，從而維持Akt、ERK等信號(hào)的組成性活化，而促進(jìn)各種惡性腫瘤的腫瘤發(fā)生、化療耐藥、凋亡及自噬抗性、及預(yù)后不良[5-7]。我們先前曾報(bào)道，在急性髓細(xì)胞性白血病和多發(fā)性骨髓瘤中，CIP2A的異常高表達(dá)促進(jìn)預(yù)后不良[8,9]。2013年，Lilja等[10]報(bào)道了CIP2A在B細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)上調(diào)。CIP2A在淋巴瘤中的分子生物學(xué)功能和潛在機(jī)制尚不完全清楚。因此，迫切需要進(jìn)行深入研究以探索CIP2A作為淋巴瘤治療靶點(diǎn)的可能性。

從中草藥中提取的天然產(chǎn)物仍然是腫瘤藥物發(fā)現(xiàn)的重要資源。延齡草(TrilliumtschonoskiiMaxim)屬于百合科，是中國(guó)的傳統(tǒng)中草藥[11]。廣泛分布在中國(guó)的西南、西北、華中等地，是武當(dāng)及神農(nóng)架地區(qū)四大神藥之一，具有鎮(zhèn)痛、止血、解毒等傳統(tǒng)功效[12]。延齡草的主要活性成分之一，polyphyllin G(PPG，圖1)是一種甾體皂苷。本文旨在探討PPG在人淋巴瘤細(xì)胞中的作用及其機(jī)制。

圖1 重樓皂苷G結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structure of polyphyllin G

1 材料

1.1 細(xì)胞

Raji細(xì)胞株購(gòu)自ATCC公司。細(xì)胞在含有10%胎牛血清(Hyclone)和抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone)中培養(yǎng)，并在37 °C，5% CO2的孵箱中孵育。

1.2 藥物及試劑

經(jīng)HPLC測(cè)定純度高達(dá)95%的PPG(上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司)。PPG溶于二甲基亞砜至30 mmol/L并在-20 °C冰箱中存儲(chǔ)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：C1062M)。岡田酸(Sigma-Aldrich，產(chǎn)品編號(hào)：O9381)；caspase-3抗體(貨號(hào)#9662)、PARP抗體(貨號(hào)#9542)、LC3抗體(貨號(hào)#12741)均購(gòu)自Cell Signaling Technology；phospho-Akt抗體(Ser473，貨號(hào)sc-7985)、Akt抗體(貨號(hào)sc-8312)均購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology；GAPDH抗體(Abmart，貨號(hào)M20006)；HRP-兔二抗及鼠二抗(EarthOx公司，貨號(hào) E030120-01、E030110-01)；Dylight 488-兔二抗(Abbkine，貨號(hào)#A23410)。PP2A免疫沉淀磷酸酶檢測(cè)試劑盒(Upstate)。

2 方法

2.1 CCK-8實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞(1×104)被接種到96孔板，預(yù)培養(yǎng)4 h，然后用PPG(濃度分別為2、3、4、6、8、10 μmol/L)共孵育處理24 h或48 h。采用CCK-8試劑盒(日本同仁)檢測(cè)細(xì)胞毒性，酶標(biāo)儀檢測(cè)在450 nm處的吸光度。抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%。

2.2 臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)

把細(xì)胞密度約2.0×105cells/mL的細(xì)胞懸液加入12孔板，每孔加入1.980 mL，孵育24 h，每孔加入20 μL已配好100倍工作濃度的藥物，分別培養(yǎng)12、24、48 h后臺(tái)盼藍(lán)染色，每組細(xì)胞平行計(jì)數(shù)8次，取平均數(shù)繪制生長(zhǎng)曲線。

2.3 DAPI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

通過使用細(xì)胞離心涂片機(jī)將細(xì)胞接種在載玻片上，并用4%多聚甲醛固定。在含0.2%的Triton X-100的PBS中透化后，在含3% BSA的PBS中室溫封閉，用PBS漂洗3×5 min，DAPI染色(購(gòu)自碧云天，貨號(hào)C1005)后用蓋玻片封片。356 nm紫外光為激發(fā)光，在熒光顯微鏡下觀察DAPI染色后細(xì)胞的凋亡形態(tài)并拍照。

2.4 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞(1.5×105)被接種于6孔板，預(yù)培養(yǎng)4 h，然后用PPI共孵育處理24 h。收集上清液及用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞并收集，1 000 rpm，離心1 min，棄上清，用PBS輕輕重懸細(xì)胞洗滌兩次并計(jì)數(shù)。加入100 μL已稀釋好的1× Annexin V-FITC結(jié)合液，輕輕重懸。加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。再加入10 μL的PI染色液，輕輕混勻，置于冰浴中避光孵育15 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.5 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)

收集處理后的細(xì)胞，RIPA裂解液冰浴裂解20 min后，12 000 rpm，4 °C離心10 min，取上清蛋白裂解液BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入對(duì)應(yīng)體積的SDS震蕩均勻，99 °C煮5 min使蛋白變性。SDS-PAGE電泳后，用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，經(jīng)5%脫脂牛奶封閉，一抗4 °C孵育過夜后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1.5 h，膠片顯影。

2.6 免疫熒光

通過使用細(xì)胞離心涂片機(jī)將細(xì)胞接種在載玻片上，并用4%多聚甲醛固定。在含0.2%的Triton X-100的PBS中透化后，在含3% BSA的PBS中室溫封閉，用PBS漂洗3×5 min，加入LC3一抗，4 °C過夜。再用PBS漂洗3×5 min，Dylight 488-兔二抗室溫避光孵育1.5 h。激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬體形成并拍照。

2.7 PP2A活性測(cè)定

按照PP2A免疫沉淀磷酸酶檢測(cè)試劑盒說明書來測(cè)定磷酸鹽的釋放量作為磷酸酶活性的指標(biāo)。100 μg的細(xì)胞分離蛋白與4 μg的抗PP2A單克隆抗體共同孵育過夜，將40 μL蛋白質(zhì)A瓊脂糖珠加入上述混合物中，4 °C孵育2 h。收集珠子，分別用700 μL預(yù)冷TBS洗滌3次，500 μL絲氨酸/蘇氨酸檢測(cè)緩沖液洗滌1次。在檢測(cè)緩沖液中用750 mmol/L的磷酸肽與珠子共孵育，30 °C不斷攪拌10 min。向混合物中加入100 μL的堿式碳酸銅磷酸鹽檢測(cè)溶液，通過酶標(biāo)儀測(cè)定其在650 nm處吸光度。

2.8 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 PPG對(duì)Raji細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用

通過CCK-8法檢測(cè)PPG對(duì)Raji細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPG處理24、48 h后，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，PPG對(duì)Raji細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用,并且呈一定的時(shí)間和濃度依賴性(圖2A)，PPG處理后Raji細(xì)胞的24 h IC50值為5.75 μmol/L。臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PPG在3.5 μmol/L到4.5 μmol/L劑量時(shí)能顯著抑制Raji細(xì)胞的增殖(圖1B)?？傊琍PG對(duì)淋巴瘤Raji細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用。

圖2 PPG對(duì)Raji細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Inhibitory effects of PPG on Raji cells注：(A)CCK-8法檢測(cè)PPG對(duì)Raji細(xì)胞的增殖抑制作用；(B)臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)PPG對(duì)Raji細(xì)胞的細(xì)胞活性作用。與空白對(duì)照組比較，*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001。Note:(A) The inhibitory effects of PPG on Raji cells analyzed by CCK-8 assay;(B) Inhibitory effects of PPG on cell viability of Raji cells assayed by trypan blue exclusion assay.Compared with control group,*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001.

3.2 PPG誘導(dǎo)Raji細(xì)胞發(fā)生凋亡及自噬

AnnexinV/FITC-PI雙標(biāo)法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度PPG作用Raji細(xì)胞24 h后，隨著PPG濃度的增加，Raji細(xì)胞凋亡率逐漸增加(圖3A-B)。同時(shí)，DAPI染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PPG處理后Raji細(xì)胞核發(fā)生皺縮，(圖3C)表明發(fā)生了凋亡。進(jìn)一步，我們通過Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)(圖3D)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著PPG藥物劑量的增加，caspase-8、caspase-3及PARP切割顯著增加，表明PPI能夠通過活化caspase而誘導(dǎo)Raji細(xì)胞發(fā)生凋亡。為了檢測(cè)自噬是否也參與了PPG誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，我們檢測(cè)了PPG后Raji細(xì)胞中自噬相關(guān)因子LC3、Beclin 1的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在PPG處理組細(xì)胞中LC3-II和Beclin1表達(dá)顯著上調(diào)，這表明PPG促進(jìn)Raji細(xì)胞自噬的發(fā)生(圖3E)。當(dāng)自噬啟動(dòng)時(shí)，LC3蛋白C末端被切割并且產(chǎn)生 LC3-II蛋白，然后在自噬體中轉(zhuǎn)移。為了進(jìn)一步檢測(cè)自噬體是否形成，我們通過免疫熒光檢測(cè)內(nèi)源LC3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞呈彌漫性熒光染色，PPG處理的Raji細(xì)胞呈現(xiàn)出斑點(diǎn)狀熒光染色(圖3F)，說明LC3在自噬體中發(fā)生了再分配。另外，PPG處理導(dǎo)致p62的下調(diào)(圖3E)，這表明自噬體與溶酶體發(fā)生了融合?？傊陨辖Y(jié)果表明，PPI能在淋巴瘤Raji細(xì)胞中誘導(dǎo)caspase依賴的細(xì)胞凋亡和自噬。

圖3 PPG誘導(dǎo)Raji發(fā)生凋亡及自噬Fig.3 PPG induces apoptosis and autophagy in Raji cells注：(A、B)不同劑量PPG處理Raji細(xì)胞24 h，通過AV/PI染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；(C)用不同劑量的PPG處理Raji細(xì)胞并24 h，通過DAPI染色，熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞核形態(tài)變化；(D、E)不同劑量PPG處理Raji細(xì)胞24 h，通過Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況；(F)不同劑量PPG處理Raji細(xì)胞24 h，免疫熒光檢測(cè)LC3自噬體形成情況。與0 μmol/L PPG組比較，*P <0.05，**P <0.01。Note:(A,B) Raji cells were treated with different doses of PPG for 24 h,and apoptosis was detected by AV/PI staining and flow cytometry;(C) Raji cells were treated with different doses of PPG for 24 h.DAPI staining and fluorescence microscopy were used to detect changes in nuclear morphology;(D,E) Raji cells were treated with different doses of PPG for 24 h,and the expression of apoptosis-related proteins was detected by western blot;(F) Raji cells were treated with different doses of PPG for 24 h,and immunofluorescence was used to detect the formation of LC3 autophagosomes.Compared with 0 μmol/L PPG group,*P <0.05, **P <0.01

3.3 PPG下調(diào)Raji細(xì)胞中CIP2A表達(dá)而重激活PP2A活性

用濃度遞增的PPG處理Raji細(xì)胞 24 h后，通過Western blot 法檢測(cè)凋亡及自噬上游相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，PPG下調(diào)了CIP2A的蛋白表達(dá)(圖4A)。CIP2A是蛋白磷酸酶PP2A的內(nèi)源性抑制劑，同時(shí)，腫瘤明星信號(hào)分子Akt的去磷酸化受到PP2A的廣泛調(diào)節(jié)[13]。因此，我們進(jìn)一步檢測(cè)PPG對(duì)CIP2A的下調(diào)是否可以恢復(fù)PP2A活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PP2A活性在用PPG處理的Raji細(xì)胞中顯著上調(diào)(圖4B)。此外，PPG亦能夠下調(diào)PP2A下游Akt磷酸化(pAkt)(圖4C)，表明Akt活性下降。總之，以上這些結(jié)果表明PPI可能是通過影響下調(diào)CIP2A而重激活PP2A的磷酸酶活性。

圖4 PPG下調(diào)CIP2A而重激活PP2AFig.4 PPG down-regulates CIP2A and reactivates PP2A注：(A)PPG處理Raji細(xì)胞24 h后，Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)；(B)PPG處理Raji細(xì)胞24 h后，PP2A磷酸酶活性試劑盒測(cè)定分析PPG處理后的Raji細(xì)胞中PP2A的活性；(C)PPG處理Raji細(xì)胞24 h后，Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)。與0 μmol/L PPG組比較，*P <0.05。Note:(A) Raji cells were treated with PPG for 24 h,the expression of related proteins was detected by Western blot;(B) Raji cells were treated with PPG for 24 h,PP2A phosphatase activity kit was used to measure and analyze the activity of PP2A;(C) Raji cells were treated with PPG for 24 h,the expression of related proteins was detected by Western blot.Compared with 0 μmol/L PPG group,*P <0.05.

3.4 重激活PP2A活性是PPG誘導(dǎo)凋亡及自噬的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

為了檢測(cè)PPG誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞凋亡及自噬是否是由PP2A重激活引起，我們通過PP2A抑制劑岡田酸(okadaic acid，OA)與PPG共處理檢測(cè)細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)因子。數(shù)據(jù)表明OA顯著逆轉(zhuǎn)了由PPG誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞凋亡及自噬(圖5A和5B)。總之，這些結(jié)果表明PP2A的重激活是PPG通過抑制CIP2A來促進(jìn)細(xì)胞凋亡及自噬的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，我們得出以下結(jié)論，PPG在一定程度上是通過抑制CIP2A/PP2A/Akt信號(hào)軸來抑制淋巴瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡及自噬。

圖5 重激活PP2A活性是PPG誘導(dǎo)凋亡及自噬的關(guān)鍵環(huán)節(jié)Fig.5 Reactivation of PP2A activity is a key step in PPG-induced apoptosis and autophagy注：(A)PPG(4.5 μmol/L)和/或OA(20 nmol/L)處理Raji細(xì)胞24 h后，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)；(B)PPG(4.5 μmol/L)和/或OA(20 nmol/L)處理Raji細(xì)胞24 h后，Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。OA、PPG共處理組與PPG組相比，*P <0.05.Note:(A) After 24 h treatment of Raji cells with PPG (4.5 μmol/L) and/or OA (20 nmol/L),CCK-8 was used to detect cell growth;(B) After 24 h treatment of Raji cells with PPG (4.5 μmol/L) and/or OA (20 nmol/L),Western blot was used to detect the expression of related proteins.OA,PPG co-treated group compared with PPG group,*P <0.05.

4 討論

天然中草藥來源的小分子化合物一直是腫瘤藥物發(fā)現(xiàn)的重要資源。PPG是一種生物活性甾體皂苷，已被證明在某些腫瘤類型存在治療效果[14,15]，而其在淋巴瘤中的治療作用尚無報(bào)導(dǎo)。本研究揭示了一種新的PPG抗癌機(jī)制，即通過抑制CIP2A/PP2A/Akt信號(hào)軸抑制淋巴瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及誘導(dǎo)凋亡。

凋亡途徑的異常在血液惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡亦是腫瘤治療的重要策略[16,17]。流式細(xì)胞術(shù)證明PPG能有效誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡(圖3A)。細(xì)胞凋亡伴隨著多種形態(tài)學(xué)變化，例如核皺縮及形成凋亡小體。通過DAPI染色發(fā)現(xiàn)，PPG處理后的Raji細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)生明顯的皺縮(圖3C)。Caspase-3以及PARP蛋白的水解(圖3D)，表明PPG可誘導(dǎo)Raji細(xì)胞發(fā)生caspase介導(dǎo)的凋亡。自噬是II類程序性細(xì)胞死亡。自噬過程中，LC3II對(duì)自噬體的形成至關(guān)重要，而Beclin1是促進(jìn)自噬體形成的關(guān)鍵因子[18]。我們的結(jié)果表明，PPG通過上調(diào)LC3II和 Beclin1 表達(dá)水平而激活自噬(圖3E)。進(jìn)一步，免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PPG促進(jìn)自噬體形成(圖3F)。另外，PPG能夠下調(diào)p62表達(dá)(圖3E)，這表明PPG可能通過促進(jìn)自噬體與溶酶體融合而引起p62降解。以上表明PPG促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞凋亡及自噬的發(fā)生。某些情況下，自噬抑制凋亡，是細(xì)胞的存活途徑；但自噬本身也會(huì)誘發(fā)細(xì)胞死亡，或與凋亡共同作用及在凋亡缺陷的情況下作為備份機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[19]。而PPG則可能引發(fā)兩種通路的關(guān)聯(lián)調(diào)控。

CIP2A的過表達(dá)通常與多種人類腫瘤相關(guān)，而抑制CIP2A亦是腫瘤靶向治療的新策略[20]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PPG能夠在蛋白水平上引起Raji細(xì)胞中CIP2A的顯著下調(diào)(圖4A)。進(jìn)一步調(diào)查其下游分子PP2A的活性，發(fā)現(xiàn)PPG通過下調(diào)CIP2A重激活了Raji細(xì)胞中的PP2A磷酸酶活性，從而促進(jìn)Akt的去磷酸化(圖4B和4C)。因此，PPG可能通過下調(diào)CIP2A而重新激活PP2A，進(jìn)而抑制其下游重要癌性信號(hào)分子Akt的活性。Akt是參與眾多腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡、自噬及多藥耐藥的關(guān)鍵信號(hào)節(jié)點(diǎn)[21]。由此，我們提出PPG可能通過CIP2A/PP2A/Akt信號(hào)軸抑制淋巴瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)凋亡、自噬。進(jìn)一步PP2A抑制劑OA可以拮抗PPG對(duì)淋巴瘤細(xì)胞凋亡、自噬的活化作用(圖5)。這些結(jié)果證實(shí)了PP2A的重激活在PPG下調(diào)CIP2A抑制淋巴瘤通路中起關(guān)鍵作用。

總之，本課題的研究結(jié)果為進(jìn)一步深入探討PPG對(duì)CIP2A/PP2A/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用機(jī)制，以及PPG的抗淋巴瘤作用提供了研究基礎(chǔ)。