模式生物斑馬魚在藥物毒性評價中的應用及研究現(xiàn)狀

曾 彬，張存艷，陳 凱

1四川中醫(yī)藥高等?？茖W校，綿陽 621000；2成都中醫(yī)藥大學藥學院西南特色中藥資源重點實驗室，成都 611137

斑馬魚(Danio rerio或Zebrafish)是一種熱帶硬骨魚，最早產(chǎn)于印度、東南亞等熱帶地區(qū)，因其體表具有延伸至尾部的藍色水平條紋，形似斑馬而得名[1]，此外，又名花條魚、藍條魚和斑馬擔尼魚等。通過對比斑馬魚與人類基因庫，發(fā)現(xiàn)斑馬魚與人類基因組具有高度的相似性，相似度高達87.0%[2,3]，這意味著以斑馬魚為模式生物而取得的實驗結(jié)果大多數(shù)也適用于人類。因此，筆者結(jié)合國內(nèi)外近5年文獻報道，綜述了模式生物斑馬魚在藥物毒性篩選方面的最新研究進展，并且通過對文獻數(shù)量的統(tǒng)計，分析了當下斑馬魚研究涉及到的方向，以期對斑馬魚作為模式生物進行藥物毒性篩選或基礎(chǔ)研究提供參考。

1 斑馬魚在藥物毒性評價中的應用

相比于其他哺乳動物，斑馬魚具有繁殖能力強、繁殖量大、生命周期短、養(yǎng)殖費用低、身體透明等特點。斑馬魚一次可以產(chǎn)卵300～600枚，并且精子可以冷凍保存[4]，從而減少對活體培養(yǎng)的需求。一般受精后24 h開始血液循環(huán)，48～72 h開始孵化，3～4天要器官就已形成，3～4個月后達到性成熟[5]，在3個月內(nèi)長成成年魚[6]，僅利用卵黃囊中的營養(yǎng)可以存活7 天。斑馬魚幼魚體長只有1～4 mm，在96孔板單孔內(nèi)可以放置5～7條，是目前惟一適合于微孔板高通量、高內(nèi)涵、全自動化分析的脊椎動物模型[7]。與酵母、蠕蟲或蒼蠅相比，斑馬魚身體透明，具有可識別的器官系統(tǒng)，如肝臟、心臟、腎臟、胰腺等[8]，常以有機整體參與實驗，打破了細胞和離體模型篩選藥理活性的局限，可以直觀地從整體水平評價藥物的藥理作用和毒理學終點。隨著顯微操作技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷成熟，已經(jīng)實現(xiàn)了在斑馬魚體內(nèi)特定位置植入熒光蛋白，獲得不同種類熒光標記的斑馬魚品系，如已獲得肝臟熒光、心臟熒光、脾臟熒光、腎臟熒光等品系的斑馬魚[9]，這些熒光在體內(nèi)特定位置的表達有利于觀察組織器官的精細變化?；谥T多突出的生理優(yōu)勢，斑馬魚逐漸發(fā)展成為一種用來研究基因和發(fā)育的脊椎動物模型，被廣泛應用于藥物的毒性物質(zhì)篩選研究。

斑馬魚大多數(shù)器官的功能與人類器官相同，并表現(xiàn)出良好的生理功能[10]，適用于高通量表型篩選。常用的評價指標見表1[11-16]。

表1 斑馬魚用于藥物評價的指標特征Table 1 Index characteristics of zebrafish used for drug evaluation

1.1 心臟毒性評價中的應用

斑馬魚的心臟有兩個腔，類似于人類胚胎妊娠3周時的心臟。雖然存在明顯的形態(tài)學差異，但由于斑馬魚心臟和人類心臟在解剖學、細胞生物學和膜生物學水平上高度保守的特性[17-19]，使其成為研究心臟發(fā)育和相關(guān)疾病的一個強有力的模型。

西藥由于成分單一，研究透徹，故應用比較全面，以斑馬魚作為實驗動物能夠準確、快速做出評價。Li等[20]采用轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(kdrl:m Cherry)和Tg(myl7:GFP)評價溴氰菊酯對心血管系統(tǒng)的影響及其可能機制。發(fā)現(xiàn)以吖啶橙染色處理后的斑馬魚幼體在頭、體、心、尾部區(qū)域均產(chǎn)生不同程度的細胞凋亡且呈劑量依賴性，說明溴氰菊酯可誘導細胞凋亡；以紅色熒光蛋白標記的血管內(nèi)皮細胞在共聚焦圖像和熒光強度全合成的條件下，更清晰地反映了心臟形態(tài)的變化，表現(xiàn)出溴氰菊酯對其心臟的損傷。

中藥雖然具有成分復雜、作用環(huán)節(jié)多、毒性靶器官不明確等特點，但作為一種完整的動物模型，斑馬魚可以對藥物的心臟毒性進行準確、快速的評價，進而實現(xiàn)對藥物靶器官的初步確定和藥物毒性的快速、高通量篩選。Cao[21]以模式生物斑馬魚胚胎為研究模型，考察京大戟醋制前后不同極性部位對心臟的毒性作用。對受精后12 h發(fā)育正常的斑馬魚胚胎分別給予京大戟生品和醋制品的不同部位提取物，觀察受精后72 h藥物對斑馬魚胚胎心臟發(fā)育和心臟功能的影響。發(fā)現(xiàn)京大戟醋制前后不同極性部位對斑馬魚胚胎均具有心臟毒性，并呈一定的劑量相關(guān)性；主要表現(xiàn)為心臟發(fā)育緩慢、心包水腫、心率降低、心臟細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。表明京大戟毒性作用的靶器官為心臟，說明可以用斑馬魚來篩選藥物毒性作用的靶器官。除此之外，有研究者以馬兜鈴酸、木香揮發(fā)油、雷公藤紅素、氯化鋇等誘導斑馬魚心臟毒性[22-24]，均取得了可靠的實驗結(jié)果。

多種藥物的毒性在斑馬魚和人類之間是相通的。Zhu等[25]建立了卵黃囊微注射技術(shù)誘導斑馬魚心血管毒性程序，認為斑馬魚對已知的心臟毒性藥物的反應或與人類相同，或與人類相似，而且斑馬魚能較準確的預測藥物的心血管毒性。例如，在檢測小分子物質(zhì)對斑馬魚心率潛在的毒性作用過程中，23種測試藥物中有22種在斑馬魚胚胎中表現(xiàn)出心動過緩和房室傳導阻滯效應，這與通過人體觀察到的現(xiàn)象相一致[26]，進一步說明斑馬魚是一種有價值的脊椎動物模型。

1.2 肝臟毒性評價中的應用

肝臟是人和動物主要的代謝器官，肝臟代謝相關(guān)的疾病已成為嚴重危害全人類身體健康的主要因素，因此，藥物的肝毒性研究在醫(yī)藥行業(yè)顯得尤為重要[27]。由于斑馬魚與人類在肝細胞組成、功能、信號和對損傷的反應等方面具有極高的相似性，且所有的消化器官在幼魚120 h就已完全成熟，使得它們成為研究藥物肝毒性的首選動物模型。Dai等[28]將發(fā)育4 h的肝臟熒光系斑馬魚暴露于不同濃度的香加皮水提液中，通過測定幼魚肝臟形態(tài)、肝臟熒光面積大小、肝臟熒光強度、肝細胞凋亡數(shù)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)活性、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartic transaminase，AST)活性等，最終得出香加皮水提液可能是通過破環(huán)斑馬魚體內(nèi)氧化應激平衡而出現(xiàn)肝臟毒性，進而導致肝細胞凋亡。Luo等[29]以正常發(fā)育受精后3天的斑馬魚幼魚為模型，用不同極性的醋甘遂提取物處理，統(tǒng)計給藥后72 h內(nèi)斑馬魚的死亡率，發(fā)現(xiàn)石油醚提取部位處理后的幼魚給藥組肝臟區(qū)顏色變暗，經(jīng)蘇木精-伊紅染色后，發(fā)現(xiàn)有輕微的肝損傷；該研究首次以斑馬魚幼魚為模型研究醋甘遂的肝臟毒性，為其臨床安全、合理用藥提供依據(jù)，并為斑馬魚模型用于藥物毒性快速評價提供參考與指導。同樣，為研究京大戟醋制前后不同極性部位對斑馬魚肝毒性的影響，Yao等[30]將受精后12 h的斑馬魚胚胎暴露于不同濃度的藥液中至96 h，評價其肝毒性。發(fā)現(xiàn)京大戟醋制前后各極性部位對斑馬魚胚胎的肝毒性主要表現(xiàn)為肝臟發(fā)育緩慢、肝臟面積變小、肝臟顏色發(fā)黑、卵黃囊水腫、吸收延遲、出血，并且毒性隨著濃度的增加而增強，在醋制后毒性反應降低。Quan等[31]首次用斑馬魚模型探索何首烏中18種成分的肝臟毒性作用，發(fā)現(xiàn)大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素-1-O-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-葡萄糖苷、蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷對斑馬魚幼魚肝臟具有一定毒性作用。

以上研究表明斑馬魚不僅可以作為中藥提取物前期毒性篩選，同時也可用于有毒中藥毒性靶器官以及對機體的損傷狀況等研究。

1.3 腎臟毒性評價中的應用

腎臟疾病是一個全球性的問題，研究開發(fā)更好的治療方法至關(guān)重要。動物模型可以更好地幫助人類認識各種腎臟疾病的病理學特點，并篩選治療藥物。作為斑馬魚主要的排泄器官，腎臟極易受到排泄物的損害，一旦受到損傷，斑馬魚就會因為滲透壓調(diào)節(jié)障礙而出現(xiàn)不同程度的水腫[32]，如腎包膜水腫、心包水腫、眼球水腫等，甚則出現(xiàn)腎臟扭曲、腎小球等組織形態(tài)改變等。除此之外，也可以通過腎臟組織病理切片和轉(zhuǎn)基因熒光斑馬魚觀察腎組織的異常。

通過閱讀整理斑馬魚腎臟毒性研究的相關(guān)文獻報道，發(fā)現(xiàn)研究者已使用斑馬魚建立了各種腎毒性模型[33-35]，包括腎毒性引起的局部水腫(心包水腫、眼水腫和腦水腫等)或全身水腫模型、腎小球濾過障礙模型、肌酐檢測模型以及基于基因構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型等，這些模型為現(xiàn)代新藥的研發(fā)提供了極大的幫助。Ding等[36]和Wang等[37]均采用斑馬魚模型評價了馬兜鈴酸(AA)的腎毒性，兩者結(jié)果都說明斑馬魚模型可用于藥物腎毒性的早期評價。Lindstrand等[38]將針對SOS Ras/Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子2(SOS2)和酸性磷酸酶1(ACPI)的嗎啉代注射到斑馬魚胚胎中，觀察到腎小管的形態(tài)發(fā)生了變化，如伸長，胚胎的整體體長也縮短了，胚胎在72 h時出現(xiàn)水腫[39]，雖然目前研究表明ACPI與腎功能之間沒有明確的關(guān)聯(lián)，但該實驗為進一步研究ACPI的作用靶點提供了方向。還有研究報道醋甘遂[40]、款冬葉[41]在一定量時都會導致斑馬魚腎臟出現(xiàn)不同程度的損傷。以上結(jié)果提示，斑馬魚作為模式生物，在腎臟疾病研究中具有很大的發(fā)展?jié)撃堋?/p>

與此同時，斑馬魚腎臟模型也存在弊端，就是通常很難通過檢測尿液的變化，來評估特定標記物的變化情況，因為可以檢測的是培養(yǎng)斑馬魚的周圍水，而不是純尿液。此外，斑馬魚尿量小，而且尿液被釋放到周圍的水中，故臨床常規(guī)使用的正常腎功能測試對斑馬魚腎病模型具有挑戰(zhàn)性，這可能會限制斑馬魚作為腎臟疾病模型的應用。

1.4 脾臟毒性評價中的應用

脾臟是斑馬魚重要的免疫器官，在對抗外來抗原方面至關(guān)重要，主要起調(diào)控免疫作用。Ma等[42]發(fā)現(xiàn)全氟辛酸(PFOA)能使斑馬魚免疫系統(tǒng)損傷，脾臟出現(xiàn)細胞膜皺縮、脾臟空泡化等現(xiàn)象，并且存在明顯的量-效關(guān)系，其機制與誘導白介素表達紊亂有關(guān)，該結(jié)果可用于評價水生生物的健康狀況。Zhen等[43]用從香澤蘭中提出的總黃酮，對斑馬魚進行水觸媒染毒，21天后取出脾臟，制作石蠟切片，用蘇木精-伊紅染色，置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)隨著總黃酮濃度的升高，斑馬魚脾臟出現(xiàn)脾竇擴張，脾臟內(nèi)淋巴細胞數(shù)量增加，血細胞核濃縮等病變，表明適宜濃度的香澤蘭總黃酮對斑馬魚脾臟有一定的毒性。就文獻報道數(shù)量來看，對斑馬魚脾臟這一方面的研究還比較欠缺，有望成為日后研究斑馬魚的重點。

1.5 神經(jīng)毒性評價中的應用

神經(jīng)毒性是藥物安全性評價的一個重要指標，然而相關(guān)實驗的開展比較復雜，無論是行為學分析還是組織病理學檢查，都面臨很大的挑戰(zhàn)。斑馬魚雖然是脊椎模式生物，但是斑馬魚的神經(jīng)系統(tǒng)與人類和哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)排列相似，可用于篩選神經(jīng)系統(tǒng)藥物的毒性。

有機磷阻燃劑是普遍存在的環(huán)境污染物，然而，關(guān)于其對環(huán)境影響的風險評估和毒性程度的認識卻是有限的。為此，研究者探討了急性和長期暴露于三磷酸鹽(TDCPP)對斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)的影響。通過檢測TDCPP在斑馬魚腦組織中的分布情況，發(fā)現(xiàn)在雌雄斑馬魚的腦組織中都能觀察到神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育基因的下調(diào)，在雌性魚中檢測到更高的水平。表明在TDCPP誘導的神經(jīng)毒性方面，雌性比雄性的應激性更敏感[44]。

1.6 五官毒性評價中的應用

五官為人和動物重要的構(gòu)成部分，五官科疾病不僅會對機體造成嚴重的傷害，而且會影響生物體的日常行動、對生活造成不便。因此，構(gòu)建斑馬魚五官科疾病模型十分必要。

Tang等[45]以不同濃度雷公藤多苷和二甲基亞砜飼養(yǎng)受精后5天的斑馬魚，將斑馬魚聽細胞數(shù)量和聽細胞熒光強度作為評價指標，發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷劑量濃度為5.21 μg/mL時，對斑馬魚聽細胞損傷率高達92.4%，且雷公藤苷對聽細胞的損失趨勢存在劑量依賴關(guān)系，隨著濃度的增加，聽細胞熒光強度也相應減弱，提示斑馬魚可用于耳毒性藥物的活性篩選。三甲基氯化錫(TMT)是工業(yè)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中應用最廣泛的有機錫化合物之一，廣泛存在于土壤、水系、食品和家居用品中。據(jù)報道，TMT對神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)毒性效應，然而，關(guān)于其對眼睛發(fā)育影響的信息有限，亦無明確的關(guān)聯(lián)機制。因此，Kim等[46]提出了三甲基氯化錫(TMT)對斑馬魚眼部形態(tài)影響的研究，發(fā)現(xiàn)暴露在TMT下會縮短斑馬魚眼睛的軸向長度和表面積，損害斑馬魚識別光線的能力。該研究首次證明了TMT在眼部發(fā)育過程中具有毒性效應，并且這種毒性效應是在眼形成過程中，誘導視網(wǎng)膜細胞的凋亡而產(chǎn)生的。由于眼睛的結(jié)構(gòu)和發(fā)育在脊椎動物中是相當保守的，因此，更好地了解TMT對斑馬魚眼部的發(fā)育毒性，為治療人類因TMT暴露引起的疾病提供了潛在的策略。

2 斑馬魚研究所取得的學術(shù)成果

斑馬魚具有作為模式生物的的諸多優(yōu)勢，不僅在藥物毒性研究中具有突出貢獻，而且在生命科學領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用，學術(shù)成果不斷涌現(xiàn)，因此筆者收集了近5年國內(nèi)外基于斑馬魚研究的SCI論文，分別從各國發(fā)表文章數(shù)量、研究的疾病類型、用于研究的斑馬魚年齡等方面多角度分析斑馬魚研究現(xiàn)狀，發(fā)現(xiàn)近5年來，全世界基于斑馬魚模式系統(tǒng)的研究取得了快速發(fā)展，主要反映在以下幾個方面。

2.1 發(fā)表SCI論文數(shù)量逐年遞增

近五年，全世界斑馬魚研究的SCI源刊論文發(fā)表數(shù)量為17 966篇，呈逐年增加趨勢(圖1A)，其中我國發(fā)表論文數(shù)量為4 457篇，僅次于美國，超越德國、英國、加拿大等國家，成為第二大國(圖1B)，占全世界SCI論文發(fā)表數(shù)量的四分之一(圖1C)，表明各國越來越多的研究機構(gòu)正在大力發(fā)展斑馬魚相關(guān)的科研工作，并且有望取得更多的研究成果。

圖1 與斑馬魚相關(guān)的SCI論文年度統(tǒng)計圖Fig.1 Statistical charts of SCI papers related to zebrafish注：A.近5年世界SCI論文數(shù)量；B.近5年各國發(fā)表SCI論文數(shù)量；C.中國發(fā)表SCI論文在世界的占比；D.涉及斑馬魚研究的疾病類型；E.用于研究的斑馬魚年齡(以Web of Science數(shù)據(jù)庫為檢索依據(jù))。Note:A.Number of SCI papers in the world in the past 5 years;B.Number of SCI papers published by countries in the past 5 years;C.The proportion of SCI papers published by China in the world;D.Types of diseases involving zebrafish research;E.Age of zebrafish used for research(based on Web of Science Database).

2.2 研究內(nèi)容日漸豐富

以斑馬魚為模式生物的研究內(nèi)容更加豐富，領(lǐng)域更加廣闊，并與現(xiàn)代生命科學研究的熱點緊密契合。自2015年至2019年，世界范圍內(nèi)發(fā)表斑馬魚相關(guān)的SCI論文涉及的領(lǐng)域主要有藥理學、毒理學、新藥篩選等[47]。目前涉及的疾病類型主要有心血管類、肝臟類、腫瘤類等，其中對腫瘤和肝臟疾病的研究占比較大，表明斑馬魚在這兩個方向的研究已成為當前熱點(圖1D)。

2.3 研究魚齡因情況而異

斑馬魚各器官不同時期的成熟程度有差異，而不同藥物對應不同的靶器官，這就意味著斑馬魚用于不同實驗研究的年齡會有所差異，因此統(tǒng)計了藥物在毒性篩選方面與年齡的數(shù)量關(guān)系(圖1E)。研究表明，斑馬魚在48 h肝臟形態(tài)已初步形成，而在60～70 h肝臟迅速生長至合適大小[48]，因此實驗中多以72 h的斑馬魚來篩選藥物的肝臟毒性。心臟是斑馬魚第一個發(fā)揮功能的器官，從5 h左右開始迅速發(fā)育，48 h完全形成[49,50]，研究者多以24～71 h的斑馬魚心臟篩選藥物毒性。由于成年魚具有成熟的生殖系統(tǒng)，因此以成年魚來篩選藥物的生殖毒性。這類統(tǒng)計可以為研究者在實驗時對斑馬魚的選擇提供參考。

3 結(jié)語與展望

毒理學研究中哺乳動物試驗成本高、耗時，通常在臨床藥物開發(fā)的后期進行，這些局限性阻礙了哺乳動物模型在某些疾病上的廣泛應用。因此，尋求一個創(chuàng)新的、理想的實驗動物模型來研究藥物毒性、篩選藥效已迫在眉睫。相比之下，斑馬魚在毒理學研究中相對成本低，可實現(xiàn)藥物多批高通量篩選，因此，斑馬魚可用于藥物臨床前研究，以便在早期階段篩選有毒化合物，并為進一步開發(fā)提供指導。

盡管斑馬魚作為優(yōu)良的模式生物在藥物毒性評價中受到廣大研究者的推崇，但是也存在局限性。如斑馬魚與人的給藥方式不同，大多以浸泡、替換液體等體外給藥，幼魚通過腸道、鰓和皮膚吸收周圍水中稀釋的小分子藥物，但一些化合物具有疏水性，不能被斑馬魚胚胎和仔魚充分吸收代謝，這種給藥方式無法保證斑馬魚吸入藥物量的恒定性，即無法準確地評價藥效，可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果[51,52]，降低實驗結(jié)果的準確性。其次，很多藥物都是在體內(nèi)經(jīng)過代謝活化而產(chǎn)生藥效或者毒性，在用斑馬魚評價藥物毒性過程中，很難確定是原藥產(chǎn)生的毒性作用還是代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的毒性，也很難判斷在人體中是否會產(chǎn)生同樣的代謝產(chǎn)物。雖然基因序列顯示，斑馬魚與人類基因同源性較高，但結(jié)構(gòu)和體型差異較大，且心血管系統(tǒng)只有1個心房、1個心室，與人類四腔心臟結(jié)構(gòu)不同[53]。相比于人類與其他哺乳動物，在生命初期，斑馬魚的受精卵排出體外，胚胎離體發(fā)育，與人類受精卵、胚胎的發(fā)育過程存在一定的差異，并且斑馬魚屬于水生動物模型，與人類生存環(huán)境大不相同，這也是建立各種斑馬魚疾病模型的不足之處，再次提醒我們?nèi)魏涡问降哪Ｐ投加锌赡苷`導我們，需對這些生物體可實現(xiàn)的最終結(jié)果進行全面的理解與考量。

Zhu[54]通過卵黃囊微注射技術(shù)證實了微注射可以控制給斑馬魚的確切劑量，如果轉(zhuǎn)換因子能夠得到驗證，則很容易將其轉(zhuǎn)換為人類或哺乳動物的劑量。這種新型的給藥方式，一定程度上克服了斑馬魚以往給藥方式的弊端，為日后的研究提供了很大的幫助。

綜上所述，斑馬魚作為21世紀新型模式生物，具有獨特的實驗優(yōu)勢，利用斑馬魚已經(jīng)成功地實現(xiàn)了藥物活性篩選，或已經(jīng)闡明以前不完全了解的疾病機制。對于解決與人類相關(guān)的疾病問題，斑馬魚仍具有至關(guān)重要的作用，將其與哺乳動物實驗、細胞分子實驗緊密聯(lián)系，定會為現(xiàn)代新藥的研發(fā)做出巨大貢獻，推動醫(yī)藥行業(yè)的迅速發(fā)展。