陽(yáng) 航,鄒情雅,陳 宇,路艷霞,劉夢(mèng)元,李路軍,3,4*,Paul W.Paré*
1藥物高通量篩選國(guó)家與地方聯(lián)合工程研究中心,生物催化與酶工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中藥生物技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北大學(xué),武漢 430062;2美國(guó)德州理工大學(xué) 化學(xué)與生物化學(xué)系,拉伯克 79409;3甘肅百草中藥材種植有限公司,蘭州 730102;4深圳市老年醫(yī)學(xué)研究所,深圳 518020
彩云木Synadeniumgrantii為大戟科(Euphorbiaceae)聚苞大戟屬Synadenium植物,是一種原產(chǎn)于非洲東部多汁灌木,后來(lái)作為一種觀賞植物引入美洲和歐洲[1],又稱“非洲乳木”。該木樹枝折斷或剝離莖皮,會(huì)產(chǎn)生白色乳膠汁[2]。臨床報(bào)告指出接觸該植物的乳膠汁,臉和脖子產(chǎn)生象火燒一樣的刺激感[3]。巴西民間常把該植物乳膠汁作為一種傳統(tǒng)藥物用于多種疾病的治療,如過(guò)敏,胃腸紊亂[4],腫瘤[5]等。該植物的葉也具有廣泛的藥理活性,研究表明彩云木葉乙醇提取物具有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎[6],抗菌[7]、抗腫瘤、抗血管生成[8]和改善痛經(jīng)作用[9]。Hassan等[10]發(fā)現(xiàn)其葉的氯仿提取物具有腫瘤細(xì)胞毒和抗寄生蟲作用,并從中得到兩個(gè)新的二萜酯類成分。Andersen等[11]從中分離得到多個(gè)花色素芹菜糖苷類成分。為了深入研究該植物化學(xué)資源,繼續(xù)尋找具有抗炎活性的化學(xué)成分,本研究對(duì)其葉的二氯甲烷-甲醇(1∶1)提取物的化學(xué)成分及其體外抗炎活性進(jìn)行了研究,以探明其抗炎生物活性物質(zhì)基礎(chǔ)。
JEOL ECS 400 MHz核磁共振儀(Peabody,MA,USA);ESI-MS(API2000三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀,Applied Biosystems,F(xiàn)oster City,CA);分析和半制備型HPLC為Agilent 1100 HPLC(DAD檢測(cè)器);色譜柱為Zorbax SB-C18(Agilent,4.6 mm × 250 mm×5 μm,1 mL/min;9.4 mm × 250 mm×5 μm,3 mL/min);紫外分析儀(Spectroline,Westbury,NY,USA);Buchi R-114旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司); 超凈工作臺(tái)(中國(guó)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司); XDS-1B型倒置顯微鏡(中國(guó)北京佳源興業(yè)有限公司);硅膠60(0.040~0.063 mm,EMD Millipore,Billerica,MA,USA);Sephadex LH-20(GE healthcare Bio-sciences AB);MCI Gel CHP20P;大孔樹脂HP-20(日本,三菱);薄層硅膠板GF 254(Merck KGaA,Darmstadt Germany),正己烷、乙酸乙酯、氯仿、甲醇(Fisher Chemical,Certified ACS,F(xiàn)air Lawn,NJ,USA);其他試劑為分析純; 二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)(MTT)、脂多糖(LPS)(Sigma 公司);DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于HyCloneTM公司;胎牛血清(FBS)購(gòu)于浙江天杭生物科技有限公司;NO檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)。
樣品原料由埃及國(guó)家研究中心Mohamed-Elamir F.Hegazy教授采集并鑒定為SynadeniumgrantiiHook F.的干燥葉,標(biāo)本(編號(hào)20161201)存放于美國(guó)德州理工大學(xué)化學(xué)與生物化學(xué)系Paul W.Paré教授實(shí)驗(yàn)室。小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7由藥物高通量篩選國(guó)家與地方聯(lián)合工程研究中心提供。
干燥的彩云木葉(900 g),適當(dāng)粉碎,用3 L CH2Cl2-MeOH(1∶1,V/V)混合液室溫浸漬提取3次,合并提取液減壓濃縮除去溶劑,得提取浸膏63.5 g。取上述浸膏46.9 g 經(jīng)硅膠柱色譜(0.040~0.063 mm)分離,以正己烷-乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫(100∶1→1∶100),得62個(gè)流分F1~F62。取流分F15經(jīng)硅膠柱色譜,正己烷-乙酸乙酯(6∶1)洗脫后再經(jīng)Sephadex LH-20柱用CH2Cl2-MeOH(1∶1)洗脫得化合物1(20.0 mg),流分F19經(jīng)硅膠柱色譜由正己烷-乙酸乙酯(20∶1→4∶1)洗脫得化合物2(10.2 mg)。流分F26經(jīng)硅膠柱色譜/正己烷-乙酸乙酯(4∶1)得化合物3(3.6 mg),流分F30經(jīng)硅膠柱色譜用正己烷-乙酸乙酯(4∶1)洗脫后得3個(gè)主要次級(jí)流分F26a-F26c,F(xiàn)26a經(jīng)重結(jié)晶得化合物4(50.0 mg),F(xiàn)26c再經(jīng)硅膠柱色譜/正己烷-乙酸乙酯(10∶1)得化合物5(40.1 mg);流分F38上Sephadex LH-20柱經(jīng)CH2Cl2-MeOH(1∶1)洗脫得2個(gè)主要次級(jí)流分F38a和F38b, F38a經(jīng)RP-HPLC/乙腈-水(4∶1→9∶1)梯度洗脫得化合物6(15.3 mg)。流分F60經(jīng)硅膠柱由CH2Cl2-MeOH-H2O(200∶10∶1)洗脫得3個(gè)次級(jí)流分F60a~F60c,F(xiàn)60a經(jīng)再硅膠柱分離得化合物8(30.6 mg),F(xiàn)60c經(jīng)Sephadex LH-20柱MeOH洗脫得化合物7(8 mg)。流分F62用大孔吸附樹脂依次用純水、50%和95%乙醇水溶液洗脫,取50%乙醇洗脫液經(jīng)硅膠柱由CH2Cl2-MeOH(20∶1→5∶1)梯度洗脫得4個(gè)次級(jí)流分F62a~F62d,F(xiàn)62a經(jīng)RP-HPLC用MeOH-H2O梯度洗脫得化合物9(9.4 mg),F(xiàn)62d經(jīng)Sephadex LH-20柱以MeOH洗脫得化合物10(7.0 mg)。
1.3.1 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞按1×105個(gè)/mL, 200 μL/孔接種于96孔板中, 用含10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基于37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基,分別加入不同濃度的部分單體化合物至0、3.125、6.25、12.5、25、50 μM繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。
1.3.2 抗炎活性篩選
取單體化合物分別用DMSO配制成50 μM的溶液作為儲(chǔ)備液,加藥時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋。同樣條件培養(yǎng)細(xì)胞24 h后棄培養(yǎng)基,加入100 μL濃度為0、3.125、6.25、12.5、25、50 μM的系列單體化合物溶液孵育4 h,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,加入終質(zhì)量濃度為1 μg/mL的LPS刺激細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)20 h。離心, 取上清液,移至新的96孔板,按照試劑盒說(shuō)明書規(guī)定的方法,在540 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定NO,計(jì)算最大半數(shù)抑制濃度(IC50)值。
化合物1白色針晶(正己烷-乙酸乙酯);mp.179~181 ℃,ESI-MS:m/z465 [M+K]+。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:0.75(3H,s,H-23),0.83(3H,s,H-25),0.89(3H,s,H-24),0.93(6H,s,H-26,27),0.94(3H,s,H-28),1.03(3H,s,H-29),1.08(3H,s,H-30),3.46(1H,dd,J= 5.6,11.0 Hz,H-3),4.86(1H,s,H-19);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:142.9(C-18),129.8(C-19),76.4(C-3),51.1(C-5),49.3(C-9),43.5(C-14),41.1(C-8),38.9(C-4,13),38.5(C-1),37.8(C-16),37.7(C-22),37.5(C-10),34.6(C-7),34.5(C-17),33.5(C-21),32.3(C-20),31.5(C-29),29.3(C-30),28.4(C-23),27.6(C-15),26.4(C-12),25.6(C-2),25.4(C-28),22.3(C-26),21.1(C-11),18.4(C-6),16.7(C-25),16.2(C-24),14.8(C-27)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]基本一致,故化合物1鑒定為日爾曼醇。
化合物2白色針晶(正己烷-乙酸乙酯);mp.116~118 ℃,ESI-MS:m/z465 [M+K]+。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:0.76(3H,s,H-18),0.79(3H,s,H-29),0.86(3H,s,H-30),0.89(3H,d,J= 6.4 Hz,H-2l),0.96(3H,s,H-28),1.00(3H,s,H-19),1.60(3H,s,H-26),1.68(3H,s,H-27),3.24(1H,dd,J= l1.8,4.6 Hz,H-3),5.10(1H,t,J= 7.0 Hz,H-24);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:134.2(C-9),133.7(C-8),131.1(C-25),125.4(C-24),79.2(C-3),51.1(C-17),50.2(C-5),50.1(C-14),44.2(C-13),39.1(C-4),37.4(C-20),36.6(C-10),36.5(C-1),35.4(C-22 ),31.2(C-16),30.9(C-15),28.2(C-12),28.1(C-29),27.8(C-7),26.6(C-28),25.9(C-27),25.1(C-23),24.5(C-2),21.6(C-11),20.3(C-19),19.1(C-21),18.8(C-6),17.8(C-26),15.7(C-18),15.6(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]基本一致,故化合物2鑒定為大戟醇。
化合物3白色粉末;ESI-MS:m/z392 [M-H2O]+。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:0.88(3H,t,J= 6.5 Hz,H-28),1.26(-CH2),3.65(2H,q,J= 6.6 Hz,H-1);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:63.3(C-1),33.0,32.1,29.9,29.8,29.6,29.5,25.9,22.9(多個(gè)亞甲基C信號(hào)),14.3(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]基本一致,故化合物3鑒定為正二十八烷醇。
化合物4無(wú)色針晶(正己烷-乙酸乙酯);mp.136~138 ℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:5.35(1H,d,J= 5.2 Hz,H-6),3.52(1H,m,H-3α),1.00(3H,s,H-19),0.92(3H,d,J= 6.5 Hz,H-21),0.84(3H,t,J= 7.6 Hz,H-29),0.83(3H,d,J= 7.0 Hz,H-26),0.81(3H,d,J= 6.9 Hz,H-27),0.68(3H,s,H-18);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:140.9(C-5),121.8(C-6),71.9(C-3),56.9(C-14),56.2(C-17),50.2(C-9),45.9(C-24),42.4(C-4),42.4(C-13),39.9(C-12),37.4(C-1),36.6(C-10),36.2(C-20),34.0(C-22),32.0(C-7),32.0(C-8),31.7(C-2),29.3(C-25),28.3(C-16),26.2(C-23),24.4(C-15),23.2(C-28),21.2(C-11),19.9(C-27),19.5(C-19),19.1(C-21),18.9(C-26),12.1(C-29),11.9(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]基本一致,故化合物4鑒定為β-谷甾醇。
化合物5白色針晶(乙酸乙酯);mp.165~167 ℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:5.36(1H,br.d,J= 5.0 Hz,H-6),3.55(1H,m,H-3),0.69(3H,s,CH3-18),0.83(3H,s,CH3-19),0.91(3H,d,J= 6.0 Hz,H-21),5.13(1H,dd,J= 8.0,15.1 Hz,H-22),5.01(1H,dd,J= 8.0,15.1 Hz,H-23),0.84(3H,d,J= 6.3 Hz,CH3-26),0.79(3H,d,J= 5.5 Hz,CH3-27),0.81(3H,t,J= 7.4 Hz,CH3-29);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:141.0(C-5),138.5(C-22),129.6(C-23),121.9(C-6),72.1(C-3),57.1(C-14),50.4(C-9),57.0(C-17),51.5(C-24),42.6(C-13),42.5(C-20),40.6(C-4),40.0(C-12),37.5(C-1),36.8(C-10),32.2(C-7),32.2(C-8),32.0(C-2),31.9(C-25),29.1(C-16),25.6(C-28),24.6(C-15),21.4(C-27),21.2(C-11),20.2(C-21),19.6(C-19),19.2(C-26),12.5(C-29),12.3(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致,故鑒定化合物5為豆甾醇。
化合物6白色粉末;ESI-MS:m/z611 [M+H]+。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:2.76(1H,dd,J= 15.0,9.0 Hz,H-1′),1.67(1H,d,J= 15.0 Hz,H-1′),2.50(1H,m,H-2),5.14(1H,d,J= 8.6 Hz,H-3),5.39(1H,br s,H-5),5.14(1H,br s,H-7),4.52(1H,dd,J= 1.9,10.7 Hz,H-8),1.09(1H,dd,J= 9.0,10.9 Hz,H-9),1.02(1H,dd,J= 9.0,10.9 Hz,H-11),4.81(1H,dd,J= 3.4,10.9 Hz,H-12),2.86(1H,qd,J= 3.8,7.1 Hz,H-13),0.91(3H,d,J= 7.5 Hz,H-16),2.06(3H,dJ= 1.2 Hz,H-7),1.04(3H,s,H-18),0.81(3H,s,H-19),1.04(3H,d,J= 7.1 Hz,H-20),1.96,2.06,2.09(各 3H,s,3 × CH3COO),3.70(2H,br s,H-7′),7.26~7.33(5H,m,H-2′,6′,3′,5′,4′);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:207.7(C-14),170.5,170.8,170.4(3×CH3CO),170.3(C-8′),139.4(C-6),133.8(C-1′),129.3(C-3′,5′),128.6(C-2′,6′),127.2(C-4′),117.3(C-5),77.0(C-7),76.9(C-3),73.4(C-4),71.6(C-8),71.2(C-15),71.1(C-16),70.7(C-12),43.1(C-13),41.5(C-7′),31.5(C-1),29.8(C-2),29.6(C-11),29.2(C-18),24.7(C-9),20.7,21.0,21.1(3 × CH3CO),19.4(C-10),17.6(C-17),16.2(C-19),13.5(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]基本一致,故化合物6鑒定為Ingol 7,8,12-triacetate 3-phenylacetate。
化合物7黃色粉末;ESI-MSm/z:455 [M+Na]+,1H NMR(400 MHz,(CD3)2CO)δ:0.90(3H,d,J= 5.8 Hz,H-6″),3.86(1H,m,H-2″),3.69(1H,m,H-3″),3.30(2H,m,H-4″,5″),5.54(1H,d,J= 1.2 Hz,H-1″),6.27(1H,br s,H-6),6.47(1H,br s,H-8),6.91(2H,d,J= 8.4 Hz,H-3′,5′),7.80(2H,d,J= 8.4 Hz,H-2′,6′),12.72(1H,s,5-OH),4.20,3.86(各 1H,br s,7,4′-OH);13C NMR(100 MHz,(CD3)2CO)δ:179.3(C-4),164.9(C-7),163.2(C-5),161.0(C-4′),158.4(C-2),158.0(C-9),135.7(C-3),131.7(C-2′,6′),122.5(C-1′),116.3(C-3′,5′),105.8(C-10),102.6(C-1″),99.5(C-6),94.5(C-8),72.9(C-4″),72.1(C-2″),71.5(C-3″),71.3(C-5″),17.8(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]基本一致,故化合物7鑒定為山柰酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷。
化合物8白色粉末(氯仿-甲醇);1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:5.33(1H,s,H-6),4.42(1H,t,J= 5.8 Hz,H-3),4.22(1H,d,J= 7.8 Hz,H-1′),0.65(3H,s,CH3-18),0.95(3H,s,CH3-19),0.90(3H,d,J= 6.5 Hz,CH3-21),0.83(3H,t,J= 6.2 Hz,H-29),0.81(3H,d,J= 7.0 Hz,H-26),0.79(3H,d,J= 6.9 Hz,H-27);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:141.3(C-5),122.3(C-6),100.8(C-1′),79.0(C-3),56.2(C-14),55.4(C-17),49.6(C-9),45.1(C-24),41.9(C-13),39.3(C-4),38.2(C-12),36.8(C-1),36.2(C-10),35.5(C-20),33.4(C-22),31.5(C-8),31.4(C-7),29.3(C-2),28.7(C-25),27.8(C-16),25.4(C-23),23.9(C-15),22.6(C-28),20.6(C-11),19.8(C-27),19.1(C-26),18.9(C-19),18.6(C-21),11.8(C-29),11.7(C-18),73.5(C-2′),76.9(C-3′),70.1(C-4′),76.8(C-5′),61.1(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]基本一致,故化合物8鑒定為胡蘿卜苷。
化合物9白色粉末(甲醇);mp.266~267 ℃。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:7.85(1H,s,H-5′),7.66(1H,s,H-5),5.48(1H,d,J= 8.4 Hz,H-1′′),5.17(1H,d,J= 8.4 Hz,2′′-OH),5.08(1H,d,J= 5.3 Hz,4′′-OH),4.58(1H,t,J= 5.3 Hz,3′′-OH),4.10(3H,s,3-OCH3),4.05(3H,s,3′-OCH3),4.01(3H,s,4-OCH3),3.70(1H,m,H-2′′),3.52(1H,m,H-3′′),3.36(2H,m,H-4′′,5′′),3.24(2H,m,H-6′′);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:158.5(C-7′),158.2(C-7),154.4(C-4′),151.9(C-4),141.9(C-2′),141.3(C-3′),141.2(C-2),140.9(C-3),113.7(C-6′),112.9(C-1′),112.7(C-6),112.4(C-1),112.1(C-5),107.6(C-5′),101.3(C-1′′),77.3(C-3′′),76.5(C-5′′),73.3(C-2′′),69.5(C-4′′),61.7(3′-OCH3),61.4(3-OCH3),60.5(C-6′′),56.8(4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]基本一致,故化合物9鑒定為3,4,3′-三甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
化合物10黃色粉末;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:8.06(2H,d,J= 8.9 Hz,H-2′,6′),6.89(2H,d,J= 8.9 Hz,H-1′,5′),6.41(1H,d,J= 2.1 Hz,H-8),6.21(1H,d,J= 2.1 Hz,H-6),5.26(2H,d,J= 7.5 Hz,H-1″),3.69(1H,dd,J= 2.3,11.9 Hz,Hα-6″),3.53(1H,dd,J= 5.4,11.9 Hz,Hβ-6″),3.43(2H,m,H-2″,5″),3.19(2H,m,H-3″,4″);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:179.5(C-4),166.2(C-7),163.1(C-5),161.6(C-4′),159.1(C-2),158.6(C-9),135.4(C-3),132.3(C-2′,6′),122.8(C-1′),116.1(C-3′,5′),105.7(C-10),104.0(C-1″),99.9(C-6),94.8(C-8),78.5(C-5″),78.1(C-3″),75.7(C-2″),71.4(C-4″),62.6(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]基本一致,故化合物10鑒定為山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
部分化合物細(xì)胞毒性和抗炎活性結(jié)果如表1所示,化合物1、2、6、7、9和10在50 μM濃度下對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯毒性。化合物9抑制LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的IC50值為 12.0±0.9 μM, 顯示出了較強(qiáng)的抑制活性。化合物1、2、7和10的IC50值分別為28.0±1.6、30.8±2.0、38.4±2.1和33.5±1.7 μM,化合物6的IC50值大于50 μM。
表1 部分化合物的細(xì)胞毒性和抗炎活性Table 1 Cytotoxicity and anti-inflammatory activity of some compounds
本研究對(duì)彩云木的二氯甲烷-甲醇(1∶1)提取物的化學(xué)成分及其體外抗炎活性進(jìn)行了研究,從中分離鑒定了10個(gè)化合物,化合物類型主要包括三萜(2個(gè))、Ingol烷型二萜(1個(gè))、黃酮苷類(2個(gè))、甾醇及其苷類(3個(gè))、多酚類(1個(gè))和脂肪醇(1個(gè))。其中化合物3、6~10為首次從該種植物中分離得到,化合物3、6、8和9為首次從聚苞大戟屬植物中分離得到。
以脂多糖(LPS)誘導(dǎo) RAW264.7細(xì)胞為體外炎癥模型,通過(guò)抑制一氧化氮(NO)生成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)部分化合物抗炎活性,其中1、2、7和10具有較弱的抗炎活性,多酚類化合物9顯示出較好的抗炎活性,有潛力成為治療炎癥性相關(guān)疾病的新型藥物資源。該研究豐富了彩云木葉的化學(xué)成分,解析其抗炎活性物質(zhì)基礎(chǔ),為其藥物研發(fā)及利用提供了科學(xué)依據(jù)。
致謝:感謝埃及國(guó)家研究中心植物化學(xué)系Mohamed-Elamir F.Hegazy教授提供的植物原料及藥材提取工作。