HPLC法分析葉用芥菜種子中萊菔硫烷含量

蘭梅 楊紅麗 胡靖鋒

摘要：為了篩選富含萊菔硫烷的葉用芥菜材料，以20份葉用芥菜種子為試材，采用高效液相色譜法（HPLC）測定芥菜種子中的萊菔硫烷含量，分析不同品種之間的萊菔硫烷含量變化規(guī)律。結(jié)果表明，20份葉用芥菜材料種子中萊菔硫烷含量為11.79～226.72 mg/kg（DW），供試材料間萊菔硫烷含量差異達(dá)顯著水平，并獲得1份萊菔硫烷含量較高的材料（太樂四季青），含量為226.72 mg/kg（DW）;1份萊菔硫烷含量最低的材料（圓葉春菜），含量為11.79 mg/kg（DW），最高含量約是最低含量的19.2倍，是研究萊菔硫烷含量變化規(guī)律的優(yōu)良材料，也為下一步深入開展萊菔硫烷代謝機理研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：葉用芥菜;萊菔硫烷;高效液相色譜（HPLC）

中圖分類號：S637.2 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）17-0154-04

Abstract： In order to get the resources of leaf mustard with abundant sulforaphane，seeds of twenty cultivars were used to analyze and compare the ?contents of sulforaphaneby high performance liquid chromatography （HPLC）. The results showed that the range ofvariatoin of sulforaphane was 11.79～226.72 mg/kg（DW） with significant differences among tested lines. The material （Tai le sijiqing） with highest content of sulforaphane，which is 226.72 mg/kg （DW），was about 19.2 times compared with the lowest one （Spring cobbage with round leaves） which is 11.79 mg/kg （DW）. It provides an foundational material for further research on rule of variation and the mechanism of metabolism of sulforaphan.

Key words： leaf mustard; sulforaphane; high performance liquid chromatography （HPLC）

葉用芥菜（Brassica juncea Coss. var. foliosa Bailey）原產(chǎn)中國，簡稱葉芥菜，別名青菜、臘菜、春菜，是十字花科蕓薹屬芥菜種中以葉或葉球為產(chǎn)品的變種。喜冷涼濕潤氣候，適應(yīng)性較強，品種繁多，長江流域以南的地區(qū)栽培較為普遍[1]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常食用十字花科的蔬菜，可以降低癌癥發(fā)生幾率[2]。十字花科蔬菜化學(xué)防癌效果主要歸功于異硫氰酸酯（Isothiocyanates）強有力的防癌、抗癌功能[3]。而萊菔硫烷（sulforaphane，SF）是異硫氰酸酯類物質(zhì)中生物學(xué)活性最強的物質(zhì)[4]，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，萊菔硫烷能夠預(yù)防肺癌[5]、乳腺癌[6]、肝癌[7]、結(jié)腸癌[8]、胃癌[9]等疾病的發(fā)生;同時對治愈心腦血管疾病和近視也有一定的效果[10，11]。在抗癌新藥開發(fā)與流行病學(xué)研究方面具有重要的社會價值與科研價值[12]。因此，挖掘富含萊菔硫烷的葉用芥菜資源，為選育芥菜抗癌新品種及研究萊菔硫烷活性提供材料和依據(jù)。

萊菔硫烷又稱蘿卜硫素，是硫苷中的4-甲亞磺?；』蜻埃℅lucoraphane，GRA）[13]與黑芥子酶發(fā)生水解反應(yīng)的次生代謝產(chǎn)物[12]，該物質(zhì)是蔬菜中發(fā)現(xiàn)的抗癌活性較強的有效成分之一[14]。萊菔硫烷的檢測方法有氣相色譜（GC）、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）[13]和高效液相色譜（HPLC）[15，16]。有關(guān)十字花科植物中萊菔硫烷的含量測定已有文獻(xiàn)報道[3，17]。當(dāng)前對萊菔硫烷的報道多集中在青花菜上，何洪巨等[18]、夏薇等[19]、Liang等[20]、張嬋娟等[21]都證實了青花菜富含萊菔硫烷成分，并且分布在不同的營養(yǎng)器官中，如花球、莖和種子等，采用的檢測方法主要為高效液相色譜法（HPLC）[12]。李占省等[22]對29份青花菜和48份甘藍(lán)的不同器官中萊菔硫烷含量進(jìn)行了HPLC分析，發(fā)現(xiàn)花球、葉片和幼莖中的萊菔硫烷含量存在明顯差異，花球中的含量最高。李占省等[12]對23份芥藍(lán)純合自交系和21份雜交F1材料花薹中的萊菔硫烷含量進(jìn)行了測定，不同材料中萊菔硫烷含量差異較大。王麗紅等[23]對十字花科植物光果葶藶中的萊菔硫烷含量進(jìn)行了測定，并優(yōu)化了HPLC法檢測光果葶藶中萊菔硫烷含量的方法。對芥菜種子中萊菔硫烷含量的研究未見報道，本試驗以20份葉用芥菜高代純合自交系種子為材料，利用HPLC法測定其萊菔硫烷含量，旨在篩選出萊菔硫烷含量較高的葉用芥菜材料，為選育新品種及材料創(chuàng)新提供依據(jù)，為進(jìn)一步滿足人們的多樣化需求奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

安捷倫高效液相色譜儀系統(tǒng)（美國安捷倫公司）：Agilent 1100 四元泵;Agilent 柱溫箱;Agilent 色譜數(shù)據(jù)工作站;Agilent 二極管陣列紫外檢測器。超聲波清洗機 （昆山市超聲儀器有限公司）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA）。

萊菔硫烷對照品（美國LKTTM，純度≥98%），乙腈（色譜級），乙酸乙酯（分析純），磷酸（優(yōu)級純），0.22 μm孔徑的微孔濾膜 （上海興亞公司）。

1.2 材料

試驗所用材料由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所十字花科課題組提供，具體信息見表1。

1.3 方法

1.3.1 試樣制備 分別準(zhǔn)確稱取0.20 g種子研磨成粉末狀，置于通風(fēng)櫥內(nèi)干燥（干燥后的樣品避免受潮，用自封袋密封保存且放置于干燥低溫環(huán)境中），分別加入6.0 mL pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀），磁力攪拌器下反應(yīng) ? 2.0 h（室溫）后加入6 mL的乙酸乙酯（AR）混勻30 min后，4 000 r/min下離心10 min，收集上清液;再重復(fù)提取2次，收集3次的萃取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，旋蒸溫度為35 ℃，最后用6 mL乙腈定容，過0.22 μm濾膜后-20 ℃低溫保存待測。

1.3.2 色譜條件 采用安捷倫系列高效液相色譜儀，反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流速1 mL/min;進(jìn)樣量20.0 μL;梯度洗脫法測定，流動相A泵為純水液，B泵為100%的乙腈，梯度程序見表2。

1.3.3 線性方程、精密度、回收率

1）線性方程。以萊菔硫烷標(biāo)準(zhǔn)液（575 [μ]g/mL）配制成57.5、28.8、14.4、7.2、3.6、1.8 [μ]g/mL稱釋液分別進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程。

2）精密度測定。吸取濃度為14.4 μg/mL的萊菔硫烷溶液，反復(fù)進(jìn)樣測定6次（n=6），根據(jù)測得的峰面積計算精密度。

3）回收率測定。準(zhǔn)確稱取已知含量的芥菜種子樣品，分別加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照前述的試樣制備方法測定前后濃度，測定回收率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件和SPSS軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗（one-way ANOVA），數(shù)據(jù)用平均值（Mean）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

量取57.5、28.8、14.4、7.2、3.6、1.8 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋溶液，以20 μL進(jìn)樣，以峰面積（Y）對濃度（X）進(jìn)行回歸分析，得線性回歸方程Y=0.000 8X+1.132 9，R2=0.998 6，表明萊菔硫烷的濃度在1.8～57.5 μg/mL與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2 精密度與回收率

2.2.1 精密度 芥菜種子樣品和萊菔硫烷標(biāo)準(zhǔn)品的目標(biāo)峰保留時間基本一致，目標(biāo)峰不受雜質(zhì)干擾（圖1和圖2），表明該法能夠準(zhǔn)確檢測出萊菔硫烷成分。吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，反復(fù)進(jìn)樣測定6次，根據(jù)測得的標(biāo)準(zhǔn)品各成分峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.17%，表明精密度良好（表3）。

2.2.2 回收率 在“1.3.2”色譜條件下測定萊菔硫烷的含量，樣品的加樣回收率較高，平均回收率為97.13%（表4），RSD為1.08%。

2.3 芥菜種子中萊菔硫烷含量

從表5可以看出，20份芥菜材料種子中均檢測到萊菔硫烷成分，供試材料間萊菔硫烷含量差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義，且變化幅度較大。其含量為11.79～226.72 mg/kg（DW），其中14號材料含量最高，平均含量達(dá)到了226.72 mg/kg（DW）;其次是13號材料，平均含量為131.21 mg/kg（DW）;含量最低的是20號材料，平均含量為11.79 mg/kg（DW）;最高含量（14）是最低含量（20）的19.2倍，14號材料可作為高萊菔硫烷含量材料加以利用，進(jìn)行新品種選育骨干親本材料，也可作為抗癌芥菜新品種進(jìn)行開發(fā)利用。

3 討論

研究對20份葉用芥菜種子中的萊菔硫烷含量進(jìn)行了HPLC分析，20份材料中都檢測出了萊菔硫烷成分，并且品種之間的萊菔硫烷含量差異較大，得到了萊菔硫烷含量較高的材料，為高萊菔硫烷葉用芥菜新品種的選育與利用提供了材料。同時，本研究揭示了葉用芥菜在萊菔硫烷含量方面具有豐富的變化，是研究萊菔硫烷含量變化規(guī)律的優(yōu)良材料，也為深入開展萊菔硫烷代謝機理研究奠定了基礎(chǔ)。

目前，關(guān)于萊菔硫烷的研究多集中在青花菜、甘藍(lán)、芥藍(lán)等十字花科作物的研究上，李占省等[23]對甘藍(lán)和青花菜不同器官中萊菔硫烷含量差異進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，不同甘藍(lán)和青花菜基因型間萊菔硫烷含量差異顯著，青花菜同一基因型不同器官中萊菔硫烷含量差異較大。李占省等[12]對芥藍(lán)花薹中萊菔硫烷含量進(jìn)行了HPLC分析，從44份芥藍(lán)材料中獲得了1份萊菔硫烷含量較高的F1材料，3份萊菔硫烷含量較高的高代純合自交系材料。但是在芥菜上關(guān)于萊菔硫烷的研究還未見報道，本研究將為芥菜在萊菔硫烷上的研究奠定一定的基礎(chǔ)。

有研究表明，萊菔硫烷及其前體RAA生成量與基因型緊密相關(guān)，Brown等[24]、Im等[25]和Farnham等[26]研究表明，基因型、基因型與環(huán)境的互作、環(huán)境均能影響RAA的生成量，其中基因型占總效應(yīng)的50%～60%。Abercrombie等[27]、邱海榮等[28]和謝祝捷等[29]均推斷萊菔硫烷及其前體RAA的合成主要受基因型調(diào)控，取樣時期和基因型與環(huán)境的互作也能顯著影響萊菔硫烷的變化。但是在芥菜中關(guān)于這方面的研究也未見報道，這也為下一步的研究提供了思路。

試驗對20份葉用芥菜種子中的萊菔硫烷含量進(jìn)行了測定，不同品種的芥菜種子中萊菔硫烷含量有明顯差別，得到了1份萊菔硫烷含量較高的葉用芥菜材料，可考慮作為富含萊菔硫烷芥菜品種加以利用，豐富市場品種，也可作為抗癌芥菜親本材料培育新品種。對芥菜中萊菔硫烷的遺傳代謝機理進(jìn)行研究，將有助于篩選出富含萊菔硫烷的芥菜新材料和抗癌新品種，但這方面尚待深入研究。

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