超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定食品中4種減肥類非法添加藥物

朱 呂 陸春燕 厲晨皓 賀慧琳 劉 俊

(平湖市食品藥品檢測(cè)中心， 平湖 314200)

雙醋酚汀、比沙可啶、酚酞和脫乙酰比沙可啶均為臨床上經(jīng)常使用的緩瀉劑。雙醋酚汀在腸道內(nèi)遇堿性腸液，被分解為酚汀及醋酸，酚汀能腸壁引起蛹動(dòng)，而發(fā)揮導(dǎo)瀉作用。比沙可啶是一種于1952年就在國外上市的緩瀉劑，2010年比沙可啶及其片劑已被《中國藥典》收載[1]，它主要通過直接接觸腸黏膜并刺激其感覺神經(jīng)末梢而增強(qiáng)腸反射性蠕動(dòng)，促進(jìn)排便。近年來部分臨床醫(yī)生發(fā)現(xiàn)長期大量口服比沙可啶副作用較大，尤其是對(duì)結(jié)腸的刺激或損傷作用，在人結(jié)腸測(cè)壓中發(fā)現(xiàn)比沙可啶可引發(fā)高振幅推進(jìn)性收縮，導(dǎo)致部分臨床工作者對(duì)比沙可啶的臨床應(yīng)用存在一定的質(zhì)疑[2，3]。酚酞也是一種致瀉藥，能直接刺激腸黏膜或活化腸內(nèi)平滑肌的神經(jīng)末梢而增加腸的推進(jìn)力，因產(chǎn)生過度緩瀉而導(dǎo)致體液與電解質(zhì)障礙，使血糖升高，血鉀降低，造成電解質(zhì)紊亂，誘發(fā)心律失常、神志不清、肌痙攣以及倦怠無力等癥狀，另外，長期使用可損害腸神經(jīng)系統(tǒng)，且很可能是不可逆的[4，5]。雙醋酚汀、比沙可啶、酚酞和脫乙酰比沙可啶4種化學(xué)藥物的結(jié)構(gòu)式如圖1～4。

圖1 雙醋酚汀結(jié)構(gòu)式

圖2 比沙可啶結(jié)構(gòu)式

圖3 酚酞結(jié)構(gòu)式

圖4 脫乙酰比沙可啶結(jié)構(gòu)式

近年來，一些所謂的健康無添加的減肥產(chǎn)品以日常食品為載體，大肆宣稱具有較好的減肥功效，受到愛美人士的追捧。然而，這其實(shí)是一些不良商家在食品中非法添加了致瀉類化學(xué)藥物，通過致瀉達(dá)到減肥目的。有文獻(xiàn)報(bào)道，有成千上萬的人是輕瀉劑成癮者。用藥者往往頻繁和持續(xù)使用，一旦停用，便秘便會(huì)變本加厲嚴(yán)重者甚至造成人體器官衰竭[6，7]。不良商家為了逃避打擊，已很少在食品中添加國家明令禁用的化學(xué)藥物(如西布曲明、芬氟拉明等)，轉(zhuǎn)而在食品中非法添加雙醋酚汀、比沙可啶、酚酞和脫乙酰比沙可啶等緩瀉劑。除酚酞在食品中的檢測(cè)有相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)外[8]，其他3種緩瀉劑均無相應(yīng)的食品檢測(cè)方法和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道主要是藥物片劑分析、人體藥物代謝、藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)等[ 9-11]。

目前用于減肥類食品中非法添加藥物的檢測(cè)方法主要有液相色譜法[12，13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-16]、拉曼光譜法[17]等。 其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因具有高選擇性、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)在食品中非法添加藥物的定性及定量分析中獲得了廣泛的運(yùn)用。本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化提取過程、凈化過程和檢測(cè)參數(shù)建立了一種簡(jiǎn)便可靠、可操作性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高的檢測(cè)方法，可用于同時(shí)測(cè)定食品中雙醋酚汀、比沙可啶、酚酞、脫乙酰比沙可啶的非法添加。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙醋酚汀、比沙可啶、酚酞、脫乙酰比沙可啶標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98.0 %)：德國Dr.Ehrenstorfer；甲醇、乙腈(色譜純)：美國Thermo Fisher公司；氯化鈉(分析純)：國藥集團(tuán)；HLB固相萃取柱(3 mL/60 mg)、PSA固相萃取柱(3 mL/60 mg)：美國Waters公司；C18固相萃取柱(3 mL/60 mg)：深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司；Alumina-N固相萃取柱(3 mL/200 mg)：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；有機(jī)微孔濾膜(0.22 μm)：天津Agela Technologies公司；超純水：實(shí)驗(yàn)室自制。

Waters Xevo TQ-S高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國，Waters公司；T25高速均質(zhì)機(jī)：德國，IKA公司；MS204S、PL602-L 電子天平：瑞士，梅特勒-托利多公司；H2050R-1高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；Milli-Q Advatantage A10超純水機(jī)：法國，Merck Millipore公司；KQ3200超聲波清洗器：昆山市超聲波儀器有限公司；K600多功能食品粉碎機(jī)：德國， BRAUN公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取雙醋酚汀、比沙可啶、酚酞、脫乙酰比沙可啶4種化學(xué)藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各5.0 mg，用乙腈溶解并定容至10 mL，配制成濃度為500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液，4 ℃避光儲(chǔ)存。分別吸取0.5 mL雙醋酚汀、比沙可啶、酚酞、脫乙酰比沙可啶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至50 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成5.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。臨用時(shí)用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋至1.0、5.0、20.0、50.0、200.0、350.0、500.0 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液。

1.3色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC?BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)，流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：20mmol/L甲酸銨溶液；流速：0.5mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；柱溫：40℃。液相色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正離子掃描(ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring , MRM)；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：450 ℃；脫溶劑氮?dú)饬魉伲?50 L/h；毛細(xì)管電壓：3 kV。在電噴霧正離子模式下分別對(duì)500 ng/mL的單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描，通過優(yōu)化離子源、離子管溫度和輔助氣流量等參數(shù)是母離子響應(yīng)達(dá)到最優(yōu)值，并優(yōu)化得到每個(gè)化學(xué)藥物的母離子和子離子所需的最佳去簇電壓和碰撞能量，最后以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行掃描，選擇離子信號(hào)前兩強(qiáng)分別作為定性和定量離子。具體質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 4種化學(xué)藥物的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

1.5 樣品前處理

稱取粉碎均勻的固體樣品0.5 g(液體樣品1.0 g)于15 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋混勻樣品，超聲提取10 min。加入1.5 g干燥后的氯化鈉，渦旋2 min，8000 r/min離心5 min。準(zhǔn)確移取乙腈層5 mL，氮?dú)獯抵良s0.5 mL后加入5 mL水渦旋混勻，待固相萃取凈化。

將C18固相萃取小柱安裝至固相萃取裝置上，依次用3 mL甲醇和3 mL水活化固相萃取小柱，將待凈化的樣品回溶液加入小柱，流盡后用5 %甲醇水溶液淋洗小柱，吹干，最后用5 mL 80%甲醇水洗脫，收集全部洗脫液于5 mL容量瓶中，甲醇水定容至刻度線，定溶液用0.22 μm有機(jī)微孔濾膜后上質(zhì)譜測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本研究分別采用了甲醇水溶液、乙腈水溶液、0.1%甲酸水-甲醇溶液、0.1%甲酸水-乙腈溶液和20 mmol/L甲酸銨水-乙腈溶液5種流動(dòng)相體系進(jìn)行色譜分析。通過對(duì)分離效果的綜合評(píng)價(jià)，采用20 mmol/L甲酸銨水-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，各組分化學(xué)藥物的離子化效率高，分離度、峰型好，響應(yīng)值高，各組分化學(xué)藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 ng/mL)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖見圖5。

圖5 雙醋酚汀、比沙可啶、酚酞、脫乙酰比沙可啶質(zhì)譜圖

2.2 提取方法的優(yōu)化

本研究對(duì)比分別使用甲醇、乙腈作為提取溶劑時(shí)的提取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種溶劑對(duì)目標(biāo)化學(xué)藥物的提取效率無明顯差異，但是在處理液體樣品時(shí)加入鹽離心后，乙腈能夠有效的分離水相和有機(jī)相，故最終選擇乙腈作為提取溶劑。

本研究考察了氮吹回溶待凈化液中不同乙腈濃度對(duì)4種目標(biāo)化學(xué)藥物回收率的影響。結(jié)果如圖6所示，待凈化液中乙腈含量在不超過10 %時(shí)，對(duì)待測(cè)各組分回收率無明顯影響，故樣品前處理時(shí)采取移取乙腈層5 mL，氮吹至約0.5 mL后加入5 mL水渦旋混勻成待凈化液。

2.3 凈化方法的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)研究了Alumina-N固相萃取柱、PSA固相萃取柱、HLB固相萃取柱和C18固相萃取柱對(duì)雙醋酚汀、比沙可啶、酚酞、脫乙酰比沙可啶回收率的影響。如表3所示， 采用Alumina-N和PSA固相萃取柱時(shí)，雙醋酚汀和比沙可啶回收率大于60 %，酚酞、脫乙酰比沙可啶均小于40 %；采用C18和HLB固相萃取柱時(shí)，4種化學(xué)藥物的均回收率大于70%，相比較C18固相萃取柱穩(wěn)定性和精密度比HLB固相萃取柱好，故選擇C18固相萃取柱作為本實(shí)驗(yàn)的凈化柱。

圖6 凈化液中乙腈濃度對(duì)4種化學(xué)藥物(50 ng/mL)回收率的影響

表3 4種固相萃取柱的凈化回收率(n=3)

本實(shí)驗(yàn)考察了以C18固相萃取柱作為凈化小柱時(shí)不同濃度甲醇水溶液作為洗脫液時(shí)的洗脫效果。將4種目標(biāo)化學(xué)藥物的水溶液上樣，然后分別用濃度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 的甲醇水溶液洗脫，洗脫液質(zhì)譜測(cè)定，分析不同濃度甲醇水溶液條件下各目標(biāo)化學(xué)藥物的洗脫效果(見圖7)。結(jié)果表明，當(dāng)以80%甲醇水溶液為洗脫溶劑時(shí)，目標(biāo)化學(xué)藥物均能夠完全被洗脫。因此選擇80%甲醇水溶液作為固相萃取時(shí)的洗脫溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

在1.3和1.4中確定的色譜條件和質(zhì)譜條件下，取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液用流動(dòng)相配制1.0、5.0、20.0、50.0、200.0、350.0、500.0 ng/mL系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，以各組分的質(zhì)量溶度(x)為橫坐標(biāo)，定量離子的峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各組分的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r2)。如表4所示，4種化學(xué)藥物的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，表明各組分在1.0 ～ 500.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)均具有良好線性關(guān)系。在空白的樣品中添加適量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.5方法進(jìn)行樣品前處理后質(zhì)譜檢測(cè)，以3倍信噪比(S/N)計(jì)算方法檢出限(limits of quantification, LOD)，結(jié)果見表4。

圖7 洗脫液中甲醇濃度對(duì)4種化學(xué)藥物(50 ng/mL)回收率的影響

表4 4種化學(xué)藥物的曲線方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.5 添加回收率與精密度

稱取空白固體樣品0.5 g(液體樣品1.0 g)若干份，分別添加10.0、100.0、1000.0 μg/kg 3個(gè)不同水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液， 按照1.5的樣品前處理的方法進(jìn)行前處理，在優(yōu)化好的色譜、質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，計(jì)算方法的回收率和精密度。如表5所示，各組分化學(xué)藥物的加標(biāo)回收率在79.2%～111.8%之間，精密度(RSD)為0.21%～13.3%，表明本研究建立的測(cè)定方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，可以滿足檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)分析需求。

表5 4種化學(xué)藥物的平均回收率和精密度(n=6)

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)市售宣稱具有減肥功效的食品及保健食品進(jìn)行檢測(cè)，其中包括固體飲料、酵素類飲料、代餐粉、果脯類、蜜餞類等共計(jì)25批次。結(jié)果顯示，在25批次樣品中1批次檢出酚酞成分，2批次檢出雙醋酚汀和脫乙酰比沙可啶。

3 結(jié)論

建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定食品中雙醋酚汀、比沙可啶、酚酞和脫乙酰比沙可啶4種非法添加化學(xué)藥物的分析檢測(cè)方法。該方法前處理操作簡(jiǎn)便，對(duì)不同食品基質(zhì)凈化效果好，靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度高，回收率穩(wěn)定，可用于食品中非法添加化學(xué)藥物的檢測(cè)工作提供有力技術(shù)支持，為打擊食品中非法添加減肥類化學(xué)藥物行為提供有力依據(jù)，保證消費(fèi)者的合法利益。