大球蓋菇多糖對大鼠運動疲勞恢復(fù)的影響*

邵 華

（西南政法大學(xué)，重慶 401100）

大球蓋菇（Stropharia rugoso-annulata），別名皺環(huán)球蓋菇、酒紅色球蓋菇或斐氏球蓋菇，是一種珍稀的食用菌。大球蓋菇口感極佳，顏色誘人，富含多種對人體有益的礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素以及多糖[1]，因此其食用價值和藥用價值是毋庸置疑的，開發(fā)潛力非常巨大。聯(lián)合國糧農(nóng)組織為了扶持發(fā)展中國家的經(jīng)濟發(fā)展，推薦了大批具備經(jīng)濟收益的食用菌栽培品種，大球蓋菇就是其中之一[2]。大球蓋菇中的多糖成分對增強機體免疫能力有非常重要的作用，并且可有效作用于病毒、腫瘤等疾病以及消化不良、精神疲勞等方面的治療[3]。相關(guān)學(xué)者研究表明，大球蓋菇多糖的濃度決定了其對大鼠干線粒體腫脹的抑制功效[4-5]。本研究通過建立大鼠高強度運動模型，探討大球蓋菇多糖對大鼠脾臟相關(guān)細(xì)胞因子、T淋巴細(xì)胞亞群、體重及脾臟指數(shù)差異的影響，為其在運動保健過程中的作用提供一定的理論依據(jù)。

1 大球蓋菇多糖的提取過程

1.1 試劑

大球蓋菇多糖提取所需試劑主要有：95%乙醇、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖、標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖、三氯甲烷、福林一酚試劑、Sephadex G-100、正丁醇、DEAE-Sephadex A-50、Sevag試劑。

1.2 儀器

大球蓋菇多糖提取所需的儀器主要有電熱恒溫水浴鍋，上海赫田科學(xué)儀器有限公司；透析袋，索萊寶科技有限公司；梯度混合儀，上海嘉鵬科技有限公司；常速離心器，普若邁德；恒流泵，天利流體工業(yè)設(shè)備廠；BS-160A型自動部分收集器，上海金鵬分析儀器有限公司；722型可見分光光度計，上海精科實業(yè)有限公司等。

2 提取以及制備方法

2.1 提取方法

將定量的大球蓋菇子實體粉末經(jīng)過沉淀后在恒溫水浴鍋中提取出來，將這一過程重復(fù)操作3次，提取溫度、醇析濃度、物料比設(shè)計各不相同，將多種條件下提取出的物質(zhì)離心混合上清液，濃縮成型，用丙酮和乙醇將其清洗兩次然后烘干，便形成了大球蓋菇多糖[5]。

2.2 制備方法

稱取100 g大球蓋菇子實體粉末，加入蒸餾水1 000 mL，在沸水中浸泡1 h，在4 000 r·min-1離心條件下保持15 min，提取上清液，在殘渣中加入蒸餾水500 mL，在沸水中浸泡1 h，在4 000 r·min-1離心力條件下保持15 min，提取上清液，再次提取殘渣，上清液在合并3次以后濃縮體積在250 mL，加入1 000 mL 95%乙醇靜置一夜。離心后先用80%乙醇清洗3遍，用丙酮再次清洗2遍，烘干以后便是大球蓋菇多糖樣品。

在粗多糖樣品中多次加入80 mL蒸餾水將其溶解，采用seveg法將蛋白脫離出來，做流水透析24 h，再次加入新的蒸餾水透析12 h，然后加入1 000 mL 95%乙醇沉淀出多糖，離心后將沉淀物烘干并稱重，并形成了大球蓋菇精制多糖[6]。

3 大球蓋菇多糖對運動疲勞恢復(fù)的影響研究試驗

3.1 試驗對象

試驗所需SD大鼠30只，周齡為8周，無疾病，體重差不超過20 g。這些大鼠均來自河南省實驗動物中心。大鼠進入試驗室之后飼養(yǎng)1周方可用于試驗，飼養(yǎng)溫度為26℃左右，相對濕度為45%～65%。將30只大鼠按照體重的不同平均分為3組，每組10只，分別是對照組、運動干預(yù)組、運動給藥組。

3.2 大球蓋菇多糖制備方法

試驗所用的大球蓋菇均為優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品，統(tǒng)一在河南虞城縣聞集鄉(xiāng)金隆食用菌栽培基地購買，按照試驗要求清洗之后烘干備用。試驗的大球蓋菇多糖提取選用傳統(tǒng)水提法，試驗開展前期的預(yù)備試驗已經(jīng)確定提取工藝，其中料液比為1∶25，溫度為90℃，共提取2次，時長為4 h，離心提取上清液，采用Sevag法脫離蛋白，離心之后獲取的大球蓋菇粗多糖加入乙醇沉淀，在真空條件下冷凍直至干燥形成大球蓋菇多糖干粉，并測定其糖含量[7]。

3.3 試劑及儀器

試驗采用的試劑主要有南京建成生物工程研究所研發(fā)的PE-CD8+、FITGCD4+、Percp-CD3+抗大鼠單克隆抗體和IL-10、IFN-γ、TNF-a、IL-6試劑盒；由美國CST公司生產(chǎn)的p-p38MAPK山羊抗兔試劑盒和p-p38MAPK兔多抗試劑盒。

試驗采用的儀器主要有：FSH-2高速電動勻漿機，北京瑞麗分析儀器公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；ZH-PT動物實驗跑臺，淮北正華生物儀器設(shè)備公司；FACSCo unt流式細(xì)胞儀，美國BD公司；電泳儀及iMARK酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司；H2050R臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)公司；Ue1Doc EZ凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

3.4 運動方案及給藥方案制定

3.4.1 運動方案

對照組大鼠無需進行日常運動訓(xùn)練，常規(guī)喂養(yǎng)。運動干預(yù)組和運動給藥組大鼠均進行9周的運動訓(xùn)練，每周運動6 d。大鼠在第7周要接受力竭訓(xùn)練。大鼠出現(xiàn)呼吸急促，俯臥垂頭，跑速無法達到預(yù)期，長時間處在跑臺尾部位置，通過聲波和機械刺激無效說明大鼠力竭。

3.4.2 給藥方案

運動給藥組大鼠按照體重比例在運動開始前2 h灌胃給藥大球蓋菇多糖懸液；對照組大鼠和運動干預(yù)組大鼠則用蒸餾水替代大球蓋菇多糖懸液，為期9周的試驗每日給藥1次。

3.5 指標(biāo)測定及方法

3.5.1 大鼠脾臟指數(shù)及細(xì)胞因子測定

1）脾臟指數(shù)：大鼠在接受最后1次運動訓(xùn)練之后，將大鼠麻醉。為大鼠稱體重之后，將大鼠的肝臟取出稱其重量，按照公式計算出脾臟指數(shù)。

2） 細(xì)胞因子：稱重之后的大鼠脾臟研磨成粉末，加入一定量的細(xì)胞裂解液；離心之后提取細(xì)胞懸液，將其倒入24孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板中，平均每孔500 μL，放入CO2培養(yǎng)箱中48 h；然后離心10 min獲取上清液，將上清液冷藏于-20℃的冰箱。通過雙抗體夾心EIISA法分別測定大鼠脾臟中所含的IL-10、IFN-γ、TNF-a、IL-6量，操作過程參照試劑盒說明書。

4 試驗結(jié)果與分析

4.1 大鼠體重及脾臟指數(shù)差異

各組大鼠體重及脾臟指數(shù)對比情況見表1。

表1 各組大鼠體重及脾臟指數(shù)對比情況Tab.1 Comparison of body weight and spleen index of rats in each group

從表1可以看出，大鼠在經(jīng)過9周的跑臺運動后，對照組與運動干預(yù)組大鼠的體重及脾臟指數(shù)相比，運動干預(yù)組下降明顯；運動給藥組與運動干預(yù)組大鼠的體重及脾臟指數(shù)相比，運動干預(yù)組下降明顯。說明運動給藥組大鼠情況良好。

4.2 大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群差異

各組大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群的對比情況見表2。

表2 各組大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群的對比情況Tab.2 Comparison of T lymphocyte subsets in spleen of rats in each group

從表2中可以看出，對照組和運動給藥組的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+相比，運動干預(yù)組降低幅度大；運動干預(yù)組和運動給藥組的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+相比，運動干預(yù)組降低幅度大。說明運動給藥組大鼠情況良好。

4.3 大鼠脾臟細(xì)胞因子差異

各組大鼠脾臟細(xì)胞因子變化情況見表3。

表3 各組大鼠脾臟細(xì)胞因子變化情況Tab.3 Changes of cytokines in spleen of rats in each group

從表3可以看出，對比3組大鼠脾臟IL-10、IFN-γ、TNF-a、IL-6含量發(fā)現(xiàn)，運動干預(yù)組大鼠IL-10含量明顯降低，IFN-γ、TNF-a、IL-6含量明顯升高，表明運動干預(yù)組大鼠的運動免疫系統(tǒng)出現(xiàn)紊亂；運動給藥組大鼠在服用大球蓋菇多糖之后，與運動干預(yù)組相比IFN-γ、TNF-a、IL-6含量明顯偏低，IL-10含量明顯升高，且差異顯著，這就表示大球蓋菇多糖對高強度運動訓(xùn)練大鼠的脾臟免疫系統(tǒng)有很好的保護作用[8]。

5 討論

脾臟是細(xì)胞免疫因子的主要聚集場所，他們控制分泌并發(fā)揮作用，可有效調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)，控制機體炎癥發(fā)生[9]。細(xì)胞因子作用于免疫系統(tǒng)時，分為兩個類別，分別是促炎因子和抗炎因子。促炎因子中主要有IFN-γ、TNF-a、IL-6等，可以增強炎性的發(fā)生，對機體的免疫系統(tǒng)造成損傷；抗炎因子主要有IL-4、IL-10等，可以有效抑制炎性的發(fā)生，形成對機體免疫系統(tǒng)的保護屏障[10]。相關(guān)研究結(jié)果顯示，長期高強度運動后機體的促炎因子更加活躍，抗炎因子受到限制，對機體免疫系統(tǒng)會造成損害[11]。本試驗研究表明，大球蓋菇多糖對運動大鼠脾臟促炎因子IFN-γ、TNF-a、IL-6有抑制作用，對抗炎因子IL-10有促進作用?？梢杂行д{(diào)節(jié)和保護大鼠免疫系統(tǒng)的平衡。

機體免疫功能還有一個重要指標(biāo)就是T淋巴細(xì)胞，長期高強度運動也會對T淋巴細(xì)胞中的CD3+、CD4+、CD8+等細(xì)胞造成影響。CD3+、CD4+、CD8+對機體產(chǎn)生的作用各不相同，共同維護機體免疫功能，CD4+/CD8+比值是顯示機體免疫功能是否正常運轉(zhuǎn)的指標(biāo)[12]。有相關(guān)研究就高強度運動對T淋巴細(xì)胞的影響做出說明，高強度運動影響脾臟健康最終導(dǎo)致淋巴細(xì)胞分泌不足[13]。此次研究中運動給藥組大鼠在服用大球蓋菇多糖之后，CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8均優(yōu)于運動干預(yù)組，說明大球蓋菇多糖可有效保護脾臟健康，維護T淋巴細(xì)胞分泌。

研究結(jié)果表明，大球蓋菇多糖可有效作用于高強度運動訓(xùn)練大鼠的脾臟健康，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)平衡，也就說明大球蓋菇多糖對運動疲勞恢復(fù)有積極作用。