綜合放血法所致血虛證小鼠模型的比較研究

胡柳 韓銓 吳妍 王威 李棟

[摘要]目的 通過(guò)比較不同造模參數(shù)的綜合放血方法，確定血虛模型的最優(yōu)造模參數(shù)，為該方法的可重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)化提供數(shù)據(jù)支持。方法 將100只ICR小鼠隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組（n=20）、模型組A（每日游泳15 min+隔日放血0.3 ml，n=20）、模型組B（每日游泳10 min+隔日放血0.3 ml，n=20），模型組C（每日游泳15 min+隔日放血0.5 ml，n=20）以及模型組D（每日游泳10 min+隔日放血0.5 ml，n=20），造模9 d后取胸腺、脾臟以及血液，測(cè)定5組小鼠的體重、免疫器官指數(shù)、死亡率、血常規(guī)指標(biāo)、血清免疫因子白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平及紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性。結(jié)果 模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后的體重、免疫器官指數(shù)、血常規(guī)指標(biāo)（紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白和血小板）、血清IL-6水平和紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性均低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;模型組B小鼠造模9 d后的死亡率低于模型組A、C和D，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 每日游泳10 min+隔日放血0.3 ml為較優(yōu)的中醫(yī)血虛證候模型的造模參數(shù)。

[關(guān)鍵詞]綜合放血法;血虛證;中醫(yī)證候模型

[中圖分類(lèi)號(hào)] R332? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2020）9（b）-0035-04

Comparative study of mouse model of blood deficiency pattern caused by comprehensive bloodletting

HU Liu? ?HAN Quan? ?WU Yan? ?WANG Wei? ?LI Dong

Zhejiang Yangshengtang Natural Medicine Research Institute Co. Ltd.， Zhejiang Province， Hangzhou? ?310024， China

[Abstract] Objective To compare the comprehensive bloodletting in different modeling parameters to determine the optimal one with blood deficiency pattern， and to provide data support for the repeatable standardization of the method. Methods A total of 100 ICR mice were randomly divided into 5 groups： normal control group （n=20）， model group A （15 min swimming daily+bloodletting 0.3 ml every other day， n=20）， model group B （10 min swimming daily+bloodletting 0.3 ml every other day， n=20）， model group C （15 min swimming daily+bloodletting 0.5 ml every other day， n=20） and model group D （10 min swimming daily+bloodletting 0.5 ml every other day， n=20）. Thymus， spleen and blood were collected for measuring the weight， immune organ index， blood routine indicators （including red blood cells， leukocytes， hemoglobin and platelets）， serum interleukin-6 （IL-6） levels and erythrocyte membrane Na+-K+-ATPase activity after nine days model establishment. Results The weight， immune organ index， blood routine indicators （including red blood cells， leukocytes， hemoglobin and platelets）， serum IL-6 levels and erythrocyte membrane Na+-K+-ATPase activity in the model group A， B， C， and D were lower than those in the normal control group after nine days model establishment， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The animal mortality rate of the model group B was lower than that of model group A， C， and D， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Daily swimming for 10 min + bloodletting 0.3 ml every other day is the optimal model parameters for traditional Chinese medicine syndrome of blood deficiency pattern.

[Key words] Comprehensive bloodletting; Blood deficiency pattern; Traditional Chinese medicine syndrome model

血虛證是臨床常見(jiàn)的病癥，多數(shù)原因?yàn)槭а^(guò)多、脾胃虛弱，或者血液生化之源不足以及瘀血阻滯等。目前國(guó)內(nèi)研究人員造模采用較多的是慢性放血，使其“有形之血不能速生”，配合疲勞、饑餓等方式損傷其中焦脾胃，造成脾虛、氣虛，使血液生化之源匱乏而制作出接近臨床血虛證表現(xiàn)的小鼠動(dòng)物模型，充分彌補(bǔ)了早期通過(guò)放化療損傷這個(gè)單一因素造模不能全面反映中醫(yī)血虛證候復(fù)雜的病理變化的缺陷。但該中醫(yī)證候動(dòng)物模型沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的造模參數(shù)，造成研究者重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)需要重新摸索參數(shù)，浪費(fèi)大量時(shí)間和精力。本研究通過(guò)對(duì)比力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間（游泳時(shí)間）及放血體積的不同參數(shù)對(duì)小鼠體重、免疫器官指數(shù)、死亡率、血常規(guī)指標(biāo)、血清白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平及紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性的影響，確定血虛證的最優(yōu)造模參數(shù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

實(shí)驗(yàn)用ICR小鼠[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司;生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005]100只，雄性，6周齡，體重（25±1）g，于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度30%～40%，各組小鼠喂食常規(guī)飼料，自由飲水。ICR小鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組與4個(gè)不同參數(shù)模型組（模型組A、B、C、D），每組各20只。實(shí)驗(yàn)在浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)下進(jìn)行。

1.2試劑及儀器

ATP酶試劑盒（南京建成生物工程研究所）;IL-6 Elisa試劑盒（美國(guó)R&D公司）;庫(kù)爾特細(xì)胞全自動(dòng)分析儀（美國(guó)Becman公司）。

1.3造模方法

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，每日模型組4組小鼠置于自制塑料盒（50 cm×120 cm×40 cm）中強(qiáng)迫游泳10 min或15 min，水溫20℃，隔日眼眥取血0.3 ml或0.5 ml，實(shí)驗(yàn)期間飼料控制在每日75 g/kg，連續(xù)9 d，制成血虛證模型。其中模型組A（n=20）：15 min游泳+0.3 ml放血;模型組B（n=20）：10 min游泳+0.3 ml放血;模型組C（n=20）：15 min游泳+0.5 ml放血;模型組D（n=20）：10 min游泳+0.5 ml放血。

1.4取材及檢測(cè)

于造模后第10天，對(duì)各組小鼠進(jìn)行股動(dòng)脈取血，除了抗凝全血外，1500 r/min離心10 min，取得血清做生化測(cè)定，處死動(dòng)物后取胸腺和脾臟稱(chēng)重。

取抗凝全血加入血細(xì)胞分析儀中上機(jī)直接進(jìn)行血常規(guī)分析，主要測(cè)定紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板以及血紅蛋白數(shù)量。

將肝素鈉抗凝全血4℃離心（1500 r/min，10 min），吸去上清液并小心吸去壓積紅細(xì)胞上層的白色絨毛狀膜成分。將壓積紅細(xì)胞用10倍體積的4℃生理鹽水懸浮，4℃離心（1500 r/min，10 min），重復(fù)2～3次。直到上清液無(wú)色，吸去上清液，保留壓積紅細(xì)胞。取壓積紅細(xì)胞按1∶10比例加入去離子水，混勻混合。4℃放置20 min，由于出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，液體由鮮紅色變?yōu)橥该靼导t色。4℃平衡離心（12 000 r/min，30 min），吸去暗紅上清液，可見(jiàn)底部一塊粉紅色沉淀，重復(fù)3次，直到沉淀部分呈乳白色，棄去上清液及離心管底部褐色的纖維蛋白樣沉淀斑，收集白色或淺粉色血影膜。將血影膜懸浮于一定體積的去離子水中，混合均勻，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量。規(guī)定每小時(shí)每107個(gè)紅細(xì)胞的Na+-K+-ATP酶分解三磷酸腺苷（ATP）產(chǎn)生1 μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)Na+-K+-ATP酶活性單位，即μmol Pi/（107個(gè)紅細(xì)胞·h）。按ATP酶試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布計(jì)量資料的均數(shù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布者經(jīng)過(guò)變量轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布后行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P<0.01為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著。

2結(jié)果

2.1各組小鼠的一般狀況

外觀變化可以清楚地反映小鼠的進(jìn)食、飲水、飼養(yǎng)等情況。在實(shí)驗(yàn)造模期間內(nèi)，模型組A、B、C、D的小鼠外觀均發(fā)生了比較明顯的變化，如耳廓鼻唇顏色變淺、皮毛不光澤、精神萎靡、腰背團(tuán)縮、動(dòng)作靈敏度降低等。

2.2各組小鼠體重、免疫器官指數(shù)和死亡率的比較

模型組A、B、C、D小鼠的初始體重與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后的體重均低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后的體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。模型組A、B、C、D小鼠的免疫器官指數(shù)（胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)）均低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。模型組A、C和D小鼠造模9 d后死亡率高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組B小鼠造模9 d后死亡率與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。模型組B小鼠造模9 d后死亡率低于模型組A、C和D，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.3各組小鼠血常規(guī)指標(biāo)的比較

模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白以及血小板計(jì)數(shù)均低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后的血常規(guī)指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

2.4各組小鼠血清IL-6水平和紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性的比較

模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后的血清IL-6水平和紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性均低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后的血清IL-6水平和紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表3）。

3討論

中醫(yī)認(rèn)為肝藏血，具有貯藏血液、調(diào)節(jié)血量及防止出血的功能;脾統(tǒng)血，具有統(tǒng)攝、控制血液在脈中平穩(wěn)運(yùn)行，防止血液溢出脈外的功能，如《金匱要略》所述“五臟六肺之血，全賴(lài)脾氣統(tǒng)攝。”失血會(huì)引起肝臟萎縮，藏血功能失常;脾臟萎縮，統(tǒng)攝血液功能失常;胸腺萎縮，免疫功能低下，從而表現(xiàn)為血虛的證候。血虛證動(dòng)物模型研究目前有失血性（綜合失血法）、化學(xué)損傷[1-2]、放射性損傷[3-4]和免疫介導(dǎo)[5-6]4類(lèi)模型。通過(guò)中醫(yī)學(xué)的定義和古籍文獻(xiàn)的描述可知，血虛多由失血、勞倦、飲食不足等原因引起，故本研究采用綜合放血法（力竭游泳+放血+限食），符合血虛證中醫(yī)證候的病因。經(jīng)過(guò)每日觀察記錄發(fā)現(xiàn)模型組小鼠在造模后的第3天即出現(xiàn)行動(dòng)遲緩，團(tuán)縮弓背，面、眼、耳、尾蒼白而涼，毛蓬豎而少光澤，血色暗紅，大便稀等典型血虛癥狀。

通過(guò)整理文獻(xiàn)報(bào)道的綜合放血法致血虛模型，發(fā)現(xiàn)造模參數(shù)差異較大，有每日強(qiáng)迫力竭游泳20 min+隔日放血0.3 ml[7]、也有隔日游泳20 min+隔日放血0.4 ml[8-10]、隔日游泳20 min+隔日放血0.3 ml以及每日游泳2次（時(shí)長(zhǎng)不定）+隔日放血0.5 ml等，對(duì)新的研究者的參考意義并不大。本研究通過(guò)設(shè)置不同的力竭游泳時(shí)間和放血量，考察體重、免疫器官指數(shù)、死亡率、血常規(guī)指標(biāo)、血清IL-6水平及紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性對(duì)比血虛模型的造模程度，結(jié)果顯示，模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后的體重及免疫器官指數(shù)均低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。紅細(xì)胞為運(yùn)送氧氣的主要媒介且具有免疫功能，血紅蛋白含量高低代表著血虛程度的輕重，白細(xì)胞為免疫細(xì)胞，具有吞噬異物產(chǎn)生抗體的作用，而血小板在造血過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白以及血小板含量均低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明血虛小鼠的紅細(xì)胞運(yùn)輸功能受到損傷，機(jī)體免疫水平低下，與其他研究者的結(jié)論較為一致[11-13]，并且隨著造模參數(shù)的變化，造模嚴(yán)重程度也加重。免疫細(xì)胞因子IL-6可誘導(dǎo)活化后的B細(xì)胞對(duì)免疫球蛋白（Ig）的分泌，同時(shí)促進(jìn)T細(xì)胞的活化增殖、分化，尚能與IL-3協(xié)同誘導(dǎo)多種造血前體細(xì)胞的增殖，而興奮體液免疫系統(tǒng)，同時(shí)對(duì)細(xì)胞免疫和造血功能也有促進(jìn)作用。本研究結(jié)果顯示，模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后的血清IL-6水平低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與免疫器官指數(shù)、白細(xì)胞水平降低均一致，說(shuō)明血虛證小鼠具有免疫力低下的狀況[14]，與其他研究者的結(jié)論一致[5]。紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整是紅細(xì)胞發(fā)揮作用的重要保證，而紅細(xì)胞的功能主要是通過(guò)膜蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)的，細(xì)胞膜上的Na+-K+-ATP酶保持膜內(nèi)高鉀，膜外高鈉的平衡，能將ATP分解為二磷酸腺苷（ADP）并產(chǎn)生能量，對(duì)維持紅細(xì)胞的形態(tài)和功能具有重要作用，但在血虛狀態(tài)下其活力明顯降低。本研究結(jié)果顯示，模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后Na+-K+-ATP酶活性低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與其他研究者的結(jié)論一致[15-20]。4種造模參數(shù)下都能夠成功制作出血虛模型，且4個(gè)模型的評(píng)估指標(biāo)無(wú)顯著差異。本研究結(jié)果顯示，模型組A、C和D小鼠造模9 d后的死亡率高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示造模過(guò)嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致模型小鼠死亡率的大幅度增加。小鼠的死亡原因均為當(dāng)晚被同籠相對(duì)較強(qiáng)的小鼠咬死并食用，因此模型組A、C和D無(wú)法達(dá)到每日限食75 g/kg的精確實(shí)驗(yàn)條件，為實(shí)現(xiàn)造模方法的標(biāo)準(zhǔn)化且具有可重復(fù)性，在4組模型都造模成功的基礎(chǔ)上，優(yōu)先考慮模型組B的造模參數(shù)，即每日強(qiáng)迫力竭游泳10 min+隔日放血0.3 ml。

目前對(duì)于中醫(yī)證候模型血虛證判定成模的標(biāo)準(zhǔn)基本都以現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的客觀指標(biāo)為基礎(chǔ)，并根據(jù)陽(yáng)性結(jié)果來(lái)判定，但對(duì)于這些客觀指標(biāo)的特異性和權(quán)重并沒(méi)有深入研究，只有確定權(quán)重系數(shù)和量化指標(biāo)的重要性，才能使得中醫(yī)證候模型更切合臨床實(shí)際情況和更具有可重復(fù)性，可在下一步研究中深入探討。

[參考文獻(xiàn)]

[1]亢澤峰，莊曾淵，萬(wàn)素君，等.益氣養(yǎng)血活血中藥對(duì)實(shí)驗(yàn)性血虛證大鼠視網(wǎng)膜病理改變的影響[J].中國(guó)中醫(yī)眼科雜志，2000，10（4）：199-202.

[2]李偉，彭欣，王冰，等.四物湯調(diào)節(jié)血虛大鼠微循環(huán)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J].陜西中醫(yī)，2009，30（12）：1662-1663.

[3]郭平，梁乾德，胡劍江，等.四物湯對(duì)放射線致血虛證小鼠骨髓Epo和G-CSF基因表達(dá)的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2005，30（15）：1173-1176.

[4]郭平，王繼峰，王升啟.芍藥苷對(duì)放射線致血虛證小鼠骨髓Epo和G-CSF基因表達(dá)的影響[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，29（3）：236-239.

[5]朱映黎，王林元，趙丹萍，等.芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷對(duì)血虛免疫抑制小鼠的補(bǔ)血作用及機(jī)制[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，39（3）：204-207.

[6]王穆，讓蔚清，張琪，等.四物湯對(duì)環(huán)磷酰胺所致血虛證治療后的代謝組學(xué)研究[J].中國(guó)中藥雜志，2010，35（5）：630-634.

[7]張建軍，黃銀峰，王麗麗，等.白芍、赤芍及芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷對(duì)綜合放血法致血虛小鼠補(bǔ)血作用的比較研究[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38（19）：3358-3362.

[8]譚瑋，宋崇順，譚洪玲，等.四物湯對(duì)綜合放血法致小鼠血虛證造血功能的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2005，30（12）：926.

[9]霍超，馬增春，王穆，等.綜合放血法所致血虛證小鼠模型及四物湯反證的代謝組學(xué)研究[J].中國(guó)中藥雜志，2010， 35（23）：3194-3198.

[10]譚洪玲，馬增春，肖成榮，等.四物湯對(duì)3種血虛證動(dòng)物細(xì)胞周期的影響[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26（2）：158-161.

[11]袁拯忠，葉人，陳增強(qiáng)，等.兩種血虛證小鼠模型的比較[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27（6）：1265-1266.

[12]林新艷，殷書(shū)梅，王宓，等.黃芪精對(duì)血虛癥、氣虛癥模型小鼠的藥效學(xué)研究[J].中國(guó)藥業(yè)，2012，21（6）：19-20.

[13]周建輝，阮耀，李克卉，等.巴戟天水提液對(duì)血虛型小鼠造血功能的影響[J].國(guó)醫(yī)論壇，2012，27（6）：47-48.

[14]苗明三，王智明，孫艷紅.懷熟地黃多糖對(duì)血虛大鼠血像及細(xì)胞因子水平的影響[J].中藥藥理與臨床，2007，23（1）：39-40.

[15]楊嵐，陳為.四物湯對(duì)血虛小鼠紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶的影響[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，9（1）：10-12.

[16]曾繁強(qiáng)，徐永莉，江思華，等.紅毛雞干燥體醇提物對(duì)血虛模型小鼠的補(bǔ)血作用研究[J].中國(guó)藥房，2016，27（31）：4373-4375.

[17]伍文彬，張廷模，王飛.赤白芍對(duì)血虛證動(dòng)物模型補(bǔ)血作用及機(jī)制研究[J].中藥藥理與臨床，2012，28（3）：69-71.[18]張明.甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸質(zhì)量及補(bǔ)血活血作用的比較研究[D].蘭州：甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[19]苗明三，佟麗，方曉艷，等.大鼠氣血雙虛動(dòng)物模型的建立[C].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì).中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)第六屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文集，2004：79-87.

[20]苗明三，苗艷艷，孫艷紅.大棗多糖對(duì)血虛大鼠全血細(xì)胞及紅細(xì)胞ATP酶活力的影響[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2006，10（11）：97-99.

（收稿日期：2019-07-25）