熒光分析技術(shù)在作物響應(yīng)鎘脅迫研究中的應(yīng)用

燕 輝,李心平,徐 竹,林國(guó)森

河南科技大學(xué)農(nóng)業(yè)裝備工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471000

引 言

近年來(lái)，隨著工礦業(yè)“三廢”的過(guò)量排放、化肥農(nóng)藥的濫施濫用、及城市垃圾與交通污染的加劇，土壤中的重金屬污染呈現(xiàn)出不斷加劇的趨勢(shì)。鎘(Cd)在五大有毒元素(Cd，Hg，As，Cr和Pb)中被列為首位，是一種毒性很強(qiáng)的重金屬元素。土壤中的鎘離子極易被植物根系吸收，并進(jìn)一步被木質(zhì)部蒸騰流運(yùn)至冠層。作為非必需元素，冠層不斷積累的鎘離子不僅不能提供葉片必需的養(yǎng)分，還會(huì)對(duì)葉片生長(zhǎng)發(fā)育造成不利影響。例如，葉肉細(xì)胞中過(guò)量積累的鎘離子會(huì)破壞膜蛋白氫硫鍵，導(dǎo)致細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜與核膜透性增大，進(jìn)而造成細(xì)胞器與細(xì)胞核解體、功能喪失[1]； 過(guò)量的鎘離子還可能降低葉肉細(xì)胞中代謝酶活性、限制葉片中營(yíng)養(yǎng)元素吸收，進(jìn)而導(dǎo)致葉片發(fā)育不良、失綠枯萎等[2]。更為嚴(yán)重的是，如果鎘離子通過(guò)“植物——植食動(dòng)物”這一食物鏈進(jìn)入人體、并在人體內(nèi)大量積累后，必然會(huì)對(duì)人類的健康造成不利影響。

為了有效地獲取植物響應(yīng)鎘脅迫的生物學(xué)信息，就有必要依據(jù)植物的生理特性探求更為有效的分析手段。通常情況下，植物葉綠素分子吸收的光能分別用來(lái)： (1)驅(qū)動(dòng)光化學(xué)反應(yīng)； (2)以熱能的形式耗散； (3)產(chǎn)生熒光，且這三種能量釋放方式之間相互競(jìng)爭(zhēng)。因此，我們能夠通過(guò)分析葉綠素?zé)晒饧盁岷纳⒌淖兓瘉?lái)探明植物光化學(xué)反應(yīng)機(jī)制。進(jìn)一步研究證實(shí)，葉綠素?zé)晒夥治瞿軌蜢`敏、快速、無(wú)損地測(cè)定植物光系統(tǒng)II(PSII)反應(yīng)中心活性，進(jìn)而獲取光合過(guò)程中植物對(duì)光能的吸收、傳遞、利用與散失規(guī)律[3]。因此，與傳統(tǒng)的利用植物葉片CO2釋放量進(jìn)行光合作用的研究相比，它能夠有效地反映植物光合作用的“內(nèi)在性”特點(diǎn)。為探明熒光分析技術(shù)在作物重金屬脅迫研究中應(yīng)用的方法，本研究以大豆幼苗為材料，應(yīng)用熒光分析技術(shù)，探求鎘脅迫下植物葉綠素?zé)晒鈪?shù)及其光響應(yīng)曲線的變化規(guī)律，以及熒光參數(shù)與鎘離子含量的關(guān)系。這將為在植物表型研究中探求植物逆境響應(yīng)提供研究思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)開(kāi)始前，首先將大豆播種于已填充基質(zhì)的穴盤(pán)中。待大豆出芽后，選取生長(zhǎng)良好且長(zhǎng)勢(shì)均勻的大豆幼苗，分別移入統(tǒng)一規(guī)格的試驗(yàn)盆。盆中填裝等量基質(zhì)，且在整個(gè)試驗(yàn)期間確保水分充分供應(yīng)，以維持大豆幼苗正常生長(zhǎng)。待大豆幼苗生長(zhǎng)至一定階段后，開(kāi)始進(jìn)行試驗(yàn)處理。在試驗(yàn)過(guò)程中，采用100 mL分別添加了0 μmol·L-1(對(duì)照)與200 μmol·L-1CdSO4的溶液對(duì)大豆幼苗進(jìn)行鎘脅迫處理，每種處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)。在鎘脅迫1，3，6與9 d后分別測(cè)定對(duì)照與脅迫大豆幼苗的葉片鎘含量與葉綠素?zé)晒鈪?shù)，并對(duì)葉綠素?zé)晒鈪?shù)與葉片鎘含量進(jìn)行相關(guān)及回歸分析。同時(shí)，在鎘脅迫5 d后測(cè)定大豆幼苗葉片的熒光光響應(yīng)曲線。

1.2 觀測(cè)項(xiàng)目和方法

1.2.1 葉綠素?zé)晒鈪?shù)采集

最大光化學(xué)效率為

Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm

實(shí)際光化學(xué)效率為

非光化學(xué)猝滅系數(shù)為

電子傳遞效率為

鎘脅迫5 d后，采用Imagine-PAM調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x進(jìn)行大豆幼苗葉片熒光光響應(yīng)曲線的測(cè)定。測(cè)定時(shí)設(shè)定的光合有效輻射強(qiáng)度梯度為30，60，120，250和500 μmol·m-2·s-1，測(cè)定的熒光參數(shù)包括實(shí)際光化學(xué)效率與非光化學(xué)猝滅系數(shù)等。

1.2.2 葉片鎘含量測(cè)定

完成熒光測(cè)定后，收獲大豆幼苗葉片，用液氮研成粉末。稱取一定量的粉末置于三角瓶中，再向三角瓶分別加入10 mL硝酸與1 mL高氯酸。次日，將靜置過(guò)夜后的三角瓶置于溫度為100 ℃左右的電熱板上消煮至0.5 mL左右。隨后，將消煮液定容于容量瓶(25 mL)，并使用原子吸收光譜儀測(cè)定鎘離子含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 鎘離子含量變化

當(dāng)植物根系暴露于鎘離子環(huán)境時(shí)，鎘離子會(huì)通過(guò)主動(dòng)或被動(dòng)吸收的方式進(jìn)入根細(xì)胞； 進(jìn)入根區(qū)的鎘離子會(huì)進(jìn)一步在木質(zhì)部蒸騰流的作用下向上運(yùn)輸至冠層，并在葉肉細(xì)胞大量積累。本研究亦發(fā)現(xiàn)，伴隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，大豆葉片鎘離子含量呈現(xiàn)出升高趨勢(shì)，且在鎘脅迫9 d后達(dá)到最大值(圖1)。鎘離子是非必需元素，其大量積累不僅不會(huì)為植物生長(zhǎng)提供養(yǎng)分，還會(huì)對(duì)葉肉細(xì)胞質(zhì)膜及細(xì)胞器造成生理傷害，進(jìn)而對(duì)光合器官及其生理功能造成不利影響。

圖1 鎘脅迫下大豆幼苗葉片鎘含量變化Fig.1 The variation of Cd concentration in leavesof soybean seedlings under Cd stress

2.2 鎘脅迫下葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化

最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)是反映光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心原初光能轉(zhuǎn)換效率或光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心光化學(xué)潛在效率的物理量[4]。對(duì)大多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，F(xiàn)v/Fm是穩(wěn)定的，其值降低往往意味著植物遭受了環(huán)境脅迫或受到了生理傷害[5]。對(duì)鎘脅迫下大豆PSⅡ反應(yīng)中心Fv/Fm變化規(guī)律進(jìn)行研究表明： 鎘脅迫3 d后，F(xiàn)v/Fm維持穩(wěn)定，這表明此時(shí)的鎘脅迫沒(méi)有對(duì)大豆PSⅡ反應(yīng)中心Fv/Fm造成影響。但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，鎘脅迫6 d后，F(xiàn)v/Fm較對(duì)照顯著降低，且隨著鎘濃度的增加降低幅度加大。這表明此時(shí)鎘脅迫對(duì)PSⅡ反應(yīng)中心造成了生理傷害。整個(gè)試驗(yàn)中，鎘脅迫9 d條件下Fv/Fm值達(dá)到最低[圖2(a)]?；貧w分析表明，大豆葉片F(xiàn)v/Fm與鎘離子含量呈非線性相關(guān)(R2=0.842，p<0.01)[圖3(a)]。即Fv/Fm能夠在一定程度的鎘脅迫下維持穩(wěn)定，但隨著鎘濃度的進(jìn)一步增大，F(xiàn)v/Fm亦逐步降低。

實(shí)際光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)指PSⅡ反應(yīng)中心在環(huán)境中部分關(guān)閉時(shí)的光化學(xué)效率[6]。試驗(yàn)結(jié)果表明，鎘脅迫下ΦPSⅡ呈現(xiàn)出與Fv/Fm不同的變化規(guī)律。鎘脅迫1 d后，雖然Fv/Fm維持穩(wěn)定，但ΦPSⅡ隨鎘含量的升高呈現(xiàn)出降低趨勢(shì)。這表明此時(shí)鎘脅迫雖然沒(méi)有對(duì)大豆光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心造成生理傷害，但已造成其實(shí)際光合效率降低。伴隨著脅迫時(shí)間的增加，鎘脅迫6 d對(duì)光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心造成了生理傷害，且ΦPSⅡ隨鎘含量的增加降低更加顯著[圖2(b)]。進(jìn)一步的回歸分析發(fā)現(xiàn)，大豆葉片ΦPSⅡ與鎘離子含量呈負(fù)相關(guān)(R2=0.959，p<0.01)，即隨著葉片鎘濃度的升高，ΦPSⅡ逐步降低[圖3(b)]。

圖2 鎘脅迫下大豆幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化Fig.2 The variation of chlorophyll fluorescence in leaves of soybean seedlings under Cd stress

圖3 大豆幼苗葉片葉綠素?zé)晒馀c鎘離子含量的相關(guān)及回歸分析Fig.3 Relevant and regression analysis between chlorophyll fluorescence and Cd concentration in leaves of soybean seedlings

在PSⅡ反應(yīng)中心天線色素吸收的光能中，部分能量不用于光合電子傳遞，而是以熱的形式耗散掉。非化學(xué)猝滅系數(shù)(NPQ)是反映PSⅡ反應(yīng)中心熱耗散能力大小的熒光參數(shù)[8]。如果天線色素吸收的光能過(guò)量，且不能及時(shí)有效地耗散，將會(huì)對(duì)PSⅡ反應(yīng)中心造成傷害。NPQ的值大，說(shuō)明天線色素吸收的光能更多地以熱的形式耗散，而用于光合電子傳遞和光化學(xué)反應(yīng)的能量相對(duì)較少。本研究發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫1 d后，NPQ即隨鎘含量的增加呈現(xiàn)出升高趨勢(shì)，且鎘脅迫3，6與9 d后，NPQ均高于對(duì)照[圖2(d)]。表明鎘脅迫條件下，PSⅡ反應(yīng)中心熱耗散增加。這與Ma等[9]對(duì)杉屬植物的研究結(jié)論相一致。大豆通過(guò)這種過(guò)量激發(fā)能耗散的方式，可以有效地減輕鎘脅迫下能量過(guò)剩對(duì)光合系統(tǒng)造成的生理傷害?；貧w分析表明，大豆葉片NPQ與鎘離子含量呈正相關(guān)(R2=0.945，p<0.01)。即隨著葉片鎘濃度的增加，NPQ逐步升高[圖3(d)]。

2.3 葉綠素?zé)晒夥治?/h3>

葉綠素?zé)晒夥治鍪茄芯恐参锕夂咸匦缘挠行结槪欣诟钊氲亓私饽婢硹l件下光合器官的狀況[10]。因此，本研究對(duì)鎘脅迫下大豆葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化規(guī)律進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，作為常用的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心Fv/Fm在一定程度的鎘脅迫下能夠維持穩(wěn)定，這與de Castro等[11]的研究結(jié)論一致。隨著鎘濃度的增加，100 mmol·L-1鎘脅迫6 d后，大豆幼苗Fv/Fm較對(duì)照顯著降低。Fv/Fm降低表明大豆遭受到了慢光抑制的生理傷害。鎘脅迫對(duì)大豆光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心造成慢光抑制之前，對(duì)其造成的動(dòng)態(tài)光抑制就已經(jīng)產(chǎn)生了，主要表現(xiàn)在ΦPSⅡ的降低。ΦPSⅡ的降低發(fā)生在Fv/Fm之前，表明鎘脅迫首先對(duì)植物造成了動(dòng)態(tài)光抑制，導(dǎo)致光系統(tǒng)Ⅱ量子產(chǎn)額的降低。隨著鎘脅迫程度的進(jìn)一步增大，光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心的結(jié)構(gòu)完整性受到傷害，慢光抑制發(fā)生。

鎘脅迫條件下，伴隨大豆光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心Fv/Fm與ΦPSⅡ的降低，ETR也呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。這表明這些熒光參數(shù)之間存在相關(guān)性。鎘脅迫條件下，光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心光化學(xué)效率降低，電子傳遞速率變慢。而與之相反的是，伴隨著鎘脅迫程度的增大，NPQ逐漸升高，這確保捕光色素吸收的光能更多的以熱的形式耗散掉而不是進(jìn)行光合作用[12]，進(jìn)而導(dǎo)致ΦPSⅡ減量調(diào)節(jié)，避免了原初電子受體的過(guò)度還原[13]。但這種自我保護(hù)能力畢竟有限，當(dāng)鎘脅迫程度繼續(xù)加大且超出植物的承受能力(如100 mmol·L-1鎘脅迫6 d)時(shí)，導(dǎo)致發(fā)生慢光抑制及光系統(tǒng)Ⅱ受損。

2.4 鎘脅迫下熒光光響應(yīng)曲線變化

為了更有效地應(yīng)用熒光分析技術(shù)評(píng)估作物響應(yīng)重金屬脅迫的生理機(jī)制，本研究進(jìn)一步對(duì)鎘脅迫下大豆葉片葉綠素?zé)晒夤忭憫?yīng)曲線變化進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，伴隨著光強(qiáng)的增加，大豆葉片實(shí)際光化學(xué)效率(ФPSⅡ)呈現(xiàn)出逐步降低的趨勢(shì)[圖4(a)]； 而與ФPSⅡ不同，大豆葉片非光化學(xué)猝滅(NPQ)隨著光強(qiáng)增加逐步升高[圖4(b)]。這表明熒光參數(shù)的變化受光強(qiáng)的調(diào)控。鎘脅迫條件下，脅迫葉片熒光參數(shù)光響應(yīng)曲線的變化趨勢(shì)與未脅迫葉片相似，但一定光強(qiáng)條件下脅迫葉片熒光參數(shù)ФPSⅡ較未脅迫葉片降低[圖4(a)]。這應(yīng)該與鎘脅迫降低光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心活性有關(guān)系[14]。另一方面，鎘脅迫下反應(yīng)中心ФPSⅡ的值下調(diào)能夠降低光合電子傳遞速率，進(jìn)而減輕鎘脅迫對(duì)反應(yīng)中心的生理傷害。而對(duì)鎘脅迫下NPQ的光響應(yīng)曲線進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，一定光強(qiáng)條件下脅迫葉片的NPQ較未脅迫葉片升高[圖4(b)]。NPQ是一種光保護(hù)機(jī)制，它能夠?qū)⒕酃馍匚盏墓饽芨嗟匾詿岬男问胶纳⒌舳皇沁M(jìn)行碳同化[15]，進(jìn)而減少能量過(guò)激發(fā)對(duì)作物的生理傷害。

圖4 鎘脅迫下大豆幼苗葉片葉綠素?zé)晒夤忭憫?yīng)曲線

3 結(jié) 論

應(yīng)用熒光分析技術(shù)探求作物響應(yīng)鎘脅迫的生理機(jī)制發(fā)現(xiàn)： 鎘脅迫1 d即降低大豆幼苗PSⅡ反應(yīng)中心ФPSⅡ活性； 為了減少激發(fā)能過(guò)剩對(duì)PSⅡ反應(yīng)中心造成的生理傷害，大豆幼苗通過(guò)升高NPQ耗散過(guò)剩激發(fā)能。這雖然降低了PSⅡ反應(yīng)中心的光合電子傳遞速率，但同時(shí)也避免了原初電子受體的過(guò)度還原，維持了Fv/Fm的穩(wěn)定。此時(shí)鎘脅迫對(duì)大豆造成了動(dòng)態(tài)光抑制。鎘處理6 d后，脅迫導(dǎo)致大豆幼苗PSⅡ反應(yīng)中心NPQ的進(jìn)一步升高與ФPSⅡ、ETR的進(jìn)一步降低。NPQ升高意味著光保護(hù)的增加，然而，此時(shí)的光保護(hù)已不足以避免能量過(guò)激發(fā)引起的傷害，F(xiàn)v/Fm呈現(xiàn)出降低趨勢(shì)。這表明鎘脅迫對(duì)PSⅡ的慢光抑制已經(jīng)產(chǎn)生。脅迫葉片光響應(yīng)曲線呈現(xiàn)出與未脅迫葉片相似的變化趨勢(shì)； 但在一定光強(qiáng)條件下，脅迫葉片ФPSⅡ較未脅迫葉片降低，而NPQ較未脅迫葉片升高。這表明脅迫導(dǎo)致葉片光化學(xué)活性降低，吸收的光能更多地以熱的形式耗散。以上研究證實(shí)，熒光分析技術(shù)能夠?yàn)樯钊胙芯孔魑镯憫?yīng)鎘脅迫的生理機(jī)制提供理論指導(dǎo)。