生物安全性發(fā)光碳點(diǎn)納米材料的制備及其在Hg2+檢測(cè)中的應(yīng)用

陳綺嫻，陳奇丹*，鐘學(xué)沅

1. 吉林大學(xué)珠海學(xué)院化工與新能源材料學(xué)院，廣東 珠海 5190412. 珠海市吉林大學(xué)超分子材料研究所，吉林大學(xué)南方研究院，廣東 珠海 519041

引 言

發(fā)光碳點(diǎn)納米材料(carbon dots,CDs)制備成本低廉，具備較好的水溶性、易于表面功能化、較好的生物兼容性及良好的光學(xué)性能等優(yōu)點(diǎn)[1-2]，對(duì)環(huán)境的危害很小，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)發(fā)光納米材料生物安全性方面的不足[3-4]，有望解決以往發(fā)光納米材料在檢測(cè)研究中的安全及環(huán)境污染問(wèn)題，成為痕量污染物檢測(cè)及光診療領(lǐng)域最具潛力的工具[5-7]。值得一提的是，碳點(diǎn)納米材料發(fā)光性質(zhì)十分穩(wěn)定，而且具有很長(zhǎng)的熒光壽命及抗光漂白的能力。一般來(lái)講，碳點(diǎn)的發(fā)光中心通常被分為碳核態(tài)、分子態(tài)、表面態(tài)、邊緣態(tài)及本征態(tài)等類(lèi)型。研究表明，低溫下分子態(tài)發(fā)光的發(fā)色團(tuán)占主導(dǎo)地位，但隨碳化溫度升高，CDs的發(fā)光中心通常以碳核態(tài)為主導(dǎo)，隨著碳化程度提高，CDs抗光漂白的穩(wěn)定性能力增強(qiáng)[8-9]。在檢測(cè)應(yīng)用方面，CDs的光學(xué)性能與高性能半導(dǎo)體量子點(diǎn)相近，能承受多次的激發(fā)和光發(fā)射，它持久的光穩(wěn)定性允許長(zhǎng)時(shí)間的界面修飾和觀察，有利于作為污染物標(biāo)記物進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的跟蹤檢測(cè)。總體來(lái)說(shuō)，CDs的合成方法及結(jié)構(gòu)特征，決定其發(fā)光效應(yīng)及響應(yīng)機(jī)理[10]。研究表明，CDs的檢測(cè)機(jī)理大多數(shù)是基于熒光猝滅的“on-off”模式(也有少數(shù)“on-off-on”模式)[11-12]。能量/電子轉(zhuǎn)移、動(dòng)態(tài)碰撞以及新的復(fù)合物或絡(luò)合物的形成過(guò)程都可以是熒光猝滅的，因此，CDs對(duì)金屬離子、π鍵體系分子以及強(qiáng)氧化劑通常都具有比較明顯的淬滅作用。不同的處理方法制備的發(fā)光碳點(diǎn)納米材料對(duì)金屬離子不同的選擇性，在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出很強(qiáng)的專(zhuān)一性，不同的表面基團(tuán)和碳源的選擇都會(huì)影響CDs和金屬離子結(jié)合的能力，可通過(guò)金屬對(duì)CDs的熒光變化影響，建立相應(yīng)的濃度-光強(qiáng)關(guān)系來(lái)實(shí)現(xiàn)金屬離子的檢測(cè)應(yīng)用。

本文以鹽酸多巴胺為碳源，鄰苯二胺為修飾劑，通過(guò)低成本水熱法制備了一批發(fā)射波長(zhǎng)為596 nm的近紅外發(fā)光碳點(diǎn)納米材料，該碳點(diǎn)在中酸性(pH=4～7)水溶液中熒光強(qiáng)度較大，在一定的鹽濃度(0～0.3 mol·L-1)條件下可穩(wěn)定使用，經(jīng)細(xì)胞毒性MTT實(shí)驗(yàn)分析該材料毒性較小，具有良好的生物安全性。此外，對(duì)水樣中微痕量重金屬污染物的檢測(cè)進(jìn)行了應(yīng)用探索，經(jīng)過(guò)金屬篩選實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)了所合成發(fā)光碳點(diǎn)納米材料對(duì)水樣中重金屬Hg2+的高靈敏快速專(zhuān)一響應(yīng)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑： 無(wú)水乙醇(西隴化工股份有限公司，分析純)，鹽酸多巴胺(安耐吉化學(xué)有限公司，分析純)； 鄰苯二胺(安耐吉化學(xué)有限公司，分析純)，磷酸二氫鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純)，磷酸氫二鈉(天津市福晨化學(xué)試劑廠，分析純)，金屬標(biāo)液(國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心鋼鐵研究總院，1 000 μg·mL-1)，MTT試劑盒(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司，Genview-JT343-250MG)，培養(yǎng)基(美國(guó)飛世爾科學(xué)世界公司，Hyclone-RPMI-1640)，PBS緩沖液(美國(guó)飛世爾科學(xué)世界公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)，熒光素(天津中津化工有限公司，分析純)。

儀器： UV-2450紫外光譜儀(日本島津公司)，RF-5310pc熒光光譜儀(日本島津公司) IR Prestige-21傅里葉變紅外光譜儀(日本島津公司)，DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，MS104TS/02電子分析天平(上海梅特勒-托利多)，KQ-600KDE超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，JEM-2100F透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)，RT-6000自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)雷杜RAYTO公司)。

1.2 發(fā)光碳點(diǎn)納米材料合成

稱(chēng)取0.227 g鹽酸多巴胺以及0.108 g鄰苯二胺，加入10 mL去離子水，用玻璃棒攪拌至兩種晶體完全溶解，轉(zhuǎn)移至四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼反應(yīng)釜中并放置在設(shè)置好溫度的電熱鼓風(fēng)干燥箱中，在一定溫度條件下反應(yīng)一定時(shí)間，待反應(yīng)完成后，將反應(yīng)釜放置在通風(fēng)良好處，冷卻至室溫。加入無(wú)水乙醇超聲洗滌反應(yīng)釜壁。合并發(fā)光碳點(diǎn)納米材料粗產(chǎn)物溶液轉(zhuǎn)移至梨形瓶中，放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋蒸至1～2 mL，放入真空干燥箱中干燥。取出稱(chēng)重。將產(chǎn)物密封，冷凍備用。

1.3 發(fā)光碳點(diǎn)納米材料合成條件及環(huán)境因素影響

1.3.1 反應(yīng)溫度的影響

按照上述合成方法，改變反應(yīng)溫度分別為： 160，180和200 ℃。

1.3.2 反應(yīng)時(shí)間的影響

改變反應(yīng)時(shí)間，分別為： 10，12，14，16，18和20 h。

1.3.3 抗鹽及pH值的影響

(1) 鹽濃度對(duì)發(fā)光碳點(diǎn)納米材料熒光強(qiáng)度的影響

分別配置濃度為0，0.01，0.05，0.1，0.2，0.3和0.5 mol·L-1的NaCl溶液，作為溶劑配置成濃度為含20 μg·mL-1發(fā)光碳點(diǎn)納米材料的溶液，進(jìn)行熒光檢測(cè)。

(2)pH值對(duì)發(fā)光碳點(diǎn)納米材料熒光強(qiáng)度的影響

分別配置0.2 mol·L-1以及0.1 mol·L-1的磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉，改變兩者配比，配置成pH值為4～12范圍的緩沖液，檢測(cè)其對(duì)發(fā)光碳點(diǎn)納米材料熒光強(qiáng)度的影響。

1.4 細(xì)胞毒性分析實(shí)驗(yàn)

新鮮肝臟取于健康雄性小鼠，培養(yǎng)于RPMI培養(yǎng)基，含10%胎牛血清，5%的CO2，培養(yǎng)溫度為37 ℃，在96孔板上每孔接種2×104個(gè)正常小鼠的肝細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，分別加入濃度為10，20，40，60，80和100 μg·mL-1上述合成的發(fā)光碳點(diǎn)納米材料，按同樣條件設(shè)置空白對(duì)照組，每組6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，棄掉培養(yǎng)液并用PBS沖洗，加入新鮮培養(yǎng)基，每孔再加入20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，孵化4 h后棄去上清液，加入150 μL DMSO，37 ℃孵化10 min，輕輕振蕩，在酶標(biāo)儀下490 nm處測(cè)定各孔吸光度(OD)值。

2 結(jié)果與討論

發(fā)光碳點(diǎn)干燥完畢，得到暗紅褐色的固體，稱(chēng)量確認(rèn)產(chǎn)物質(zhì)量為0.275 g。該發(fā)光碳點(diǎn)納米材料極易溶于乙醇，在水中亦可快速溶解，獲得棕色透明溶液。

2.1 發(fā)光碳點(diǎn)納米材料合成條件優(yōu)化

選取不同溫度(160，180和200 ℃)條件及反應(yīng)時(shí)間(10，12，14，16，18和20 h)下所合成的發(fā)光碳點(diǎn)納米材料的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)并不是隨著溫度的升高產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，在一定溫度范圍內(nèi)隨著碳點(diǎn)產(chǎn)物的增加熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)熒光強(qiáng)度反而降低，推測(cè)可能由于過(guò)度碳化而造成。同時(shí)，水熱反應(yīng)時(shí)間并不是越長(zhǎng)越好，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，材料過(guò)度碳化造成熒光強(qiáng)度降低。在180 ℃、16 h條件下，熒光強(qiáng)度最高，發(fā)射波長(zhǎng)最接近于紅光區(qū)域。因此，選擇180 ℃、16 h為制備碳材料的最佳條件。在此條件下合成碳納米材料熒光激發(fā)峰在532 nm，而發(fā)射峰位于596 nm。

2.2 發(fā)光碳點(diǎn)納米材料的表征

2.2.1 透射電鏡表征

用無(wú)水乙醇將發(fā)光碳點(diǎn)納米材料分散，并稀釋成稀溶液，通過(guò)帶孔碳膜的銅網(wǎng)重復(fù)多次撈起稀溶液中的小顆粒，室溫干燥從而制備成透射電鏡表征樣品。圖1顯示了該碳點(diǎn)納米材料的TEM圖像，可看出所合成材料具有較好的分散性，且尺寸均一，直徑為～3 nm。

2.2.2 細(xì)胞毒性分析

采用MTT法，進(jìn)行了小鼠肝細(xì)胞活性檢測(cè)，研究了碳點(diǎn)對(duì)小鼠肝細(xì)胞的毒性，如圖2所示，小鼠肝細(xì)胞在不同碳點(diǎn)濃度(0～100 μg·mL-1)條件下處理活性值，當(dāng)濃度低于80 μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞活性基本都在70%以上，說(shuō)明碳點(diǎn)對(duì)細(xì)胞的毒性較低。以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，所制備的近紅外碳點(diǎn)納米材料毒性較低，生物安全性較好，作為發(fā)光標(biāo)記物用于體內(nèi)檢測(cè)有較好的應(yīng)用潛力。

圖1 發(fā)光碳點(diǎn)納米材料透射電鏡圖Fig.1 TEM images of the CDs

圖2 不同濃度發(fā)光碳點(diǎn)納米材料對(duì)小鼠肝細(xì)胞活性的影響

2.2.3 光譜表征

圖3 (a)發(fā)光碳點(diǎn)納米材料的紫外光譜和(b)熒光激發(fā)-發(fā)射光譜圖不同激發(fā)波長(zhǎng)下發(fā)射熒光光譜圖

圖4 發(fā)光碳點(diǎn)納米材料的紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectra of CDs

2.3 飲用水樣中金屬檢測(cè)應(yīng)用

2.3.1 鹽濃度及pH值吩發(fā)光碳點(diǎn)納米材料熒光強(qiáng)度的影響

實(shí)驗(yàn)中通過(guò)選取20 μg·mL-1發(fā)光碳點(diǎn)納米材料的溶液并觀察其熒光強(qiáng)度變化發(fā)現(xiàn)當(dāng)鈉鹽濃度高于0.3 mol·L-1的時(shí)候熒光強(qiáng)度顯著降低。此外，該發(fā)光碳點(diǎn)納米材料在中酸性環(huán)境下熒光強(qiáng)度較高(pH 4～7)，而在pH>8時(shí)，碳點(diǎn)熒光強(qiáng)度顯著降低。因此，該碳點(diǎn)最佳鹽濃度范圍為0～0.3 mol·L-1，最佳pH范圍為 4～7。

圖5 (a) 發(fā)光碳點(diǎn)納米材料對(duì)金屬的選擇性檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)及(b) Hg2+檢測(cè)曲線(xiàn)

2.3.2 金屬選擇性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及Hg2+專(zhuān)一檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)篩選了碳點(diǎn)對(duì)常見(jiàn)金屬離子包括Ag，Al，Ba，Ca，Cd，Co，Cr，Cu，F(xiàn)e，Hg，Mg，Mn，Ni，Pb和Zn的響應(yīng)。取20 μg·mL-1的發(fā)光碳點(diǎn)納米材料溶液10 mL，加入0.1 mL對(duì)應(yīng)濃度的重金屬溶液，使最終金屬濃度為0.03 μg·mL-1，搖勻，5 min后測(cè)其熒光強(qiáng)度。由圖5(a)可知，碳點(diǎn)對(duì)金屬Hg2+的選擇性最顯著，可對(duì)Hg2+進(jìn)行特定響應(yīng)。選取20 μg·mL-1發(fā)光碳點(diǎn)納米材料溶液與濃度為0.2 μg·mL-1Hg2+作用，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)3 min以上，熒光強(qiáng)度響應(yīng)信號(hào)變化趨勢(shì)達(dá)穩(wěn)定，故選擇4 min作為Hg2+與發(fā)光碳點(diǎn)納米材料的反應(yīng)時(shí)間。為了進(jìn)一步探索碳點(diǎn)對(duì)Hg2+的響應(yīng)情況，實(shí)驗(yàn)配置了分別選取不同濃度Hg2+與20 μg·mL-1碳點(diǎn)的混合溶液，離子濃度分別為0,0.001,0.002,0.003,0.004,0.005,0.01,0.02,0.03,0.04,0.2,0.4,0.6,0.8,1,2,4,8和10 μg·mL-1，反應(yīng)時(shí)間為4 min，并對(duì)其熒光性能進(jìn)行檢測(cè)分析。如圖5(b)(插圖所示為0～0.005 μg·mL-1低濃度范圍)所示，熒光強(qiáng)度與Hg2+濃度的關(guān)系在0.001～10 μg·mL-1范圍內(nèi)符合Stern-Volmer方程[13]

F0/F-1=K[Q]

其中，F(xiàn)0與F分別為加入猝滅劑(本文中為Hg2+)前后的熒光強(qiáng)度，K為猝滅常數(shù)，Q則是猝滅劑濃度。在濃度范圍為0～0.04 μg·mL-1(線(xiàn)性擬合方程為y=190x+0.498，線(xiàn)性系數(shù)R2=0.992 4)，以及0.6～10 μg·mL-1范圍內(nèi)(線(xiàn)性擬合方程為y=3.2x+18.7，線(xiàn)性系數(shù)R2=0.993 2)，均有良好的熒光線(xiàn)性響應(yīng)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得，檢出限為0.000 6 μg·mL-1(S/N=3，n=6)，滿(mǎn)足Hg2+的生活用水檢測(cè)[14](<0.001 μg·mL-1)及工業(yè)廢水檢測(cè)[15](<0.005 μg·mL-1)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.3.3 實(shí)際樣品中的Hg2+檢測(cè)加標(biāo)回收率

樣品無(wú)需前處理，取5 mL待檢水樣分別加入1 mL相應(yīng)的Hg2+標(biāo)液與5 mL的磷酸鹽緩沖液(pH 6)，與20 μg·mL-1發(fā)光碳點(diǎn)納米材料溶液等量混合4 min后進(jìn)行熒光檢測(cè)。由表1可知，在各加標(biāo)濃度下，回收率在91%～106%(RSD=0.5%～1.5%,n=3)之間，方法重現(xiàn)性好。

表1 飲用水樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)(n=3)Table 1 Recoveries of Hg2+ detection fromspiked drinking water samples by CDs

3 結(jié) 論

選用鹽酸多巴胺作碳源、鄰苯二胺為表面修飾劑，探索了低成本具有熒光特性的發(fā)光碳點(diǎn)納米材料的制備及重金屬檢測(cè)應(yīng)用。該發(fā)光碳點(diǎn)納米材料熒光現(xiàn)象明顯，且肉眼可見(jiàn)，發(fā)射波長(zhǎng)在596 nm (λex=532 nm)。實(shí)驗(yàn)中，水熱法快速、廉價(jià)便捷的合成特點(diǎn)得到了體現(xiàn)，合成得到的發(fā)光碳點(diǎn)納米材料在室溫下具有良好的水溶性。此外，產(chǎn)物發(fā)光碳點(diǎn)納米材料可用于Hg2+的高選擇性專(zhuān)一檢測(cè)，發(fā)光碳點(diǎn)納米材料對(duì)Hg2+的檢測(cè)在0.001～10 μg·mL-1范圍內(nèi)符合Stern-Volmer方程，在0～0.04 μg·mL-1以及0.6～10 μg·mL-1范圍內(nèi)，表現(xiàn)出良好的線(xiàn)性響應(yīng)，該碳點(diǎn)材料對(duì)Hg2+檢測(cè)的適用范圍相對(duì)更寬，分析前景更廣。而檢出限為0.000 6 μg·mL-1(S/N=3,n=6)，滿(mǎn)足生活用水(<0.001 mg·L-1)及工業(yè)廢水(<0.005 mg·L-1)中Hg2+檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求。綜上所述，所制備的低成本發(fā)光碳點(diǎn)納米材料實(shí)現(xiàn)了實(shí)際水樣中重金屬Hg2+的快速專(zhuān)一檢測(cè)應(yīng)用，可用于水樣中微痕量Hg2+的檢測(cè)。此外，除了在重金屬污染物監(jiān)測(cè)方面具有良好的前景，經(jīng)細(xì)胞毒性分析驗(yàn)證也同樣表現(xiàn)出其良好的生物安全性，不會(huì)帶來(lái)二次污染，而且有望在示蹤劑、傳感器、生物醫(yī)療等應(yīng)用領(lǐng)域提供技術(shù)支持及安全性保障。