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    胸水細(xì)胞蠟塊與“新鮮”胸水在肺腺癌EGFR基因檢測中的應(yīng)用

    2020-11-06 02:03:02李曉玲黃仲劉美蓮
    海南醫(yī)學(xué) 2020年20期
    關(guān)鍵詞:蠟塊胸水新鮮

    李曉玲,黃仲,劉美蓮

    廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理診斷與研究中心1、腫瘤中心肺部腫瘤病區(qū)2,廣東 湛江 524001

    肺癌是目前全球范圍內(nèi)眾多惡性腫瘤類別中發(fā)病率最高的癌癥,有權(quán)威大規(guī)模統(tǒng)計顯示,中國位居世界肺癌發(fā)病率和病死率的榜首[1],且呈顯著上升的趨勢,已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅中國人群健康的主要公共衛(wèi)生問題之一,備受社會各界關(guān)注。隨著肺癌個體化靶向治療理念的飛躍,2019 版美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(national comprehensive cancer network,NCCN)指南更新,明 確 非 小 細(xì) 胞 肺 癌(nonsmall-cell lung cancer,NSCLC)在治療前應(yīng)檢測基因狀態(tài)[2]。然而遺憾的是,2/3 以上的肺癌患者在確診時已屬晚期,錯過手術(shù)時機(jī),臨床難以獲取腫瘤實體標(biāo)本。作為晚期肺癌患者常見的并發(fā)癥,胸水標(biāo)本的獲取相當(dāng)簡單而安全。采用胸水標(biāo)本進(jìn)行表皮生長因子(epithelial growth factor receptor,EGFR)突變的檢測有兩個路徑,其一是臨床醫(yī)生將即時獲取的“新鮮”胸水樣本直接送到分子病理室檢測,其二是臨床醫(yī)師將獲取的胸水樣本先送到常規(guī)細(xì)胞病理室,由細(xì)胞病理技術(shù)人員制作成細(xì)胞蠟塊,由病理診斷醫(yī)師做好蠟塊切片質(zhì)控(確定有一定量的腫瘤細(xì)胞數(shù))后交由分子病理室進(jìn)一步檢測。從臨床的角度,第一個路徑簡單、方便、快捷,第二個路徑流程較為繁瑣,費(fèi)時較長。那么,從病理精準(zhǔn)的角度,兩個路徑檢測的結(jié)果是否一致?本研究旨在探討胸水細(xì)胞蠟塊與“新鮮”胸水在肺腺癌EGFR基因檢測中的應(yīng)用效果。

    1 材料與方法

    1.1 材料 選取2018 年1 月至2019 年6 月在廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院住院治療的胸腔積液患者67 例,一份胸水常規(guī)涂片及制作成細(xì)胞蠟塊,切片經(jīng)免疫組織化學(xué)染色明確為肺腺癌而進(jìn)一步檢測EGFR(實驗組),另一份“新鮮”胸水直接檢測EGFR(對照組)。每份胸水均為臨床醫(yī)生經(jīng)胸腔穿刺術(shù)現(xiàn)抽即送的合格標(biāo)本。

    1.2 方法

    1.2.1 制備細(xì)胞蠟塊 取胸水100 mL 置于兩管50 mL 離心管內(nèi),離心(5 min,800×g),棄上清液,滴入1~3 滴試劑A,震蕩,使細(xì)胞與試劑A 充分混合,離心(2 min,800×g),取出離心管,棄掉多余上清后滴入2~3滴試劑B,輕晃試管,靜置30 s,待細(xì)胞塊與離心管底部分離,用軟吸管將細(xì)胞塊吸起,轉(zhuǎn)移到包埋紙上包好,置入包埋盒,經(jīng)過固定、脫水,石蠟包埋成細(xì)胞蠟塊,然后切片、蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染色。

    1.2.2 免疫組織化學(xué)法 切片進(jìn)行免疫組化染色,所用一抗CK7、TTF-1、NapsinA 均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司,采用DAKO Omnis公司最新型全自動免疫組化儀進(jìn)行染色,同時設(shè)陰、陽性對照。結(jié)果判定:CK7、NapsinA腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)著色為陽性,TTF-1 腫瘤細(xì)胞胞核著色為陽性。所選病例經(jīng)此三項肺腺癌特異抗體明確診斷。

    1.2.3 EGFR基因突變檢測 細(xì)胞蠟塊切片常規(guī)脫蠟后及新鮮胸水離心處理后沉渣提取DNA。DNA提取試劑盒為廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司的核酸提取試劑盒-FFPE DNA(離心柱型),EGFR 基因檢測試劑盒為廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司的人類EGFR 基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法)。DNA提取完成后采用超微量紫外分光光度計測量其濃度及OD260/OD280,以驗證所提取的DNA 樣本是否合格,驗證合格后上機(jī)進(jìn)行檢測。采用擴(kuò)增阻遏突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system,ARMS)技術(shù)進(jìn)行EGFR 基因突變檢測。應(yīng)用Roche cobas z480 熒光 定量PCR 儀檢測EGFR 基因外顯子18、19、20、21(Exon18-21)上的常見已知突變。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS15.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù),計數(shù)資料以構(gòu)成比或率(%)表示,采用χ2檢驗,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 常規(guī)病理觀察 傳統(tǒng)涂片觀察見癌細(xì)胞團(tuán)(圖1A);胸水制作成細(xì)胞蠟塊做成HE切片觀察,可見癌細(xì)胞排列成腺樣、乳頭狀,有著與實體癌組織相似的空間排列結(jié)構(gòu)(圖1B、1C);切片加做免疫組化指標(biāo)TTF-1、NapsinA、CK7顯示陽性表達(dá),協(xié)助確診肺腺癌(圖1D、1E、1F)。

    圖1 胸水涂片及細(xì)胞蠟塊切片HE染色、免疫組化染色

    2.2 EGFR 檢測結(jié)果 樣本有任一突變類型為EGFR陽性(圖2),無任何突變類型為EGFR陰性(圖3)。檢測結(jié)果顯示,實驗組EGFR 突變陽性42 例,陰性25例,陽性率為62.69%(42/67),而對照組EGFR 突變陽性30 例,陰性37 例,陽性率為44.78%(30/67);兩組同為陽性27 例,同為陰性22 例。胸水細(xì)胞蠟塊陽性率明顯高于“新鮮”胸水,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=67.000,P=0.008<0.05)。

    圖2 EGFR陽性結(jié)果圖

    圖3 EGFR陰性結(jié)果圖

    3 討論

    隨著人類基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、腫瘤生物學(xué)技術(shù)和分子病理學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,研究學(xué)者對肺癌發(fā)病機(jī)制從細(xì)胞、分子、基因水平進(jìn)一步的深入認(rèn)識,持續(xù)不斷推進(jìn)了藥物的研究與開發(fā),肺癌的治療取得了諸多理念上的飛躍,從根本上改變了既往的傳統(tǒng)策略,發(fā)展到精準(zhǔn)分子靶向治療時代。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinaseinhibitors,EGFR-TKIs)靶向用藥在發(fā)生EGFR敏感突變的肺腺癌患者及其他非小細(xì)胞肺癌患者的治療中,取得了顯著效果。用于檢測EGFR 基因突變的首選標(biāo)本為手術(shù)切除的腫瘤組織,其次是經(jīng)皮肺穿刺組織及纖支鏡活檢組織。然而遺憾的是,多數(shù)病例確診時已屬晚期,錯過手術(shù)時機(jī)。作為晚期NSCLC患者的常見并發(fā)癥,高達(dá)60%以上肺癌患者會在病程中出現(xiàn)胸水,約15%肺癌患者于確診時就已出現(xiàn)胸水[3],且臨床上常呈難以遏制、進(jìn)行性加重的表現(xiàn),隨著病情的進(jìn)展,患者很快就出現(xiàn)胸痛、氣短、不能臥躺等癥狀,嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量。而并發(fā)惡性胸水的晚期肺癌患者難以獲取腫瘤的實體活檢組織,相對而言,胸水的獲得則較為容易。此時應(yīng)用胸水不僅能夠做病理的常規(guī)診斷,還能夠檢測EGFR 基因突變,有助于臨床評估靶向藥的選用,以及判斷耐藥機(jī)制等,從而更精準(zhǔn)的制定個體化診療方案。所以,對于無法獲取組織標(biāo)本檢測EGFR 突變的患者而言,通過獲取胸水檢測不失為一個不錯的選擇。

    EGFR 是細(xì)胞膜上的一種跨膜糖蛋白,屬于酪氨酸激酶型受體,表達(dá)于正常上皮細(xì)胞表面,而在一些腫瘤細(xì)胞中常常過表達(dá),與腫瘤的轉(zhuǎn)移、浸潤、預(yù)后相關(guān)。檢測非小細(xì)胞肺癌患者EGFR 基因的突變狀態(tài),具有舉足輕重的臨床意義,是評估患者能否應(yīng)用EGFR-TKIs 靶向治療的先決條件[4]。隨著分子病理技術(shù)的進(jìn)步和現(xiàn)階段胸水處理方法的完善,應(yīng)用胸水檢測EGFR 基因突變已成為評估NSCLC 患者EGFR 基因突變狀況的重要途徑,為臨床篩選適合應(yīng)用EGFR-TKI治療的患者提供關(guān)鍵的參考價值。

    而為了明確肺癌的診斷及其分型,以及后續(xù)精準(zhǔn)治療方案的制定,務(wù)必有效保存胸水中可能極其有限的腫瘤細(xì)胞。通過常規(guī)細(xì)胞學(xué)病理技術(shù),除了傳統(tǒng)涂片觀察,還可以將胸水制作成細(xì)胞蠟塊,做成HE 切片,不僅能夠直觀看到腫瘤細(xì)胞與實體腫瘤組織相似的空間排列結(jié)構(gòu),還可以加做一些免疫組化指標(biāo),協(xié)助腫瘤分型確診。李銳等[5]的研究顯示胸水細(xì)胞蠟塊EGFR 突變陽性率與手術(shù)標(biāo)本相當(dāng),MIYOSHI 等[6]和ZHOU等[7]強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞蠟塊的診斷價值,王雙雙等[8]也肯定了細(xì)胞蠟塊的重要意義。本研究表明,結(jié)合胸水細(xì)胞蠟塊和免疫組化結(jié)果不僅可明確肺腺癌診斷,在做好切片質(zhì)控(確保一定量的腫瘤細(xì)胞數(shù))后進(jìn)行EGFR檢測,陽性率比“新鮮”胸水直接檢測EGFR的陽性率更高,是更為可靠的檢測路徑。尤其是在未能開展基因檢測的基層單位,“新鮮”胸水中腫瘤細(xì)胞的“保鮮”時間十分有限,其攜帶的生物學(xué)信息極易降解、丟失,從而可能出現(xiàn)假陰性,而將胸水制作成細(xì)胞蠟塊后,腫瘤細(xì)胞攜帶的生物學(xué)信息可長久保存,后續(xù)再送上級單位檢測則變得可靠,行之有效,值得推廣。

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