核酸適配體sgc8 在急性白血病診斷中的應(yīng)用研究

徐康力，馬亞妮，王筱金，苗彥彥，韓 達(dá)#，譚蔚泓#

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)研究院，上海200127；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部兒童血液腫瘤重點實驗室，上海200127；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床研究中心生物統(tǒng)計學(xué)教研室，上海 200025

急性白血?。╝cute leukemia，AL）是一類起源于造血系統(tǒng)的惡性疾病，主要包括急性髓系細(xì)胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）和急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia ，ALL），成人主要罹患AML，而兒童主要罹患ALL[1]。AL 的病死率較高[2]，是一類對人類健康威脅較大的疾病。

多色流式細(xì)胞術(shù)具有高通量、高靈敏度、低檢測限等特點，是對白血病進(jìn)行免疫分型和微小殘留?。∕RD）監(jiān)測的重要方法[3-4]。該方法主要用于尋找腫瘤細(xì)胞的特征性標(biāo)志物，然而并非每個患者都能利用現(xiàn)有的抗體組合找到，而即便有特征性的抗原表達(dá)，也可能存在抗原漂移現(xiàn)象，即腫瘤細(xì)胞的免疫表型可能會在疾病發(fā)展過程中發(fā)生變化導(dǎo)致無法追蹤[3,5]，但可通過增加抗體的數(shù)量來降低這種不利影響[6]。因此，許多新型抗體被開發(fā)出來用于流式細(xì)胞術(shù)的AL 診斷[7]。然而，這些抗體的數(shù)量有限，并且從發(fā)現(xiàn)到應(yīng)用的周期很長，如用于AML 診斷的免疫分型抗體組合在過去20 年幾乎沒有改變，限制了流式細(xì)胞術(shù)在AL 診斷中的應(yīng)用[7]。

核酸適配體是一類人工篩選、合成、可修飾的寡核苷酸鏈，它通過形成特定的空間結(jié)構(gòu)與靶分子或目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合，具有類似抗體的特異性[8]。利用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化（systematic evolution of ligand and by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)，可以將核酸適配體的篩選與生產(chǎn)時間控制在2 ～8 周，而抗體的生產(chǎn)時間長達(dá)6 個月以上，因此它代表了一種能夠快速開發(fā)針對靶標(biāo)的新型配體技術(shù)[9-11]。與抗體相比，篩選出的核酸適配體具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、批間差異小、易于修飾、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，在多種診斷研究中備受關(guān)注[9]。Shangguan 等[12]利用細(xì)胞之間抗原表達(dá)的差異，篩選出具有T-ALL 細(xì)胞株CEM 細(xì)胞特異性的核酸適配體sgc8，其靶標(biāo)為蛋白酪氨酸激酶7（protein tyrosine kinase，PTK7）[13-16]。Yu 等[14]利 用sgc8開發(fā)了一種高靈敏檢測器用于白血病早期診斷。Mironov等[15]用金屬同位素標(biāo)記sgc8，用于質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)對白血病細(xì)胞的檢測。然而尚未見將核酸適配體作為診斷工具，直接用于流式細(xì)胞術(shù)對AL 樣本檢測的報道。本研究利用核酸適配體sgc8 在流式細(xì)胞儀上直接對AL 骨髓樣本進(jìn)行檢測，以研究其對不同骨髓細(xì)胞群的識別能力，探究sgc8 在急性白血病診斷中的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象

人急性T 淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）細(xì)胞株CEM 細(xì)胞及人慢性髓系細(xì)胞白血?。╟hronic myeloid leukemia ，CML）細(xì)胞株K562 細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。白血病骨髓樣本來自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心，保存于肝素抗凝管中，骨髓樣本獲取和使用符合醫(yī)院倫理委員會要求。共收集4 組共83 例樣本，包括AML 樣本45 例、T-ALL 樣本19 例、B-ALL 樣本9 例，正常樣本10 例。所有樣本均進(jìn)行了骨髓形態(tài)學(xué)分析和流式細(xì)胞白血病免疫分型鑒定。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（編號：RA-2019-070）。

1.2 試劑與儀器

清洗液[ 含有4.5 g/L 葡萄糖及5 mmol/L MgCl2的杜氏磷酸緩沖液（Dulbecco's phosphate-buffered saline，DPBS） ]，結(jié)合緩沖液[含有0.1 mg/mL 酵母轉(zhuǎn)移核糖核酸（tRNA）及1 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）的清洗液]，均由實驗室配制。Gibco DPBS（1×）、Gibco RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）均購自美國Thermo Fisher 公司。離心管、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、一次性移液管均購自美國Corning 公司。單克隆抗體CD7 PE（phycoerythrin）、CD45 PerCP（peridinin-chlorophyllprotein complex）、CD19 APC（allophycocyanin）、CD33 APC、CD34 APC、IgG1 APC、HLA-DR APC-H7（allophycocyanin-Hilite?7）、細(xì)胞裂解液BD Pharm LyseTMLysing Buffer（主要成分為NH4Cl 溶液）以及流式細(xì)胞儀 BD FACS Canto II 購自美國BD 公司；單克隆抗體PTK7 APC 購自德國Miltenyi 公司；MgCl2溶液（濃度為1 mol/L）、葡萄糖、BSA 均購自美國Invitrogen 公司。酵母tRNA 購自上海邁基生物技術(shù)有限公司；離心機(jī)和微量加樣槍購自德國Eppendorf 公司；血細(xì)胞計數(shù)板購自上海市求精生化試劑儀器有限公司；3D 混勻器購自江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司 。

1.3 研究方法

1.3.1 核酸適配體的合成、保存及使用 核酸適配體sgc8 及其對照隨機(jī)文庫鏈（Lib）的核酸序列見表1。核酸適配體經(jīng)5-羧基熒光素（5-carboxyfluorescein，F(xiàn)AM）標(biāo)記，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。合成產(chǎn)物為粉末狀，用三蒸水將其溶解成濃度為10 μmol/L 的溶液，并根據(jù)使用量進(jìn)行分裝，分裝的核酸適配體溶液保存于-20 ℃冰箱內(nèi)，使用全程避光。

表1 適配體的核酸序列Tab 1 Aptamer nucleic acid sequence

1.3.2 白血病細(xì)胞株的培養(yǎng)及其與核酸適配體、PTK7 抗體的結(jié)合試驗 CEM 和K562 細(xì)胞均培養(yǎng)在含有10% FBS的 1640 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為 37 ℃、5% CO2。取培養(yǎng)的細(xì)胞，用清洗液洗滌2 次，離心條件為300×g5 min，再用結(jié)合緩沖液重懸，取3×105細(xì)胞加入EP 管中，再用結(jié)合緩沖液補(bǔ)足至194 μL 后，加入6 μL 10 μmol/L 核酸適配體溶液，使反應(yīng)總體積為200 μL，核酸適配體終濃度為300 nmol/L。EP 管在4 ℃條件下置于3D 混勻器上避光孵育30 min 后，用清洗液洗滌2 遍，最后用200 μL 清洗液重懸，置于冰上避光，等待流式細(xì)胞儀檢測。

培養(yǎng)細(xì)胞洗滌后，用1×DPBS 溶液重懸后計數(shù)，取2×105細(xì)胞加入流式管中，再加入1 μL APC 標(biāo)記的PTK7抗體，混勻后避光孵育15 min，用2 mL 1×DPBS 溶液洗滌1 遍后，離心沉淀用200 μL 1× DPBS 溶液重懸，置于冰上避光，等待流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.3 骨髓樣本細(xì)胞與核酸適配體結(jié)合試驗 將模擬的白血病骨髓樣本細(xì)胞（白血病細(xì)胞CEM 或K562 分別與正常骨髓細(xì)胞，按照2:1 的比例混合）及不同組的骨髓樣本細(xì)胞計數(shù)后取一定量細(xì)胞，分別用1×紅細(xì)胞裂解液處理，室溫孵育15 min，300×g離心5 min 后，通過清洗液洗滌2 遍，去除紅細(xì)胞。獲得的骨髓有核細(xì)胞用結(jié)合緩沖液重懸，取3×105細(xì)胞加入EP 管中，再用結(jié)合緩沖液補(bǔ)足至188 μL，再加入6 μL 10 μmol/L 核酸適配體溶液及6 μL 骨髓樣本對應(yīng)的骨架抗體組合（表2），使反應(yīng)終體積為200 μL，核酸適配體終濃度為300 nmol/L。EP 管在4 ℃條件下置于3D 混勻器上避光孵育30 min 后，用清洗液洗滌2 次，去除未結(jié)合的抗體后，用200 μL 清洗液重懸，置于冰上等待。

表2 不同骨髓樣本的骨架抗體組合Tab 2 Backbone antibody panels for bone marrow samples

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測與分析 用BD Canto II 流式細(xì)胞儀和BD FACS Diva 8.0 軟件獲取細(xì)胞，通過SSC/CD45 設(shè)門識別有核細(xì)胞：模擬及臨床急性白血病骨髓細(xì)胞樣本，收集有核細(xì)胞2 萬個；正常骨髓樣本，收集有核細(xì)胞5 萬個。流式細(xì)胞儀有3 種激光8 個通道，各通道設(shè)置的電壓和補(bǔ)償條件與臨床白血病免疫分型所采用的條件相同。BD FACS Diva 8.0 和Flowjo10.4 軟件進(jìn)行流式細(xì)胞的數(shù)據(jù)分析。

因熒光素FAM 與異硫氰酸熒光素（FITC）發(fā)射光波長類似，收集的細(xì)胞經(jīng)骨架抗體組合分群后，分別在含有核酸適配體sgc8 的實驗管（sgc8 管）及含有隨機(jī)文庫鏈Lib 的對照管（Lib 管）中，檢測其在FITC 通道中的信號。以細(xì)胞群在Lib 管的熒光信號為參照設(shè)置陽性門，使Lib 管中細(xì)胞群95%以上的細(xì)胞在該陽性門外，再記錄sgc8 管中陽性門內(nèi)的細(xì)胞百分比。sgc8 結(jié)合陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：同一群細(xì)胞在sgc8 管與Lib 管內(nèi)陽性門的百分比差值（d值） ＞20%。值得注意的是，同樣的標(biāo)本在不同的檢測系統(tǒng)內(nèi)，平均熒光強(qiáng)度（median fluorescence intensity，MFI）是不同的，不具備可比性，所以在本實驗中并未采用該值作為研究對象。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SAS 9.4 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。定性數(shù)據(jù)用n（%） 表示，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用Kruskal-Wallis 檢驗。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白血病細(xì)胞株P(guān)TK7 蛋白的表達(dá)水平

核酸適配體sgc8 識別的靶標(biāo)為PTK7 蛋白[13]，因此本研究使用了PTK7 蛋白高表達(dá)的CEM 細(xì)胞株和PTK7蛋白低表達(dá)的K562 細(xì)胞株。為了明確白血病細(xì)胞株CEM細(xì)胞和K562 細(xì)胞PTK7 蛋白的表達(dá)情況，本研究用PTK7抗體及同型對照對2 株細(xì)胞進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，CEM細(xì)胞高表達(dá)PTK7 蛋白，而K562 細(xì)胞低表達(dá)或不表達(dá)PTK7 蛋白（圖1）。

2.2 sgc8 對白血病細(xì)胞株的識別能力

為了研究核酸適配體檢測骨髓樣本方法的有效性，我們在正常骨髓細(xì)胞樣本中，分別加入PTK7 蛋白高表達(dá)的CEM 細(xì)胞及其陰性對照K562 細(xì)胞（PTK7 蛋白低表達(dá)），制成模擬的白血病骨髓樣本，來探究核酸適配體sgc8 在骨髓樣本中對2 種細(xì)胞是否仍具有不同的識別能力。本研究按照核酸適配體對骨髓樣本的檢測流程，對樣本用紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行處理，去除紅細(xì)胞；然后，洗滌制成細(xì)胞懸液，再將其與核酸適配體、對應(yīng)骨架抗體組合一起置于4 ℃冰箱避光孵育30 min，利用流式細(xì)胞儀對洗滌后的細(xì)胞懸液進(jìn)行檢測（圖2）。

我們通過骨架抗體組合區(qū)分腫瘤細(xì)胞群與正常細(xì)胞群，并檢測它們在Lib 管和sgc8 管內(nèi)FITC 通道信號偏移情況。我們發(fā)現(xiàn)，在加有CEM 細(xì)胞的骨髓樣本中，腫瘤細(xì)胞（CD7+CD33-CD45strongSSCmedium）在sgc8 管較Lib 管有明顯的信號偏移，而樣本內(nèi)其他細(xì)胞未見明顯偏移（圖3）。 同時，在加有對照細(xì)胞K562 細(xì)胞的骨髓樣本中，腫瘤細(xì)胞（CD7-CD33+CD45strongSSCmedium）與其他正常細(xì)胞在sgc8 管較Lib 管均未見明顯偏移（圖4）。結(jié)果顯示：sgc8 可以在骨髓細(xì)胞樣本中特異性識別靶細(xì)胞CEM 細(xì)胞，而不識別對照細(xì)胞K562 細(xì)胞及其他成熟細(xì)胞群。結(jié)果提示，核酸適配體sgc8 在骨髓樣本中對2 種細(xì)胞仍具有不同的識別能力。

圖1 CEM 細(xì)胞與K562 細(xì)胞的PTK7 蛋白表達(dá)水平Fig 1 Expression level of PTK7 protein in CEM cells and K562 cells

圖2 核酸適配體和抗體的骨髓樣本檢測流程Fig 2 Detection procedure of bone marrow samples using aptamers and antibodies

圖3 sgc8 在模擬白血病骨髓樣本中識別CEM 細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果Fig 3 Recognition of sgc8 to CEM cells in the normal bone marrow sample mixed with CEM cells by flow cytometry

圖4 sgc8 在模擬白血病骨髓樣本中未識別K562 細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果Fig 4 Recognition of sgc8 to K562 cells in the normal bone marrow sample mixed with K562 cells by flow cytometry

2.3 核酸適配體sgc8 對髓系原始細(xì)胞的特異性識別能力

本研究中，為了驗證sgc8 對正常骨髓樣本內(nèi)各群細(xì)胞的識別能力是否存在差異，我們利用骨架抗體組合及SSC、FSC 2 個參數(shù)，對正常骨髓樣本中的細(xì)胞進(jìn)行分群，如圖5A 所示，共分為6 群細(xì)胞：髓系原始細(xì)胞Blast 細(xì)胞（CD33+CD34+CD45-SSClow）、 早 前B 細(xì) 胞（Pro-B 細(xì)胞，CD19+CD33-CD34+CD45+SSClow）、前B 細(xì)胞（Pre-B細(xì)胞，CD19+CD33-CD34+CD45+SSClow）、成熟淋巴細(xì)胞（CD33-CD34-CD45strongSSClow）、成熟粒細(xì)胞（CD33+CD34-CD45+SSChigh）及單核細(xì)胞（CD33+CD34-CD45+SSCmedium）。然后，利用各群細(xì)胞在Lib 管FITC 通道設(shè)置陽性門，分別檢測其在sgc8 管及Lib 管內(nèi)陽性門的百分比，結(jié)果如圖5B 所示，并計算兩者d值。如圖5C 所示，我們發(fā)現(xiàn)，正常骨髓樣本內(nèi)，各群細(xì)胞d值的中位數(shù)分別為：Blast 細(xì)胞（65.85%） ＞Pro-B 細(xì)胞（9.45%） ＞ 成熟單核細(xì)胞（3.60%）＞ 成熟粒細(xì)胞（1.30%） ＞ Pre-B 細(xì)胞（0.60%） ＞ 成熟淋巴細(xì)胞（0.35%），Blast 細(xì)胞的d值顯著高于其他細(xì)胞的d值，包括與它同為CD34+的Pro-B 細(xì)胞，且它們之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。同時，對sgc8 結(jié)合陽性率的研究顯示，Blast 細(xì)胞在10 個樣本中有9 個具有sgc8 結(jié)合陽性，具有較高陽性率（9/10，90.0 %），其余細(xì)胞僅1 例Pro-B 細(xì)胞出現(xiàn)陽性，該類細(xì)胞陽性率為（1/8，12.5%），而其他各群細(xì)胞均未見sgc8 結(jié)合陽性。結(jié)果顯示，sgc8在正常骨髓細(xì)胞樣本中，對Blast 細(xì)胞具備特異性識別能力，而對其他早期和成熟細(xì)胞無顯著識別能力。

2.4 核酸適配體sgc8 對AML 樣本內(nèi)腫瘤細(xì)胞的特異性識別能力

為了研究sgc8 對AML 樣本內(nèi)各群細(xì)胞的識別能力，我們對AML 骨髓樣本中的腫瘤細(xì)胞（AML 細(xì)胞）、成熟淋巴細(xì)胞、成熟粒細(xì)胞的結(jié)果進(jìn)行了研究，并同時對比了AML 細(xì)胞與正常骨髓Blast 細(xì)胞（CD33+CD34+CD45+SSClow）的結(jié)果。利用在Lib 管FITC 通道設(shè)置的陽性門，我們分別檢測了各群細(xì)胞在sgc8 管及Lib 管內(nèi)陽性門的百分比，結(jié)果如圖6A 所示；計算兩者d值，如圖6B 所示，我們發(fā)現(xiàn)，AML 樣本內(nèi)各群細(xì)胞d值的中位數(shù)為：AML 細(xì)胞（37.50%） ＞成熟淋巴細(xì)胞（2.30%） ＞成熟粒細(xì)胞（1.70%）。AML 細(xì)胞的d值顯著高于與其樣本內(nèi)的成熟淋巴細(xì)胞和成熟粒細(xì)胞的d值，且它與后兩者之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。盡管AML 細(xì)胞的d值與Blast 細(xì)胞的d值相比，后者的中位數(shù)（65.85%）要顯著高于前者的中位數(shù)，但它們之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.067）。同時，針對sgc8 結(jié)合陽性率的研究也顯示，在45 個AML 骨髓樣本中，有36 個樣本的AML 細(xì)胞顯示出sgc8 結(jié)合陽性，陽性率為80.0%（36/45），接近正常骨髓Blast 細(xì)胞的結(jié)果（90.0%）；而此結(jié)果也遠(yuǎn)高于成熟淋巴細(xì)胞和成熟粒細(xì)胞的sgc8 結(jié)合陽性率，它們分別為2.2%和2.6%。結(jié)果表明，sgc8 在AML 骨髓細(xì)胞樣本中對AML 細(xì)胞具有特異性識別能力，而對其他細(xì)胞群未見明顯識別；但它對AML 細(xì)胞的識別能力與對正常骨髓Blast 細(xì)胞的識別能力之間沒有差別。

圖6 核酸適配體sgc8 對AML 骨髓樣本內(nèi)各細(xì)胞群及正常骨髓Blast 細(xì)胞的識別Fig 6 Recognition of each cell population of AML samples and blast cells of normal bone marrow samples by aptamer sgc8

為了研究sgc8 對AML 各亞型腫瘤細(xì)胞的識別能力是否存在差異，我們根據(jù)骨髓形態(tài)學(xué)的結(jié)果，將AML 腫瘤細(xì)胞（AML 細(xì)胞）分為6 個亞型：急性粒細(xì)胞白血病未分化與部分分化型（M1/M2）、急性早幼粒細(xì)胞白血?。∕3）、急性粒單核細(xì)胞白血?。∕4）、急性單核細(xì)胞白血病（M5）、急性巨核細(xì)胞白血病（M7）及未明確類型（NK），我們比較了它們d值的差異。如圖7 所示，我們發(fā)現(xiàn)，各亞型AML 細(xì)胞d值的中位數(shù)為：M7（66.70%） ＞ M4（56.25%） ＞ NK（39.55%） ＞ M3（29.60%） ＞ M5（27.95%） ＞ M1/M2（20.20 %）。為了研究這些數(shù)據(jù)之間的差異是否存在統(tǒng)計學(xué)意義，我們以M1/M2 細(xì)胞的d值為參照進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅M7 細(xì)胞的d值與它之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.006）；而與其他AML 細(xì)胞亞型之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義：M3（P=0.914），M4（P=0.233），M5（P=0.635），NK（P=0.102）。鑒 于M3、M4 細(xì) 胞 標(biāo)本數(shù)較少，NK 細(xì)胞未明確類型，我們著重比較了M1/M2、M5、M7 之間d值的差異，發(fā)現(xiàn)它們?nèi)咧g的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.027）。究其原因，我們又對M5、M7 的d值進(jìn)行比較，結(jié)果顯示它們之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.032）。結(jié)果表明，sgc8 對M7 細(xì)胞的識別能力顯著高于M1/M2 及M5 細(xì)胞，而后兩者之間無明顯差別。同時，我們也研究了各亞型AML 細(xì)胞的sgc8 結(jié)合陽性率，結(jié)果表明，除了樣本量較少的M3、M4 和不確定的NK 細(xì)胞均為100%外，sgc8 對M7 細(xì)胞的識別陽性率也為100 %，大于M5 細(xì)胞的68.8 %及M1/M2 細(xì)胞的53.3%（P≥0.05）。結(jié)果表明，除M7 外，sgc8 對其余亞型AML 細(xì)胞的識別無顯著差別，且對M7 的識別能力顯著高于M1/M2 及M5 細(xì)胞。

圖7 核酸適配體sgc8 對AML 各亞型腫瘤細(xì)胞的識別Fig 7 Recognition of cancer cells in various AML subtypes by aptamer sgc8

2.5 核酸適配體sgc8 對T-ALL 樣本內(nèi)腫瘤細(xì)胞的特異性識別能力

為了研究sgc8 對T-ALL 骨髓樣本內(nèi)各群細(xì)胞的識別能力是否存在差異，我們對樣本內(nèi)的腫瘤細(xì)胞（T-ALL 細(xì)胞）、成熟淋巴細(xì)胞、成熟粒細(xì)胞的結(jié)果進(jìn)行了研究，并同時對比了正常骨髓樣本中的成熟淋巴細(xì)胞。如圖8 所示，我們發(fā)現(xiàn)，各群細(xì)胞在sgc8 管與Lib 管陽性門內(nèi)d值的中位數(shù)為：T-ALL 細(xì)胞（35.40%） ＞ T-ALL 中成熟粒細(xì)胞（2.50%） ＞ T-ALL 中成熟淋巴細(xì)胞（2.10%） ＞ 正常骨髓成熟淋巴細(xì)胞（0.35%）。T-ALL 細(xì)胞的d明顯高于其樣本內(nèi)的成熟淋巴細(xì)胞、成熟粒細(xì)胞及正常骨髓成熟淋巴細(xì)胞的d值，且它們之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。同時，在sgc8 結(jié)合陽性率方面，19 個樣本中，有14個樣本的T-ALL 細(xì)胞表現(xiàn)結(jié)合陽性，陽性率為78.9%（14/19），而其他細(xì)胞則未見sgc8 結(jié)合陽性。結(jié)果表明，sgc8 在T-ALL 骨髓細(xì)胞樣本中可以特異性識別T-ALL 細(xì)胞，而不識別樣本內(nèi)的其他成熟細(xì)胞群。

為了研究sgc8 對不同亞型T-ALL 腫瘤細(xì)胞的識別能力是否存在差異，我們從T-ALL 中分出一類特別的亞型，即早前T 淋巴細(xì)胞白血?。╡arly T-cell precursor lymphoblastic leukaemia，ETP）。 根 據(jù)WHO 的 分 類 標(biāo)準(zhǔn)，T-ALL 樣本免疫表型特征為CD7 陽性、胞質(zhì)CD3陽性。ETP 腫瘤細(xì)胞的免疫表型為CD1a 和CD8 陰性，CD5 陰性或者弱陽性（弱陽性指的是腫瘤細(xì)胞陽性率低于75.00%），胞膜CD3 陰性（極少數(shù)情況CD3 陽性），同時至少表達(dá)1 種下列抗原：CD34、CD117、HLA-DR、CD13、CD33、CD11b、CD65[17]。我們比較了常規(guī)T-ALL與ETP 腫瘤細(xì)胞在sgc8 管及Lib 管內(nèi)陽性門d值的情況。如圖9 所示，我們發(fā)現(xiàn)，ETP 中的腫瘤細(xì)胞（ETP 細(xì)胞）與T-ALL 中的腫瘤細(xì)胞（T-ALL 細(xì)胞）的d值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P≥0.05）；且對sgc8 結(jié)合陽性率的研究也表明，ETP 細(xì)胞與T-ALL 細(xì)胞也有類似的陽性率，兩者分別為75.00%和73.30%。結(jié)果表明，sgc8 對不同亞型T-ALL 的識別能力沒有顯著差異。

圖8 核酸適配體sgc8 對T-ALL 骨髓樣本內(nèi)各細(xì)胞群及正常骨髓淋巴細(xì)胞的識別Fig 8 Recognition of each cell population in T-ALL samples and mature lymphocytes in normal bone marrow samples by aptamer sgc8

圖9 核酸適配體sgc8 對ETP 細(xì)胞與T-ALL 細(xì)胞的識別Fig 9 Recognition of ETP cells and T-ALL cells by aptamer sgc8

2.6 核酸適配體sgc8 對B-ALL 樣本內(nèi)各群細(xì)胞的識別 能力

為了研究sgc8 對B-ALL 骨髓樣本內(nèi)各群細(xì)胞的識別能力是否存在差異，我們對樣本內(nèi)的腫瘤細(xì)胞（B-ALL 細(xì)胞）、成熟淋巴細(xì)胞、成熟粒細(xì)胞進(jìn)行了比較研究，并同時對比了正常骨髓中的早期B 系細(xì)胞Pro-B 細(xì)胞和Pre-B 細(xì)胞。如圖10 所示，我們發(fā)現(xiàn)，各群細(xì)胞在sgc8 管與Lib 管陽性門內(nèi)d值的中位數(shù)為：Pro-B 細(xì)胞（9.45%） ＞ B-ALL 細(xì)胞（6.50%） ＞B-ALL 中的成熟淋巴細(xì)胞（1.20%） ＞Pre-B 細(xì)胞（0.60%） ＞ B-ALL 中的成熟粒細(xì)胞（0）。B-ALL 細(xì)胞與其樣本內(nèi)的成熟淋巴細(xì)胞和正常骨髓中的Pro-B 細(xì)胞d值之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.102，P=0.386）；而B-ALL與其樣本內(nèi)的成熟粒細(xì)胞及正常骨髓Pre-B 細(xì)胞之間的d值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002，P=0.028）。然而，各群細(xì)胞sgc8 識別陽性率研究顯示，B-ALL 細(xì)胞、B-ALL 樣本內(nèi)的成熟粒細(xì)胞均未見與sgc8 結(jié)合，而B-ALL 樣本中的成熟淋巴細(xì)胞僅有12.5 %的陽性率。結(jié)果表明，sgc8 對B-ALL骨髓樣本內(nèi)的各群細(xì)胞無顯著識別能力。

圖10 核酸適配體sgc8 對B-ALL 骨髓樣本內(nèi)各細(xì)胞群及正常骨髓不成熟B 細(xì)胞的識別Fig 10 Recognition of each cell population in B-ALL samples and immature B cells in normal bone marrow samples by aptamer sgc8

2.7 核酸適配體sgc8 對不同AL 腫瘤細(xì)胞及正常骨髓（CD34+）早期細(xì)胞的識別能力差異

圖11 核酸適配體sgc8 對各類AL 腫瘤細(xì)胞及正常骨髓（CD34+）早期細(xì)胞的識別Fig 11 Recognition of cancer cells in various AL cells and CD34+ cells in normal bone marrow samples by aptamer sgc8

為了研究sgc8 在各類AL 細(xì)胞及正常骨髓（CD34+）早期細(xì)胞識別能力方面的差異，我們對AML 細(xì)胞、T-ALL 細(xì)胞、B-ALL 細(xì)胞及正常骨髓中CD34+的Blast細(xì)胞、Pro-B 細(xì)胞進(jìn)行了研究。我們以Blast 細(xì)胞為對照，比較了各群細(xì)胞在sgc8 管與Lib 管陽性門內(nèi)的d值。如圖11 所示，我們發(fā)現(xiàn)，各群d值的中位數(shù)為：Blast細(xì) 胞（65.85%） ＞ AML 細(xì) 胞（37.50%） ＞ T-ALL 細(xì) 胞（35.40%） ＞ Pro-B 細(xì)胞（9.45%） ＞ B-ALL 細(xì)胞（6.50%）。前三者的d值顯著高于后兩者，但在Blast 細(xì)胞與AML 細(xì)胞（P=0.067）和T-ALL 細(xì)胞（P=0.067）d值之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而T-ALL 細(xì)胞與B-ALL 細(xì)胞（P=0.000）及Pro-B 細(xì)胞（P=0.001）的d值之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。同時，針對sgc8 結(jié)合陽性率的研究顯示，AML 細(xì)胞、T-ALL 細(xì)胞及Blast 細(xì)胞均有較高的sgc8 識別陽性率，而B-ALL 細(xì)胞和Pro-B 細(xì)胞的陽性率較低。結(jié)果表明，sgc8 對AML 細(xì)胞、T-ALL 細(xì)胞及Blast 細(xì)胞具有較高的識別能力，且它們之間無顯著差異；而sgc8 對B-ALL 細(xì)胞及Pro-B 細(xì)胞無顯著識別能力。

3 討論

Shangguan 等[13]通過質(zhì)譜分析的方法確定核酸適配體sgc8 主要靶標(biāo)為PTK7 蛋白，并將PTK7 確定為T-ALL 的潛在生物標(biāo)志物。Prebet 等[18]的研究表明，在AML 骨髓樣本中，有72%的AML 細(xì)胞表達(dá)PTK7 蛋白。Jiang 等[19]的后續(xù)研究表明，在正常骨髓中，PTK7 蛋白表達(dá)在髓系前體細(xì)胞（CD34+CD117+）上，而較少在不成熟的B 細(xì)胞上表達(dá)；在3 種主要的AL（AML、B-ALL、T-ALL）中均觀察到PTK7 蛋白表達(dá)的變化，且PTK7 蛋白的表達(dá)水平在AML 細(xì)胞和正常骨髓中的對照細(xì)胞（Blast 細(xì)胞）之間無差異，PTK7 蛋白的表達(dá)水平也同樣在B-ALL 細(xì)胞與正常骨髓不成熟B 細(xì)胞之間無差異，但PTK7 蛋白在T-ALL 上高表達(dá)，可與其他T 細(xì)胞標(biāo)志物一起用作骨髓T-ALL 的檢測標(biāo)志物。

本研究基于核酸適配體的流式細(xì)胞術(shù)，利用核酸適配體sgc8 對AL 樣本及正常的骨髓樣本各群細(xì)胞進(jìn)行檢測。我們發(fā)現(xiàn)，sgc8 在T-ALL 和AML 骨髓樣本中，對腫瘤細(xì)胞具有特異性識別能力，而在B-ALL 骨髓中，對各類細(xì)胞均未見顯著識別；同時，在正常骨髓中，sgc8 對Blast細(xì)胞具有特異性識別能力，而對早期B 細(xì)胞（Pro-B 和Pre-B 細(xì)胞）及其他成熟細(xì)胞均無顯著識別能力；并且，sgc8 對AML 細(xì)胞和正常骨髓Blast 細(xì)胞的識別無顯著差異，對B-ALL 細(xì)胞和正常骨髓早期B 細(xì)胞的識別也無顯著差異。以上結(jié)果與既往報道的PTK7 抗體研究結(jié)果較為一致。此外，在AML 各亞型的腫瘤細(xì)胞中，sgc8 對M7細(xì)胞的識別陽性率要高于其他亞型細(xì)胞，而在其他亞型腫瘤細(xì)胞之間，sgc8 的識別能力并沒有差異。

我們的研究提示，核酸適配體sgc8 在AML、T-ALL和正常骨髓樣本中具有特異性識別能力，而對B-ALL 樣本無顯著識別，且對不同AML 亞型可能具有不同的診斷價值，可以考慮作為AL 的輔助診斷標(biāo)志。本研究是第一次將核酸適配體應(yīng)用到AL 臨床樣本檢測，研究表明核酸適配體sgc8 在臨床樣本中的檢測結(jié)果與報道的PTK7 抗體的檢測結(jié)果較為一致。與抗體相比，核酸適配體有較短的開發(fā)和生產(chǎn)周期、較低的生產(chǎn)成本、易于人工合成和修飾、批間差異小、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等特點[9]，使它更易于被臨床應(yīng)用，而成為一類具有臨床應(yīng)用前景的診斷工具。近年來可用于白血病相關(guān)診療的核酸適配體也不斷出現(xiàn)，如Cibiel 等[20]篩選出針對膜聯(lián)蛋白A2（Annexin A2）的適配體。據(jù)報道，Annexin A2 在急性早幼粒細(xì)胞白血病[21]和MLL 重排的嬰兒ALL[22]中都高度表達(dá)。Joo等[23]報道了核仁蛋白（nucleolin，NCL）的特異性適配體AS1411，可能用于高表達(dá)NCL 的急性前體B 淋巴細(xì)胞白血病（pre-B ALL）的治療。可見，核酸適配體不僅可以作為診斷工具用于白血病免疫分型和MRD 監(jiān)測，還可以開發(fā)成為靶向治療藥物。由于樣本和時間的限制，本研究僅涉及了核酸適配體sgc8，但實驗結(jié)果表明這種新型診斷工具在應(yīng)用前景上具有價值。未來將會有更多具有特異性靶標(biāo)的核酸適配體用于AL 的流式細(xì)胞學(xué)診斷，并結(jié)合患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險分級和預(yù)后評估，以期發(fā)現(xiàn)其更多的臨床應(yīng)用價值。

參·考·文·獻(xiàn)

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