五大連池東焦得布山硫氧化細(xì)菌多樣性及其與環(huán)境因子的關(guān)系

楊磊，張爽，劉濤，晏磊

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

硫氧化過(guò)程是硫元素生物地球化學(xué)循環(huán)中重要組成部分，其中微生物驅(qū)動(dòng)的硫氧化過(guò)程起著極其重要的作用，常由硫氧化細(xì)菌（sulfur-oxidizing bacteria，SOB）催化[1]。SOB是指能夠?qū)⒌蛢r(jià)態(tài)的還原性硫化物或單質(zhì)硫完全氧化為硫酸鹽（SO42-）或部分氧化為更高價(jià)態(tài)的硫化物的細(xì)菌類群?；?6SrRNA基因研究發(fā)現(xiàn)，海洋、熱液口、冷泉、土壤、河流和湖泊等多種環(huán)境存在大量硫氧化細(xì)菌，比如硫桿菌屬、硫微螺菌屬和硫化葉菌屬等[2]。目前研究已發(fā)現(xiàn)大量的SOB的存在，研究較為深入的SOB主要集中在4類：綠硫細(xì)菌、紫硫細(xì)菌、紫色非硫細(xì)菌和無(wú)色硫細(xì)菌。綠硫細(xì)菌中主要包括 Chlorobaculum、Chlorobium、Chloroherpeton和Prosthecochloris等屬的菌株；紫硫細(xì)菌中主要包括 Chromatiaceae科和Ectothiorhodospiraceae科的菌株；紫色非硫細(xì)菌主要包括Rhodospirillaceae、Acetobacteraceae、Rhodobacteraceae、Bradyrhizobiaceae和Hyphomicrobiaceae等科的菌株；無(wú)色硫細(xì)菌主要包括Paracoccus、Thiobac-illus、Acidithiobacillus、Thiomicrospira 和 Thioalkalimicrobium等屬的菌株[3]。目前對(duì)SOB多樣性研究多還采用可培養(yǎng)方法對(duì)其進(jìn)行富集或分離純化并采用16S rDNA/16S rRNA進(jìn)行測(cè)序或其他分子技術(shù)來(lái)得到SOB多樣性信息，但這些方法用來(lái)研究SOB多樣性存在一定局限性。由于SOB的硫氧化過(guò)程是由一系列的酶催化完成，其中soxB基因編碼的硫代硫酸鹽水解酶就是最為關(guān)鍵的酶之一，且目前功能基因在對(duì)特殊功能微生物群落（如SOB）多樣性分析方面具有較大優(yōu)勢(shì)。因此，已有一些研究以soxB用作標(biāo)記基因應(yīng)用于研究各種自然環(huán)境中的SOB多樣性[4-5]。因此，借助功能基因（如soxB基因）分析方法將有助于進(jìn)一步加深認(rèn)識(shí)對(duì)火山環(huán)境SOB群落多樣性及其響應(yīng)環(huán)境因子的變化。

火山環(huán)境是典型的陸地?zé)?、酸性極端環(huán)境，高溫低氧的火山環(huán)境與地球初期環(huán)境極為相近，有著豐富的生物地球化學(xué)循環(huán)（如硫循環(huán)）。因此，研究火山微生物生態(tài)及其參與的元素循環(huán)過(guò)程，對(duì)于探究地球早期生命具有重要作用[6]。另外，火山環(huán)境存在著多種形態(tài)的硫化物，可為SOB生長(zhǎng)和新陳代謝提供能量。但是目前國(guó)內(nèi)外對(duì)火山環(huán)境中SOB多樣性的研究多還是對(duì)火山溫泉中SOB多樣性的調(diào)查，對(duì)火山環(huán)境土壤中SOB多樣性的研究少有報(bào)道[7]。目前，已有大量文章表明微生物群落的組成和多樣性受到環(huán)境理化性質(zhì)的驅(qū)動(dòng)，如溫度、pH、總碳、總氮、一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等[8-10]。五大連池位于黑龍江省西北部，地處小興安嶺山地向松嫩平原過(guò)渡的地帶，屬寒溫帶大陸性季風(fēng)氣候，總面積約為1 060 km2，是中國(guó)著名的第四紀(jì)火山群[11-12]。東焦得布山是黑龍江五大連池火山中14座中的一座，分屬于東組，故名東焦得布山組。東焦得布山爆發(fā)于70～88萬(wàn)年之間，海拔532 m，相對(duì)高度101.9 m，該山主要由一些玄武巖及多層火山灰組成，其為典型的截頭圓錐丘，傾斜平均30°[13]。

基于以上，實(shí)驗(yàn)研究擬以五大連池東焦得布山中SOB為研究對(duì)象，通過(guò)高通量測(cè)序、火山土壤物理化因子得出：（1）分析東焦得布山火山土壤中SOB群落結(jié)構(gòu)；（2）研究東焦得布山土壤中環(huán)境因子同SOB的相關(guān)性。這些問(wèn)題的解決為研究東焦得布山土壤中SOB的分布特征，從微生物生態(tài)學(xué)角度揭示不同環(huán)境因素對(duì)SOB群落的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

硫酸亞鐵銨；37%鹽酸；98%硫酸；乙酸鈉；冰乙酸；鹽酸羥胺；林菲洛琳；氫氧化鈉；高氯酸；鄰二氮菲；無(wú)水乙醇；硫酸高鐵銨；磺基水楊酸；硝酸鉀；鐵粉；二硫化碳；引物710F、1184R（上海生物工程有限公司）；硫化物測(cè)定試劑盒（杭州陸恒生物科技有限公司）；2×Taq PCR Master Mix（北京全式金生物科技有限公司）；dd H2O；瓊脂糖；DNA提取試劑盒（MP Biomedicals，Santa Ana，美國(guó)）。

1.1.2 儀器

氧化還原測(cè)試儀（PHB-4，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；分光光度計(jì)（A003，上海菁華科技儀器有限公司）；電泳儀（YJ300C，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；碳氮元素分析儀（mulyi N/2000型，耶拿，德國(guó)）；PCR 儀（2720型，Applied Biosystems，美國(guó)）；Miseq系統(tǒng)（2500型，Illumina，英國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 采樣點(diǎn)的設(shè)置和樣品的采集

東焦得布山位于中國(guó)黑龍江省北部的五大連池火山區(qū)域（N 44°22′52.043″，E 126°17′29.213″），爆發(fā)于70～88萬(wàn)年前，高出地面106.9 m，海拔532 m，相對(duì)高度101.9 m。我們于2017年10月（秋季）對(duì)五大連池火山東焦得布山火山土壤進(jìn)行了采樣。在東焦得布山火山取3個(gè)不同坡度（上中下）的位置作為大采樣位點(diǎn)，每個(gè)大采樣點(diǎn)由同一經(jīng)緯度的5個(gè)小采樣位點(diǎn)等比例混合組成，混合后的樣品裝入經(jīng)過(guò)滅菌處理的采樣瓶中。物理化學(xué)參數(shù)的樣品分析儲(chǔ)存在4℃，分子生物學(xué)分析的樣品儲(chǔ)存在-20℃，所有儲(chǔ)存的樣品避免陽(yáng)光直射。

1.2.2 環(huán)境因子分析

以25∶1的滅菌水：火山土壤比過(guò)濾取上清液，采用帶玻璃電極的數(shù)字pH計(jì)測(cè)量沉積物pH值。氧化還原測(cè)試儀測(cè)量氧化還原電位，F(xiàn)e2+含量用鄰菲羅啉分光光度法測(cè)定[14]、TC采用碳氮分析儀進(jìn)行測(cè)定，TON和Nitrate-N含量采用過(guò)硫酸鉀消解—紫外分光光度法測(cè)定[15]、S0含量采用CS2—分光光度法進(jìn)行測(cè)定[16]、S2-含量采用硫化物測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定、SO42-采用硫酸根比濁法進(jìn)行測(cè)定[17]。將所有混合樣品進(jìn)行三組重復(fù)測(cè)定。

1.2.3 東焦得布山SOB多樣性分析

東焦得布山火山土壤樣品DNA的提取：將火山土壤樣品用細(xì)菌DNA提取試劑盒直接進(jìn)行DNA提取，將提取的DNA直接作為PCR模版。采用SOB功能基因soxB進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其正向引物為710F（5′-ATCGGYCAGGCYTTYCCSTA-3′），反向引物為1184R（5′-MAVGTGCCGTTGAARTTGC-3′），反應(yīng)體系：12.5 μL 的 2×Taq PCR Master Mix，上下引物各1μL，1μL的DNA模版，用無(wú)菌水補(bǔ)至25μL。PCR擴(kuò)增的條件為：95℃預(yù)變性10 min；94℃，40 s、55℃，60 s、72 ℃，55 s，30 個(gè)循環(huán)；最后 70 ℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化，檢測(cè)其濃度和條帶清晰度。檢測(cè)合格的樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，擴(kuò)增硫氧化細(xì)菌的soxB功能基因片段，高通量測(cè)序工作由派森諾生物科技有限公司完成。

為了計(jì)算樣品的多樣性指數(shù)，首先對(duì)OTU豐度矩陣中的全體樣本在90%的最低測(cè)序深度水平，統(tǒng)一進(jìn)行隨機(jī)重抽樣（即“序列量拉平處理”），從而校正測(cè)序深度引起的多樣性差異。隨后，使用QIIME軟件分別對(duì)樣本計(jì)算4種多樣性指數(shù)（ACE指數(shù)，Chao1指數(shù)，Shannon指數(shù)，Simpson指數(shù)）。

1.2.4 東焦得布山SOB多樣性同環(huán)境因子的關(guān)系

運(yùn)用CANOCO 5.0軟件對(duì)環(huán)境因子進(jìn)行主成分分析，以及對(duì)SOB群落和環(huán)境因子之間進(jìn)行冗余分析。

圖1 東焦得布山采樣區(qū)概況圖Fig.1 Sampling area profile of Dongjiaodebu volcano

2 結(jié)果與分析

2.1 東焦得布山火山土壤環(huán)境因子的測(cè)定結(jié)果

東焦得布山火山土壤環(huán)境因子的測(cè)定結(jié)果為：pH為7.65，呈中性；其ORP測(cè)定結(jié)果為49.33 mV；Fe2+含量為 0.11 μg·g-1；TC 含量為 18.50%；TON 含量為 110.67 μg·g-1，Nitrate-N 含量為 497.54 μg·g-1，S0含量為 0.85 mg·g-1、S2-含量為 0.375 mg·g-1、SO42-含量為541.46μg·g-1。利用Canoco 5.0對(duì)測(cè)定的環(huán)境因子進(jìn)行PCA分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析原理，PCA中累計(jì)方差貢獻(xiàn)率大于85%時(shí)，可以反應(yīng)系統(tǒng)的差異。在前兩軸的累積貢獻(xiàn)率為100%，其中第一主軸為91.13%。從環(huán)境因子的相關(guān)性來(lái)說(shuō)，TON、TC、Fe2+、ORP、S2-互為正相關(guān)，TON、TC、Fe2+、ORP、S2-與Nitrate-N、S0、pH、SO42-呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)；S0與 SO42-呈負(fù)相關(guān)；Nitrate-N、S0、pH 互為正相關(guān)。

圖2 東焦得布山理化因子PCA分析Fig.2 PCA analysis of the different environmental factors in Dongjiaodebu volcano

2.2 東焦得布山SOB多樣性多樣性分析

2.2.1 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)

Alpha多樣性是指在細(xì)菌在一個(gè)特定的區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)中的多樣性，它即可以反映物種豐富度也可以反映物種均勻度[18]。Alpha多樣性主要與物種種類數(shù)目，即豐富度；多樣性，群落中個(gè)體分配上的均勻性有關(guān)。微生物群落的豐富度指數(shù)主要指Chao1和ACE指數(shù)。群落多樣性指數(shù)，主要指Shannon和Simpson指數(shù)[19]。東焦得布山SOB共獲得441個(gè)OTU，ACE指數(shù)為508.92，Chao1指數(shù)為532.15。而群落多樣性指數(shù)中，Shannon指數(shù)為6.68，Simpson指數(shù)為0.974 9。

2.2.2 東焦得布山SOB多樣性組成

通過(guò)對(duì)東焦得布山SOB群落組成高通量測(cè)序結(jié)果分析，得到結(jié)果如圖3。結(jié)果表明，東焦得布山火山SOB共獲得441個(gè)OTU分布，共包括23個(gè)屬，其中優(yōu)勢(shì)菌屬包括：慢生根瘤菌屬bradyrhizobium（25.6%）、芽生綠菌屬Blastochloris（12.3%）、雷爾氏菌屬Ral－stonia（10.3%）、貪銅菌屬Cupriavidus（9.3%）、紫色硫細(xì)菌Allochromatium（7.5%）、貪噬菌屬Variovorax（6.6%）、甲基桿菌屬M(fèi)ethylobacterium（5.5%）、固氮弧菌屬Azoarcus（4.4%）。其中未鑒定菌屬僅占3.9%。東焦得布山SOB高通量測(cè)序結(jié)果顯示所有被測(cè)得的菌屬均屬于變形菌門。

圖3 東焦得布山SOB的群落組成（a：門水平；b：屬水平）Fig.3 Community composition of SOB in Dongjiaodebu volcano（a.phylum level，b.genus level）

2.3 東焦得布山SOB多樣性同環(huán)境因子的關(guān)系

東焦得布山SOB多樣性同環(huán)境因子的關(guān)系經(jīng)由RDA分析結(jié)果如圖3所示。由圖可知，Methylibium、Hylemonella、Blastochloris、Thiobacillus、Bradyrhizobum、Ralstonia 和 TN、TC、Fe2+、ORP、S2-呈極顯著正相關(guān)；Methylobacterium、Methylorubrum與 S0、Nitrate-N、pH呈顯著正相關(guān)；貪銅菌屬Cupriavidus與S2-、ORP、SO42-、pH呈正相關(guān)；其中S2-與大多數(shù)菌屬均呈正相關(guān)。綜上，SOB中不同菌屬對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)也存在著較大差異。

圖4 東焦得布山SOB多樣性與環(huán)境因子的RDA分析Fig.4 RDA analysis of SOB diversity and environmental factors in Dongjiaodebu mountain

3 討論

五大連池火山區(qū)的地理位置特殊，地處小興安嶺山地向松嫩平原過(guò)渡的地帶，同樣，其也屬于東北寒區(qū)地帶，這導(dǎo)致火山環(huán)境更為特殊，通過(guò)對(duì)理化因子的測(cè)定發(fā)現(xiàn)該火山中含有大量的還原性硫化合物，這為SOB的生長(zhǎng)提供了能量來(lái)源，這與實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)該區(qū)火山細(xì)菌與硫化物環(huán)境因子相關(guān)性結(jié)果相符合[20]。在TC、TON含量方面，東焦得布山均高于其他火山，其原因可能是其火山年限屬于五大連池火山群的第二古老火山，以及其覆蓋大面積的火山次生林，從而導(dǎo)致總碳和總有機(jī)氮含量偏高，另外，也不排除一些人為因素如旅游、人工種植等的影響[21]；自然界中硫循環(huán)與碳氮循環(huán)有著緊密聯(lián)系，部分碳氮硫循環(huán)過(guò)程中還存在著偶合反應(yīng)，這與在PCA分析中，TON、TC等與S2-互為正相關(guān)的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。

研究前期對(duì)五大連池環(huán)境樣品研究中，發(fā)現(xiàn)并分離出了兩株鐵硫氧化菌[22-23]，基于此基礎(chǔ)，又對(duì)五大連池東焦得布山火山土壤中的SOB多樣性進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)基于soxB功能基因測(cè)得的SOB多樣性結(jié)果是均屬于變形菌門，這表明東焦得布山中SOB的主要參與者是屬于變形菌門，這與前人研究中如同樣基于soxB功能基因測(cè)得西藏?zé)崛蠸OB多樣性結(jié)果也以變形菌門為主的結(jié)果類似[24]。該地區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌屬包括：慢生根瘤菌屬bradyrhizobium（25.6%）、芽生綠菌屬Blastochloris（12.3%）、雷爾氏菌屬Ralstonia（10.3%）、貪銅菌屬Cupriavidus（9.3%）、紫色硫細(xì)菌Allochromatium（7.5%）、貪噬菌屬 Variovorax（6.6%）、甲基桿菌屬M(fèi)ethylobacterium（5.5%）、固氮弧菌屬A zoarcus（4.4%），這些微生物較多都屬于目前研究較為深入的四類的SOB（綠硫細(xì)菌、紫硫細(xì)菌、紫色非硫細(xì)菌和無(wú)色硫細(xì)菌），例如bradyrhizobium屬于紫色非硫細(xì)菌，Allochromatium屬于紫色硫細(xì)菌等[25]。另外還發(fā)現(xiàn)了Thiobacillus菌屬，其屬于硫桿菌屬，常見(jiàn)于礦山，為好氧菌，具有較強(qiáng)的氧化硫及產(chǎn)酸能力[26]。

研究通過(guò)RDA分析東焦得布山火山土壤中的SOB多樣性與外部環(huán)境因子的關(guān)系，分析結(jié)果表明SOB中不同菌屬對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)也存在著較大差異，其中S2-與大多數(shù)菌屬均呈正相關(guān)，為影響SOB群落多樣性重要環(huán)境因素，這可以解釋為硫化物在環(huán)境里是具有代表性的還原性硫化合物，為SOB生長(zhǎng)提供能量來(lái)源，所以是影響SOB多樣性的重要環(huán)境因素。除去環(huán)境的外部因素，還有其他微生物之間的相互作用的內(nèi)部因素，同樣也是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素。比如，好氧微生物的生命活動(dòng)對(duì)氧氣的消耗造成局部的厭氧環(huán)境，有利于S2-的形成；微生物對(duì)有機(jī)物的脫硫作用等。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)火山生境的SOB多樣性研究還較少，還應(yīng)考慮火山年限、活動(dòng)，火山地區(qū)的環(huán)境氣候這些因素的影響來(lái)對(duì)火山生境的SOB群落多樣性特征進(jìn)行進(jìn)一步分析。另外，了解SOB種類會(huì)有助于全面解析火山生境的硫元素生物地球化學(xué)循環(huán)，雖然目前已分離出較多的SOB單菌[27]，但火山極端環(huán)境的SOB單菌還是少有報(bào)道，下一步應(yīng)考慮對(duì)火山環(huán)境SOB分離純化及其硫氧化途徑等方面來(lái)進(jìn)一步加深對(duì)SOB的認(rèn)識(shí)，這有利于為SOB的應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。

4 結(jié)論

通過(guò)高通量測(cè)序分析東焦得布山火山土壤SOB多樣性，以及結(jié)合東焦得布山火山土壤環(huán)境因子測(cè)定結(jié)果，最終得出：（1）東焦得布山SOB主要由變形菌門組成，基于高通量數(shù)據(jù)結(jié)果表明，東焦得布山火山土壤中具有較豐富的SOB多樣性。其中包括慢生根瘤菌屬bradyrhizobium（25.6%）、芽生綠菌屬Blastochloris（12.3%）、雷爾氏菌屬 Ralstonia（10.3%）、貪銅菌屬Cupriavidus（9.3%）、紫色硫細(xì)菌Allochromatium（7.5%）、貪噬菌屬Variovorax（6.6%）、甲基桿菌屬M(fèi)ethylobacterium（5.5%）、固氮弧菌屬Azoarcus（4.4%）。（2）通過(guò)東焦得布山火山土壤SOB多樣性同環(huán)境因子的關(guān)系的RDA圖可知，S2-與東焦得布山火山土壤大多數(shù)SOB菌屬呈正相關(guān)，故推測(cè)S2-是影響火山土壤SOB多樣性的重要環(huán)境因素之一。