miR-181a通過調(diào)控Toll樣受體參與兒童過敏性紫癜腎炎PS/iPS的激活

王彩芳,么 鑫,陳瑞珊

(開灤總醫(yī)院兒科,唐山 063000;*通訊作者,E-mail:pbaby0227@163.com)

兒童過敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura,HSP)是一種較常見的微血管變態(tài)反應(yīng)性出血性疾病,主要表現(xiàn)為皮膚紫癜以及胃腸道和關(guān)節(jié)受累。兒童過敏性紫癜重要的并發(fā)癥是過敏性紫癜性腎炎(Henoch-Schonlein purpura nephritis,HSPN),其易反復(fù),且治療復(fù)雜,致使部分患兒走向透析之路,需要昂貴的費(fèi)用,給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。

黏膜免疫被認(rèn)為在HSP的啟動過程中起著關(guān)鍵作用,與上呼吸道或胃腸道感染有著密切的聯(lián)系。很多HSPN患兒臨床表現(xiàn)為上呼吸道感染和肉眼血尿。上呼吸道感染可以激活黏膜免疫[2]。黏膜免疫是由識別病原相關(guān)分子模式(PAMPS)受體參與的免疫調(diào)節(jié)過程,這些PAMPS主要在細(xì)菌、病毒和真菌起源的病原體上表達(dá),其中最常見的代表是Toll樣受體(TLR)[3]。TLR是I型跨膜糖蛋白,與配體結(jié)合后觸發(fā)級聯(lián)反應(yīng),激活核因子κB(NF-κB)和干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)[4]。干擾素途徑可以通過將蛋白酶體(PS)機(jī)制轉(zhuǎn)換為免疫蛋白酶體(iPS),從而激活樹突狀細(xì)胞成熟并遷移至淋巴結(jié),進(jìn)一步催化β1,β2,β5轉(zhuǎn)化為低分子量蛋白質(zhì)(LMP2和LMP7)和內(nèi)肽酶樣復(fù)合物(MECL-1),從而導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞活化。IRF和NF-κB誘導(dǎo)黏附分子、炎性細(xì)胞因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄,在免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵作用。黏膜相關(guān)免疫系統(tǒng)以及適應(yīng)性免疫系統(tǒng)由調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞系統(tǒng)控制,通過反饋機(jī)制避免T細(xì)胞過度活化。FoxP3可以反映這種調(diào)節(jié)活性。而Th17通過產(chǎn)生白細(xì)胞介素17(IL-17)[5],抑制FoxP3的表達(dá)水平,進(jìn)一步抑制Treg細(xì)胞[6],從而發(fā)揮促炎活性。

miR181a是一種與血管炎性反應(yīng)有關(guān)的miRNA,并且在小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)的趨勢[7]。miR181a可以負(fù)向調(diào)控Prospero同源蛋白1(Prospero homeobox protein 1,PROX1),PROX1生理?xiàng)l件下可以維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)定,減少血液中有害物質(zhì)以及免疫蛋白復(fù)合物在血管中的黏附作用。此外,miR181a還可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,參與凋亡相關(guān)信號通路的激活[8]。

本課題組在先前的研究中發(fā)現(xiàn),在HSPN患兒血清中的miR-181a的表達(dá)水平高于HSP-nonN的患兒。miR-181a是一種與血管炎性反應(yīng)有關(guān)的miRNA,可以維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)定,減少血液中有害物質(zhì)以及免疫蛋白復(fù)合物在在血管中的黏附作用。此外,miR-181a還可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,參與凋亡相關(guān)信號通路的激活。本課題主要研究miR-181a在Toll樣受體激活,蛋白酶體/免疫蛋白酶體轉(zhuǎn)換以及信號通路的作用。

1 一般資料

1.1 樣本收集

收集2017年6月1日至2019年5月31日兒童過敏性紫癜腎炎100例,其中男性患者56例,女性患者44例,分為兒童過敏性紫癜腎炎(HSPN)患兒和過敏性紫癜不伴隨腎炎患兒(HSP-nonN)。隨機(jī)選取50名健康體檢兒童外周血為健康對照組(HC),均排除感染。收集所有患者的病例資料,以及初診時(shí)外周血,分離PBMC和血清,凍存在-80 ℃冰箱中,統(tǒng)一批次進(jìn)行檢測。

1.2 過敏性紫癜性腎炎(HSPN)診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會腎臟學(xué)組,紫癜性腎炎診治循證指南(2016)[9]:過敏性紫癜患者患病6個月內(nèi),出現(xiàn)血尿和(或)蛋白尿。血尿的診斷標(biāo)準(zhǔn):肉眼血尿或1周內(nèi)3次鏡下血尿紅細(xì)胞I>3個/高倍視野(HP)。蛋白尿診斷標(biāo)準(zhǔn),滿足以下任一項(xiàng)者:①1周內(nèi)3次尿常規(guī)定性示尿蛋白陽性;②24 h尿蛋白定量>150 mg或尿蛋白/肌酐>0.2 mg/mg;③1周內(nèi)3次尿微量白蛋白高于正常值。

1.3 血清miR-181a水平測定

采集患者血清后送實(shí)驗(yàn)室用細(xì)胞分離液(美國羅氏公司)分離外周血單個核細(xì)胞。用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,操作按照All-in-One miRNA實(shí)時(shí)定量試劑盒(美國Genecopoeia公司)說明書進(jìn)行。miR181上游引物序列:5′-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3′、下游引物序列:5′-ACUCACCGACAGCGUUGAAUGUU-3′,內(nèi)參U6上游引物序列:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAA-3′,下游引物序列:3′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-5′。miR-181a/U6(內(nèi)參)表示miR-181a的相對表達(dá)量。根據(jù)正常的體檢者HC組的miR-181a的含量作為對照組,分析實(shí)驗(yàn)組血清miR-181a的表達(dá)情況。

1.4 TLR2、TLR4、β1亞基、LMP2的mRNA測定

采集健康對照組和患者血清后送實(shí)驗(yàn)室用細(xì)胞分離液(美國羅氏公司)分離外周血單個核細(xì)胞。采用TLR2抑制劑INH14(5 μmol/L,美國Slleck貨號:S6715)處理或者不處理空白對照組(等量DMSO)24 h,用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,建立RT-PCR反應(yīng)體系及條件,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR),以β-actin為內(nèi)參照物,引物序列參見表1。引物均由上海生工合成。在Applied Biosystems熒光定量PCR儀(美國賽默飛世爾公司)上,按照默認(rèn)的反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)。每個標(biāo)本設(shè)3個重復(fù)管,結(jié)果Ct值取3個重復(fù)孔的平均值。ΔΔCt=目的基因ΔCt-對照組ΔCt,表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

表1 TLR2、TLR4、β1亞基、LMP2引物序列

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測PBMC中TLR1,TLR2,TLR3,TLR4,TLR9以及P65,p-P65的蛋白水平

采集健康對照組和患者PBMC,采用TLR2抑制劑INH14(5 μmol/L)或者等量DMSO(空白對照組)處理細(xì)胞24 h,收集細(xì)胞,使用預(yù)冷的含有蛋白酶體抑制劑的強(qiáng)RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白,用BCA定量試劑盒測定相應(yīng)的蛋白濃度,調(diào)整濃度為1 μg/μl,每孔上樣量20 μl,進(jìn)行蛋白電泳,轉(zhuǎn)膜。用5%TBST配制的脫脂奶粉封閉后,加入一抗(1 ∶1 000一抗稀釋液稀釋),4 ℃過夜孵育,TBST洗3次,每次10 min;室溫孵育二抗(1 ∶1 000 TBST稀釋)2 h,TBST洗3次,每次10 min孵育抗體。以GAPDH為內(nèi)參照,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體為二抗,一抗用特定的Western一抗稀釋液稀釋(1 ∶1 000),二抗用TBST稀釋(1 ∶1 000)。PVDF膜化學(xué)發(fā)光顯影,ImageQuant LAS4010成像分析儀拍照,定量分析各蛋白含量。TLR1(美國CST貨號:2209),TLR2(美國CST貨號:12276),TLR3(美國CST貨號:6961),TLR4(美國CST貨號:14358),TLR9(美國CST貨號:13674),p65(美國CST貨號:8242),p-P65(美國CST貨號:3033),GAPDH(美國CST貨號:2118),抗兔二抗Anti-rabbit IgG,HRP-linked Antibody(美國CST貨號:7074),抗鼠二抗Anti-mouse IgG,HRP-linked Antibody(美國CST貨號:7076)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HSPN患兒PBMC中高表達(dá)miR-181a

HSP患兒的外周血單個核細(xì)胞中miR-181a表達(dá)水平高于健康對照,HSPN組miR-181a水平高于HSP-nonN組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005,見圖1)。

與HC比較,**P<0.005;與HSP-nonN組比較,##P<0.005圖1 HSP組和健康對照組PBMC中miR-181a表達(dá)水平Figure 1 The expression of miR-181a in PBMC of HSP group and HC group

2.2 HSPN患兒PBMC中TLR蛋白的差異化表達(dá)

與健康對照組相比,HSP組PBMC中TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HSPN組TLR2 mRNA和蛋白表達(dá)水平高于HSP-nonN組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HSPN組TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平略高于HSP-nonN組,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HSP和HC兩組PBMC中TLR1,TLR3和TLR9 mRNA和蛋白的表達(dá)沒有明顯差異(見圖2)。

與HC比較,*P<0.05;與HSP-nonN組比較,#P<0.05圖2 HSP組和健康對照組PBMC中TLR表達(dá)水平Figure 2 TLR expression level in HSP group and HC group

2.3 HSPN的PBMC存在PS到iPS的轉(zhuǎn)換

HSP患兒PBMC中LMP2/β1亞基比值表達(dá)顯著高于HC,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HSPN患兒LMP2/β1亞基比值高于HSP-nonN患兒,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。

與HC比較,*P<0.05;與HSP-nonN組比較,#P<0.05圖3 HSP組和健康對照組PBMC中LMP2/β1亞基表達(dá)水平Figure 3 LMP2/β1 subunit expression levels in PBMC in HSP patients and healthy controls

2.4 INH14可以抑制PS到iPS的轉(zhuǎn)換和P65磷酸化

INH14處理后,HC組LMP2/β1亞基比值未見明顯改變,HSP組比值有所降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HSP-nonN相比,HSPN患兒的LMP2/β1亞基比值降低明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。HSPN患兒的p-P65表達(dá)最多,INH14處理后,P65磷酸化程度減少。HC組變化不明顯(見圖5)。

與HSP比較,*P<0.05;與HSPN組比較,#P<0.05;與HSP-nonN組比較,&P<0.05圖4 INH14抑制劑處理各組后檢測其LMP2/β1亞基表達(dá)水平Figure 4 LMP2/β1 subunit expression level in HSP patients and controls after INH14 treatment

圖5 INH14抑制劑處理各組后檢測其P65/p-P65表達(dá)水平Figure 5 The expression of P65/p-P65 in each group after INH14 treatment

3 討論

過敏性紫癜腎炎(HSPN),腎受累的是腎小球,其特征是免疫球蛋白A(IgA)和補(bǔ)體沉積在系膜中,從而造成腎臟的損害,臨床特征主要表現(xiàn)為血尿和蛋白尿。HSPN患兒通過激素和免疫抑制劑治療后,鏡下血尿和輕度蛋白尿會完全消退,只有少數(shù)人進(jìn)入慢性病階段,伴有持續(xù)性腎損害,最終可能發(fā)展為終末期腎衰竭[1]。普遍認(rèn)為HSPN發(fā)病機(jī)制為:抗原性刺激觸發(fā)了糖基化IgA1(脫乳糖基化IgA1)的產(chǎn)生,導(dǎo)致IgA1大分子聚集體的形成,進(jìn)入血液循環(huán),形成真正的免疫復(fù)合物。這些復(fù)合物能夠針對半乳糖基化的IgA1的特異性抗原產(chǎn)生抗體。這些含有IgA1的大分子最終沉積在系膜區(qū),導(dǎo)致炎癥激活和腎損害的發(fā)生發(fā)展。

多數(shù)HSP患兒在接受外界抗原刺激后,激活先天性免疫系統(tǒng),從而引發(fā)一系列全身性的變態(tài)反應(yīng)疾病。目前研究看來,HSP患兒黏膜免疫系統(tǒng)激活在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著巨大的作用,其中TLRs系統(tǒng)的激活尤為重要[10],TLRs系統(tǒng)通過INF途徑增強(qiáng)適應(yīng)性免疫,進(jìn)一步導(dǎo)致PS轉(zhuǎn)換為iPS,從而促進(jìn)了抗原呈遞細(xì)胞功能[11],促進(jìn)了T細(xì)胞反應(yīng)。

研究表明[12],與正常兒童相比,過敏性紫癜患兒的血清中,存在miRNAs的上調(diào),進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),在上調(diào)的多個miRNAs中,兒童過敏性紫癜腎炎患兒miR-181a、miR-21、miR-155、miR-32a上調(diào)大于非腎型紫癜患兒的表達(dá)上調(diào)水平。本研究通過提取外周血單核細(xì)胞(PBMC)發(fā)現(xiàn),HSP患兒外周血單個核細(xì)胞中miR-181a表達(dá)水平高于健康對照,HSPN患兒miR-181a水平高于HSP-nonN患兒。同時(shí)利用生物信息學(xué)分析的方法,發(fā)現(xiàn)miR-181a的靶基因與TLRs系統(tǒng)高度相關(guān)。

進(jìn)一步研究TRL在HSP患兒PBMC中的表達(dá)。與健康對照相比,HSP患兒TLR2轉(zhuǎn)錄表達(dá)增多,先天免疫系統(tǒng)激活,參與整個疾病的發(fā)生發(fā)展過程。本研究通過細(xì)胞分選分析HSP患兒的PBMC,進(jìn)一步檢測到TLR2蛋白的表達(dá)顯著增加。

HSPN患兒的LMP2/β1比值顯著高于健康對照,也高于HSP-nonN患兒。在免疫蛋白酶體的研究中發(fā)現(xiàn)存在兩種PS/iPS酶促LMP7/β5和MECL-1/β2的轉(zhuǎn)換[13],因此,我們可以推測LMP2/β1轉(zhuǎn)換可能是HSP特殊存在的。利用INH14處理HC,HSP-nonN和HSPN的PBMC,進(jìn)一步檢測不同分組中LMP2/β1亞基比值發(fā)現(xiàn),HC組未見明顯改變,而HSP組LMP2/β1亞基比值有所降低。進(jìn)一步比較HSPN和HSP-nonN患兒,發(fā)現(xiàn)INH14處理后HSPN患兒的LMP2/β1亞基比值降低明顯,而INH14處理后HSP-nonN患兒的LMP2/β1亞基比值降低。檢測正常對照、HSP-nonN和HSPN患兒PBMC中NF-κB相關(guān)蛋白P65和p-P65發(fā)現(xiàn),HSPN患兒的p-P65表達(dá)最多,INH14處理后,P65磷酸化程度減少;而HC組變化不明顯。因此,我們進(jìn)一步推測miR-181a可能通過TRL2激活NF-κB信號通路參與兒童過敏性紫癜腎炎的PS/iPS轉(zhuǎn)換的作用機(jī)制。

我們檢測到了先天免疫指標(biāo),即HSPN患兒的PBMC中TLR2 mRNA表達(dá)水平明顯高于HSP-nonN患兒和正常對照,表明TLRs在HSP的發(fā)生發(fā)展過程,可能介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞選擇性激活。TLR2配體包括代表廣泛物種的多種微生物分子,例如革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌,可識別細(xì)胞壁成分,例如肽聚糖,脂蛋白酸和脂蛋白[14]。我們無法推測HSP中TLR2是選擇性激活,還是iPS單獨(dú)性的激活,但是這些發(fā)現(xiàn)值得進(jìn)一步研究。確實(shí),針對TLR的治療為多種炎癥性疾病的治療策略和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)提供了可能性[15]。HSP患兒的TLR2的激活增加了免疫蛋白酶體轉(zhuǎn)換,可能暗示了HSP血管病變存在特有的先天免疫途徑。HSP的免疫調(diào)節(jié)領(lǐng)域值得進(jìn)一步研究,為更深層次的治療提供理論依據(jù)。