基于HPLC的菖遠(yuǎn)膠囊指紋圖譜分析與6個(gè)成分定量方法的建立

封 婷,趙 瑞,黃永鋒,朱 江,趙 斌,喬晶晶,劉 霞,霍艷虹,高亞亞

(1榆林市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,榆林 719000;2陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科;3西安市第五醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:sxgaoyaya@163.com)

菖遠(yuǎn)膠囊由石菖蒲、遠(yuǎn)志、丹參、人參、熟地、郁金和茯苓等組成,具有滋陰補(bǔ)氣、開(kāi)竅通經(jīng)、破瘀行血、醒神益智和的功能。方中石菖蒲具有開(kāi)竅豁痰、醒神益智、化濕開(kāi)胃等功效[1-5];人參有治療神經(jīng)退行性疾病、改善記憶功能和保護(hù)腦組織等作用[1,6-8];遠(yuǎn)志具有安神益智、交通心腎、祛痰、消腫等功效[1,9-12];丹參具有養(yǎng)血安神、活血祛瘀和改善微循環(huán)等作用[1,13,14];川芎有行氣活血、祛風(fēng)止痛等功效[1,15,16];郁金有抗炎鎮(zhèn)痛、抗血栓凝血、增強(qiáng)機(jī)體免疫等藥理作用[1,17];茯苓有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗炎和護(hù)肝等作用[1,18]。該藥作為院內(nèi)制劑應(yīng)用多年,其制備工藝為原料藥材粉碎、水提、噴霧干燥、制粒等。筆者前期藥理研究證實(shí)菖遠(yuǎn)膠囊具有明顯的健腦益智、增強(qiáng)記憶、改善腦缺血癥狀、抗疲勞、耐缺氧和增強(qiáng)免疫功能的作用[19]。本課題通過(guò)對(duì)菖遠(yuǎn)膠囊的HPLC指紋與6個(gè)成分(即梓醇、丹酚酸B、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1)定量控制的方法進(jìn)行研究,旨在建立菖遠(yuǎn)膠囊的HPLC質(zhì)量控制新方法與過(guò)程控制新方法,同時(shí)亦為擴(kuò)大臨床應(yīng)用范圍、服務(wù)更多的患者提供科學(xué)依據(jù),為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)中藥新藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀(Prominence-i LC-2030C 3D,帶自動(dòng)進(jìn)樣器,LC/Labsoluion色譜工作站,日本島津公司);ME235S型電子分析天平(德國(guó)塞多利斯公司);KQ-5200DE型數(shù)控超聲波發(fā)生器(昆山超聲儀器有限公司)。乙腈(色譜純,美國(guó)Honeywell公司,批號(hào):AH015-2),甲醇(色譜純,美國(guó)Honeywell公司,批號(hào):AH230-3);娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司,批號(hào):190818);磷酸(分析純,西安三浦化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):180913);其余試劑均為分析純。人參皂苷Rg1(批號(hào):HGO27162),人參皂苷Re(批號(hào):HGO27169),人參皂苷Rb1(批號(hào):HGO27159),純度均為≥98.0%,均購(gòu)自寶雞市晨光生物科技有限公司;細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷(批號(hào):JOT10162),梓醇(批號(hào):JOT-10011),丹酚酸B(批號(hào):115939-25-8),純度均為≥98.0%,均購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;菖遠(yuǎn)膠囊(批號(hào):20190612,20190613,20190614,20190615,20190709,20190710,20190711,20190806,20190807,20190808),由榆林市第一醫(yī)院藥劑科制備。

1.2 指紋圖譜測(cè)定

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脫見(jiàn)表1。記錄時(shí)間為110 min。流速:0.8 ml/min;柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):203 nm;進(jìn)樣量10 μl。

表1 梯度洗脫

1.2.2 參比物及供試品溶液的制備 參比物溶液的制備:稱(chēng)取丹酚酸B對(duì)照品5.10 mg置于50 ml量瓶中,加50%甲醇至刻度,搖勻,即得質(zhì)量濃度為0.1 mg/ml的參比物溶液。

供試品溶液的制備:取20粒本品,傾出內(nèi)容物,研細(xì),混勻,稱(chēng)取粉末2 g,精密稱(chēng)定,置于25 ml量瓶中,加50%甲醇適量,超聲處理(功率250 kW,頻率40 kHz)30 min,放涼,加50%甲醇至刻度,搖勻,靜置,0.45 μm微孔濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

1.2.3 方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn):取供試品溶液(批號(hào)201906012),連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定,計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD(%)和相對(duì)峰面積的RSD(%)。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取供試品溶液(批號(hào)201906012),分別于0,3,6,9,12,24 h進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD(%)和相對(duì)峰面積的RSD(%)。

重復(fù)性試驗(yàn):取6份供試品(批號(hào)201906012),按1.2.2項(xiàng)制備供試品溶液與1.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD(%)和相對(duì)峰面積的RSD(%)。

菖遠(yuǎn)膠囊指紋圖譜建立及相似度分析:采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012版本),依據(jù)文獻(xiàn)[20]對(duì)10批菖遠(yuǎn)膠囊的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析,將色譜工作站數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件,對(duì)選定共有色譜峰進(jìn)行譜峰匹配,得出指紋圖譜的共有模式,同時(shí)進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)及計(jì)算10批產(chǎn)品共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD(%)和相對(duì)峰面積的RSD(%)。

1.3 含量測(cè)定

1.3.1 色譜條件 同1.2.1項(xiàng)。

1.3.2 各種溶液的制備 對(duì)照品溶液的配制:分別稱(chēng)取梓醇5.00 mg、丹酚酸B 15.00 mg、人參皂苷Rg1 4.50 mg、人參皂苷Re 3.30 mg、人參皂苷Rb1 4.80 mg和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷15.20 mg,置于50 ml量瓶中,加50%甲醇至刻度,搖勻,即得混合對(duì)照品溶液,作為儲(chǔ)備液。

混合對(duì)照品溶液:分別稱(chēng)取梓醇0.032 62 g、丹酚酸B 0.153 18 g、人參皂苷Rg1 0.031 51 g、人參皂苷Re 0.016 33 g、人參皂苷Rb1 0.336 81 g和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷0.159 21 g置于100 ml量瓶中,加50%甲醇至刻度,搖勻,即得混合對(duì)照品溶液,濃度分別為梓醇0.32 mg/ml、丹酚酸B 1.50 mg/ml、人參皂苷Rg1 0.31 mg/ml、人參皂苷Re 0.16 mg/ml、人參皂苷Rb1 3.30 mg/ml和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷1.56 mg/ml。

供試品溶液的制備:制備方法同1.2.2項(xiàng)。

陰性對(duì)照溶液的制備:依據(jù)處方,分別制備缺地黃、丹參、人參和遠(yuǎn)志藥材的制劑,依據(jù)1.2.2項(xiàng)分別制備相應(yīng)的陰性對(duì)照溶液。

1.3.3 方法學(xué)考察 線(xiàn)性關(guān)系:分別精密量取儲(chǔ)備液0.01,0.05,0.20,0.40,080,1.00 ml置于各個(gè)1 ml量瓶中并加50%甲醇稀釋至刻度,用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò),進(jìn)樣。以各對(duì)照品的質(zhì)量濃度(x,μg/ml為橫坐標(biāo),峰面積值(y)為縱坐標(biāo),通過(guò)計(jì)算,得線(xiàn)性方程。

專(zhuān)屬性試驗(yàn):按上述1.2.1項(xiàng)條件分別進(jìn)樣缺熟地黃、丹參、人參、遠(yuǎn)志陰性對(duì)照溶液、供試品溶液、混合對(duì)照溶液。

精密度試驗(yàn):精密吸取供試品溶液(批號(hào)201906012),重復(fù)進(jìn)樣5次測(cè)定峰面積,計(jì)算梓醇、丹酚酸B、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的RSD(%)。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取供試品溶液(批號(hào)201906012),分別在第0,2,4,8,12,24小時(shí)進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算梓醇、丹酚酸B、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的峰面積的RSD(%)。

重復(fù)性試驗(yàn):精密稱(chēng)取6份樣品(批號(hào)201906012),分別按1.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算梓醇、丹酚酸B、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的平均含量(mg/g)與RSD(%)值。

加樣回收率試驗(yàn):取20粒本品(批號(hào)201906012),傾出內(nèi)容物,研細(xì),混勻,稱(chēng)取粉末2 g,精密稱(chēng)定,置于25 ml量瓶中,分別添加混合對(duì)照品溶液8.00 ml或10.00 ml或12.00 ml,再加50%甲醇至刻度,按照1.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,共制備9份樣品,按照1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算平均回收率(%)與RSD(%)。

含量測(cè)定:精密稱(chēng)取10批樣品,分別按照1.2.2項(xiàng)下方法制備供試品,按照1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算10批樣品中梓醇、丹酚酸B、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的平均含量(mg/g)、RSD(%)。

2 結(jié)果

2.1 指紋圖譜測(cè)定

2.1.1 精密度試驗(yàn) 各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積RSD值分別小于2.0%和3.0%(見(jiàn)表2,3),表明該方法精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 各共有峰相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積RSD值分別小于2.0%、3.0%(見(jiàn)表4,5),表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

表4 菖遠(yuǎn)膠囊指紋圖譜穩(wěn)定性的相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果

表5 菖遠(yuǎn)膠囊指紋圖譜穩(wěn)定性的相對(duì)峰面積的結(jié)果

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) 各共有峰相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積RSD值分別小于1.5%和3.0%(見(jiàn)表6、表7),表明該方法重復(fù)性良好。

表6 菖遠(yuǎn)膠囊指紋圖譜重復(fù)性的相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果

表7 菖遠(yuǎn)膠囊指紋圖譜重復(fù)性的相對(duì)峰面積的結(jié)果

2.1.4 指紋圖譜的建立及相似度分析 建立了指紋圖譜,結(jié)果見(jiàn)圖1,以峰19(丹酚酸B)為參比峰,標(biāo)定了35個(gè)特征峰。10批樣品共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的RSD值均分別小于2.0%、3.0%(見(jiàn)表8,9)。10批菖遠(yuǎn)膠囊的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析結(jié)果見(jiàn)表10,相似度在0.956-0.995之間。

表8 10批菖遠(yuǎn)膠囊的相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果

表9 10批菖遠(yuǎn)膠囊的相對(duì)峰面積

表10 10批相似度結(jié)果

1-35.特征指紋峰;4.梓醇;19.丹酚酸B(作為參照物的色譜峰);26.人參皂苷Rg1;27.人參皂苷Re;30.人參皂苷Rb1;34.細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷?qǐng)D1 菖遠(yuǎn)膠囊HPLC指紋圖譜Figure 1 HPLC fingerprint of Changyuan capsules

R.10批擬合指紋圖譜;S1.生產(chǎn)批號(hào)20190612;S2.生產(chǎn)批號(hào)20190613;S3.生產(chǎn)批號(hào)20190614;S4.生產(chǎn)批號(hào)20190615;S5.生產(chǎn)批號(hào)20190709;S6.生產(chǎn)批號(hào)20190710;S7.生產(chǎn)批號(hào)20190711;S8.生產(chǎn)批號(hào):20190806;S9.生產(chǎn)批號(hào):20190807;S10.生產(chǎn)批號(hào)20190808圖2 10批菖遠(yuǎn)膠囊的HPLC指紋圖譜Figure 2 HPLC fingerprint of 10 batches of Changyuan capsules

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 線(xiàn)性關(guān)系 對(duì)照品的線(xiàn)性方程結(jié)果見(jiàn)表11,表明各對(duì)照品在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 陰性對(duì)照均無(wú)干擾,專(zhuān)屬性強(qiáng)(見(jiàn)圖3)。

表11 對(duì)照品的線(xiàn)性方程及其濃度范圍

1.梓醇;2.丹酚酸B;3.人參皂苷;4.人參皂苷;5.人參皂苷;6.細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷?qǐng)D3 混合對(duì)照品、供試品與陰性對(duì)照HPLC圖譜Figure 3 HPLC chromatograms of mixed reference, test sample of Changyuan capsule and negative control sample

2.2.3 精密度試驗(yàn) 測(cè)得梓醇、丹酚酸B、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)分別為0.93%,0.98%,1.03%,0.92%,0.97%,1.01%,表明該方法精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 測(cè)得梓醇、丹酚酸B、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的峰面積的RSD值分別為0.69%,0.72%,0.99%,0.86%,0.92%,0.98%,表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 測(cè)得梓醇、丹酚酸B、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷平均含量與RSD值分別見(jiàn)表12,表明該方法具有良好重復(fù)性。

表12 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 測(cè)得梓醇、丹酚酸B、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的平均回收率與RSD值分別見(jiàn)表13,表明該方法回收率良好。

表13 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

續(xù)表13 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.2.7 含量測(cè)定 各批樣品中梓醇、丹酚酸B、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的平均含量(mg/g)、RSD見(jiàn)表14。

表14 菖遠(yuǎn)膠囊6個(gè)成分含量測(cè)定結(jié)果 (n=3,mg/g)

3 討論

采用二極管陣列檢測(cè)器全波長(zhǎng)對(duì)菖遠(yuǎn)膠囊樣品進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果203 nm時(shí)信息量較多。檢測(cè)示6個(gè)各成分的最大吸收梓醇為210 nm,丹酚酸B為286 nm,人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1均為203 nm,細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷為210 nm,結(jié)果在203 nm情況下,6個(gè)成分分離度符合要求,陰性對(duì)照均無(wú)干擾;在286 nm情況下,丹酚酸B分離度符合要求,陰性對(duì)照也無(wú)干擾,但考慮到所用檢測(cè)設(shè)備HPLC必須配備二極管陣列檢測(cè)器或多波長(zhǎng)檢測(cè)器,這對(duì)企業(yè)增加了成本或不必要的檢測(cè)障礙,因此,選用簡(jiǎn)單、方便、易于實(shí)現(xiàn)的檢測(cè)條件即選用203 nm作為指紋與定量的檢測(cè)波長(zhǎng)。

由于中藥復(fù)方中成分復(fù)雜,等度洗脫難以充分分離各種成分,所以采用梯度洗脫的方法。對(duì)不同流動(dòng)相系統(tǒng)乙腈-磷酸水溶液、乙腈-水、甲醇-水、乙腈-醋酸水溶液等進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,乙腈-0.1%磷酸水溶液流動(dòng)相理想。本制劑為膠囊劑,主要分析水溶性成分,所以比較使用0、30%、50%、70%、100%甲醇作為溶劑,采用不同時(shí)間超聲處理方法(5,10,20,25,40,50,60 min)或加熱回流,結(jié)果發(fā)現(xiàn),加50%甲醇超聲30 min較理想。對(duì)不同柱溫與流速進(jìn)行比較,柱溫超過(guò)或低于30 ℃,大部分色譜峰分離度小或不能分開(kāi);流速高于或低于0.8 ml/min,大部分色譜峰分離度差;色譜記錄時(shí)間,在110 min之后,無(wú)色譜峰出現(xiàn)。因此,選擇柱溫為30 ℃,記錄時(shí)間為110 min,流速為0.8 ml/min。

綜上所述,通過(guò)對(duì)10批次的菖遠(yuǎn)膠囊樣品進(jìn)行相似度計(jì)算,結(jié)果數(shù)值介于0.956-0.995。同時(shí)6種成分定量結(jié)果含量均一穩(wěn)定,表明筆者建立的菖遠(yuǎn)膠囊的HPLC指紋圖譜方法及定量方法具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)。因此,該方法可作為本制劑質(zhì)量有效評(píng)價(jià)的方法,同時(shí)亦為臨床療效提供了理論依據(jù)。