雞蛋中氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物殘留量的檢測

白俊慧，柳愛春，何欣

(杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院 實驗中心，浙江 杭州 310024)

氟蟲腈(Fipronil)，是一種廣譜殺蟲劑，通過作用于α-氨基丁酸受體(GABA)阻斷昆蟲的神經(jīng)膜氯離子通道，從而實現(xiàn)殺滅跳蚤、螨、虱等害蟲的目的。鑒于其針對性好的特點，氟蟲腈曾在全球范圍內被廣泛運用[1]。2017年，由于某養(yǎng)雞場工人使用了混有氟蟲腈的消毒液而引發(fā)的“毒雞蛋”事件，在歐洲引起了一場食品安全危機[2]。隨著氟蟲腈毒理研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)，氟蟲腈在進入小鼠體內后會迅速發(fā)生代謝反應并散布體內各組織，尤其是在皮下脂肪組織和毛囊中會發(fā)生明顯的富集效應，即使是在用藥1周之后，小鼠體內仍會檢測到較高濃度的氟蟲腈及其代謝物殘留[3]。Lyons[4]發(fā)現(xiàn)，施用了氟蟲腈的小鼠，甲狀腺細胞會顯著增多，并最終導致腫瘤的生成。這意味著，對人類而言，氟蟲腈存在較高的致癌風險?！岸倦u蛋”事件后，歐盟等針對蛋類中氟蟲腈的最大殘留量作了明確規(guī)定，但我國GB 2763—2016《食品安全國家標準》食品中農(nóng)藥最大殘留限量中仍未規(guī)定蛋類中的氟蟲腈最大殘留量。

雞蛋作為價美質優(yōu)的蛋白質來源，是我國城鄉(xiāng)居民飲食結構的重要組成部分[5]。雞蛋分為蛋黃和蛋清2個部分：蛋清由水、蛋白質、少量的碳水化合物和微量的脂肪構成；而蛋黃中則含有大量的脂肪、蛋白質，以及少量的碳水化合物[6]。本研究擬利用液相色譜-質譜聯(lián)用法實現(xiàn)對雞蛋中氟蟲腈及其代謝物的快速、高效檢測，并研究氟蟲腈及其代謝物在蛋黃與蛋清中的分布特點，現(xiàn)總結報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters Xevo TQ-S液相色譜-串聯(lián)質譜儀(UPLC-MS/MS)；METTLER電子天平，感量0.01 g和0.000 1 g；Eppendorf 5810臺式離心機；IKA磁力攪拌器和漩渦混勻器；IKA T18 Basic型高速組織勻漿機；Thermo 10～100 μL、100～1 000 μL、1～5 mL移液器。

氟蟲腈粉末(源葉生物，純度≥98%)；氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜標準溶液(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，1 000 μg·mL-1)；乙腈、甲醇、乙酸銨均為色譜純，購于Fisher Chemical公司；甲酸，色譜純，購于ROE Scientific公司；無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、氯化鈉為分析純，購于中國醫(yī)藥集團。

0.22 μm微孔有機濾膜，固相萃取小柱，購于Waters公司；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)，購自上海安譜實驗科技股份有限公司；實驗室用水為超純水。

1.2 樣品制備與前處理

選取健康產(chǎn)蛋期母雞30只，將雞分成2組，每組15只。通過飲水的方式使雞攝入氟蟲腈。試驗組每只雞按15 mg·kg-1(以體重計)的標準喂服銳勁特(氟蟲腈)溶液，連喂3 d；空白組雞正常飲水?？瞻捉M與試驗組每天的飲水量保持一致。從喂藥當天開始采集試驗組與空白組雞所產(chǎn)雞蛋，收集好的雞蛋拿回實驗室待測，總計收集雞蛋的時間持續(xù)(3+21)d。

取雞蛋樣品，分離蛋清和蛋黃，分別置于50 mL離心管中，混勻，分別稱取混勻后的蛋清和蛋黃樣品各5 g(精確至0.01 g)，置于50 mL離心管中，參照GB 23200.115—2018《食品安全國家標準 雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質譜聯(lián)用法》，分別對蛋黃和蛋清進行提取和凈化，取上清液過0.22 μm濾膜，以待測定。

1.3 標準溶液配置

分別準確移取1.0 mL氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜標準溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀釋至100 mg·kg-1作為標準儲備液，置于-20 ℃冰箱中保存。配置標準溶液時，移取標準儲備液，用50%的甲醇-水溶液逐級稀釋，分別配置成濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg·mL-1的混合標準溶液。

1.4 色/質譜條件優(yōu)化

1.4.1 質譜條件

采用直接注射方式進樣，對氟蟲腈及其代謝物的混合標準溶液(1.0 μg·mL-1)進行質譜采集，同時利用控制變量法對保留時間、定量離子對、碰撞能量、定性離子對等參數(shù)進行優(yōu)化。

1.4.2 色譜條件

參照GB 23200.115—2018，選取C18作為色譜柱，乙酸銨-甲酸溶液作為流動相A，甲醇作為流動相B。洗脫程序：0～3.0 min，流動相A體積分數(shù)40%～30%，流動相B體積分數(shù)60%～70%；3.0～3.5 min，流動相A體積分數(shù)30%～2%，流動相B體積分數(shù)70%～98%；3.5～4.5 min，流動相A體積分數(shù)2%，流動相B體積分數(shù)98%；4.5～6.0 min，流動相A體積分數(shù)2%～40%，流動相B體積分數(shù)98%～60%。試驗中對流動相條件和洗脫時間梯度進行優(yōu)化。

1.5 前處理方法優(yōu)化

通過考查圖譜和回收率的方式比較QuEChERS方法(組成成分為PSA/C18)和固相萃取法(SPE)對蛋黃和蛋清中氟蟲腈及其代謝物的凈化效果。

2 結果與分析

2.1 質譜檢測參數(shù)確定

采用直接注射方式進樣，對氟蟲腈及其3種代謝物進行信號采集，質譜參數(shù)如表1所示。

表1 氟蟲腈及其代謝物的質譜參數(shù)

2.2 色譜條件優(yōu)化

試驗選用C18為色譜柱，在洗脫時發(fā)現(xiàn)，當有機相體積分數(shù)為98%時已實現(xiàn)了完全洗脫，因此將洗脫梯度程序修改如下：0～2.0 min，流動相A體積分數(shù)40%～30%，流動相B體積分數(shù)60%～70%；2.0～2.2 min，流動相A體積分數(shù)30%～2%，流動相B體積分數(shù)70%～98%；2.2～2.7 min，流動相A體積分數(shù)2%，流動相B體積分數(shù)98%；2.7～4.5 min，流動相A體積分數(shù)2%～40%，流動相B體積分數(shù)98%～60%。4種分析物的UPLC-MS/MS色譜圖如圖1所示，各目標物均得到較好的保留和分離。

2.3 凈化效果評價

選取空白樣本作為基質加標，分別向蛋清和蛋黃中加入2、5、10 mg·kg-1的氟蟲腈及其代謝物混標，經(jīng)提取、凈化步驟后上機檢測。依據(jù)標準，使用QuEChERS法對蛋黃和蛋清提取物分別進行凈化，其中，QuEChERS方法凈化劑的配比為50 mg PSA、50 mg C18和150 mg無水硫酸鎂。試驗發(fā)現(xiàn)：QuEChERS方法凈化時，蛋清中氟蟲腈及其代謝物的加標回收率在90.0%～110.6%，相對標準偏差為0.4%～5.8%；而蛋黃中由于含有大量的脂肪和蛋白質，在使用QuEChERS法進行凈化后，仍受到較強的基質效應干擾，回收率僅在60%～85%。采用SPE凈化時，蛋清中氟蟲腈及其代謝物的加標回收率在94.3%～107.7%，相對標準偏差為0.7%～5.2%；蛋黃中氟蟲腈及其代謝物的加標回收率則大幅提高至90.0%～106.5%，相對標準偏差在1.0%～6.1%。出于成本和效率的綜合考慮，最終試驗中，蛋清使用QuEChERS方法凈化，蛋黃使用SPE凈化。

圖1 優(yōu)化后的4種待測物液相色譜

2.4 蛋清與蛋黃中氟蟲腈及其代謝物的分析

應用所建立的方法對采集的雞蛋樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)雞蛋中檢測到的藥物殘留量最高的為氟蟲腈砜，此外，氟蟲腈在雞蛋中也有較高檢出濃度。本試驗中，氟蟲腈藥物進入雞體后，雞蛋中檢測到的主要物質為氟蟲腈的代謝殘留物氟蟲腈砜和氟蟲腈，以及少量的氟甲腈。用藥的第2天，蛋黃與蛋清中開始檢測到氟蟲腈砜和氟蟲腈；用藥的第3天，蛋黃與蛋清中出現(xiàn)了氟甲腈殘留。氟蟲腈進入雞體后，藥物殘留的濃度會呈現(xiàn)出一個顯著升高后逐漸降低的特征。蛋清中，氟甲腈、氟蟲腈和氟蟲腈砜的濃度分別在用藥后的第9天、第4天、第9天左右達到最大值，之后逐漸降低；蛋黃中，氟甲腈、氟蟲腈和氟蟲腈砜的濃度分別在用藥后的第12天、第8天、第9天左右達到最大值，之后逐漸降低。其中，氟蟲腈和氟蟲腈砜殘留在蛋黃中的濃度為蛋清中的3倍。在停藥3周后，雞蛋中仍有氟蟲腈和氟蟲腈砜的殘留檢出。

3 小結

本研究以氟蟲腈為研究對象，改進檢測和凈化方法，分別對蛋黃、蛋清中的氟蟲腈及其代謝殘留物進行檢測分析，結果顯示，基于液相色譜-質譜聯(lián)用可實現(xiàn)對雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留量的快速、準確、高靈敏度篩查，其中，蛋清宜使用QuEChERS方法凈化，而蛋黃宜使用SPE凈化。同時，利用建立的檢測方法，探索了氟蟲腈在雞蛋內的代謝規(guī)律。向雞連續(xù)飼喂15 mg·kg-1(以體重計)的氟蟲腈溶液3 d，雞蛋中檢測到的藥物殘留量最高的為氟蟲腈的代謝殘留物氟蟲腈砜，其次為氟蟲腈，以及少量的氟甲腈。用藥的第2天，蛋黃與蛋清中開始檢測到氟蟲腈砜和氟蟲腈；用藥的第3天，蛋黃與蛋清出現(xiàn)氟甲腈殘留，停藥3周后，雞蛋中仍有氟蟲腈和氟蟲腈砜的殘留檢出。試驗結果對今后深入開展雞蛋中氟蟲腈及其代謝物的攝入風險評估具有指導意義，同時還可為進一步探究雞體內氟蟲腈的代謝轉換規(guī)律提供數(shù)據(jù)支撐。