丹皮酚通過STAT3通路抑制IL-17A誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞活性和細(xì)胞因子分泌*

解欣然， 張 蕾， 劉 欣， 林 燕， 李 萍

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院北京市中醫(yī)研究所，銀屑病中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究北京市重點實驗室，北京100010）

銀屑病是一種自身免疫性皮膚病，主要表現(xiàn)為鱗屑、紅斑和點狀出血等，皮損處T 淋巴細(xì)胞浸潤與角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖和分化是銀屑病發(fā)病的基本病理機制。輔助性T 細(xì)胞17（T helper 17 cells，Th17 cells）及其分泌的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素17A（interleukin-17A，IL-17A）與銀屑病的發(fā)病最為密切［1］。丹皮酚是丹皮和徐長卿的主要有效成分，其藥理活性廣泛，多用于治療心腦血管、腫瘤、炎癥、變態(tài)反應(yīng)及免疫系統(tǒng)等疾病。丹皮清熱涼血，活血散瘀，是治療銀屑病血熱證的方劑中的常用中藥之一。本研究通過IL-17A 誘導(dǎo)HaCaT 細(xì)胞生長，觀察丹皮酚對HaCaT 細(xì)胞的活力，細(xì)胞因子的分泌，以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 1/2 （extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）的影響，探討丹皮酚治療銀屑病的作用機制。

材料和方法

1 細(xì)胞

HaCaT 細(xì)胞株（人永生化表皮細(xì)胞）購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所協(xié)和細(xì)胞資源中心。

2 主要試劑

丹皮酚購自Sigma-Aldrich；MEM 培養(yǎng)液、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和胰蛋白酶（0.25%）購自Gibco；重組人 IL-17A 蛋白購自 PeproTech；S3I-201（STAT3 抑制劑）購自Sellckchem；CCK-8 試劑盒購自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司；Th1/Th2/Th17 CBA（cytometric bead array）試劑盒購自 BD Biosciences；IL-23 ELISA 試劑盒購自 eBioscience；PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成；cDNA 第1 鏈合成試劑盒和Real Super Mixture 試劑購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；兔抗 STAT3、p-STAT3，ERK1/2 和p-ERK1/2 多克隆抗體購自CST；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

3 主要儀器

酶聯(lián)免疫測定儀（Thermo）；3-18K 臺式高速冷凍離心機（Sigma）；倒置顯微鏡（Olympus）；ABI 7500 熒光定量 PCR 儀（Applied Biosystems）；流式細(xì)胞儀（BD）；凝膠電泳成像系統(tǒng)（Tanon）；半干轉(zhuǎn)電泳槽、電泳儀（Bio-Rad）；Mini P-4 電泳槽和濕轉(zhuǎn)電泳槽（Cavoy）。

4 主要方法

4.1 細(xì)胞培養(yǎng) HaCaT 細(xì)胞用含 10% FBS，1×105U/L 青霉素、1×105U/L 鏈霉素的 MEM 培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。將 HaCaT 細(xì)胞以1×108/L 接種于細(xì)胞培養(yǎng)板（瓶），細(xì)胞融合近80%時進行實驗。

4.2 CCK-8 法測定細(xì)胞活力 將HaCaT 細(xì)胞接種于96 孔板，實驗分組如下：（1）空白對照（control）組：無血清培養(yǎng)液；（2）模型（model）組：IL-17A 200 μg/L；（3）丹皮酚高劑量（paeonol 200 mg/L）組：paneonol 200 mg/L+ IL-17A 200 μg/L；（4）丹皮酚中劑量（paeonol 100 mg/L）組：paneonol 100 mg/L+ IL-17A 200 μg/L；（5）丹皮酚低劑量（paeonol 50 mg/L）組：paneonol 50 mg/L+ IL-17A 200 μg/L，每組設(shè) 8 個平行孔。細(xì)胞與藥物共同作用24 h 后，進行指標(biāo)檢測。實驗結(jié)束后，棄去培養(yǎng)上清，加入100 μL無血清培養(yǎng)液和10 μL CCK-8 溶液，孵育 2 h 后在酶標(biāo)儀 450 nm 處檢測吸光度（A）值，并計算藥物抑制率，抑制率（%）=（模型組A值-給藥組A值）/模型組A值×100%。

4.3 CBA 法檢測Th1/Th2/Th17 細(xì)胞因子 吸取各組細(xì)胞上清，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測Th1/Th2/Th17 類細(xì)胞炎癥因子的水平，包括γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、IL-10、IL-17A、IL-4、IL-6、IL-2 和腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），操作按 CBA 試劑盒說明進行。

4.4 ELISA 法檢測細(xì)胞因子IL-23 HaCaT 細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，丹皮酚設(shè)200 mg/L 和100 mg/L 劑量組，每組設(shè)4 個平行孔。細(xì)胞與藥物共同作用24 h。實驗結(jié)束后，分別吸取培養(yǎng)上清，3 000 r/min 離心10 min，應(yīng)用ELISA 法檢測細(xì)胞分泌的IL-23，操作按試劑盒說明進行。

4.5 Real-time PCR 法檢測細(xì)胞因子和STAT3 的mRNA 表達 Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄，得到相應(yīng)的cDNA，以β-actin 為內(nèi)參照，用Ultra SYBR Mixture 進行擴增，檢測炎癥細(xì)胞因子IL-23 和IL-6、趨化因子配體2［chemokine（C-XC motif）ligand 2，CXCL2］、CXCL8 和趨化因子配體20［chemokine （C-C motif） ligand 20，CCL20］和STAT3 的mRNA 表達。引物見表1。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，45 個循環(huán)。實驗結(jié)果以 Ct 值反映基因 mRNA 含量，采用 2-ΔΔCt相對定量法進行組間比較。

4.6 Western blot法檢測STAT3和ERK1/2的蛋白水平 HaCaT 細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，實驗分組同4.2，并加入陽性對照藥物STAT3抑制劑（S3I-201 36 mg/L）。24 h 后收集細(xì)胞提取蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，取10 μg 蛋白樣本，經(jīng) SDS-PAGE 后，轉(zhuǎn)膜，用 3% 牛血清白蛋白封閉，分別加入相應(yīng)抗體STAT3（1∶2 000）、p-STAT3（Tyr705）（1∶1 000）、ERK1/2（1∶4 000）和 p-ERK1/2（Thr202/Tyr204）（1∶2 000），4 ℃孵育過夜。用 TBST 洗膜×5 次，每次 3 min，加入相應(yīng)Ⅱ抗，室溫孵育 1 h，TBST 洗膜 6 次，每次 3 min。ECL 加到膜上后反應(yīng)3～5 min，膠片曝光5～10 min（曝光時間隨不同光強度而調(diào)整），顯影2 min，定影。實驗結(jié)果用目的蛋白條帶吸光度值/GAPDH條帶吸光度值表示。

表1 real-time PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

5 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，方差齊性用單因素方差分析（one-way ANOVE），多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 丹皮酚對IL-17A刺激的HaCaT細(xì)胞活力的影響

IL-17A（200 μg/L）作用于HaCaT 細(xì)胞24 h 能夠顯著增加細(xì)胞的活力（P＜0.05）；100 mg/L 和200 mg/L 丹皮酚對細(xì)胞的活力呈現(xiàn)出顯著的抑制作用（P＜0.05），對細(xì)胞活力的抑制率分別為28.81% 和45.76%，其藥效作用具有劑量依賴性，見表2。

表2 丹皮酚抑制IL-17A誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞活力Table 2.The HaCaT cell viability induced by IL-17A was inhibited by paeonol（Mean±SD. n=8）

2 丹皮酚對IL-17A 刺激的HaCaT 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

應(yīng)用CBA 法檢測Th1/Th2/Th17類細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的水平，結(jié)果顯示，在IL-17A 刺激HaCaT 細(xì)胞24 h 后，在細(xì)胞上清中（除刺激劑IL-17A 外）僅測到IL-6 的分泌，并且其在模型組的含量升高，而丹皮酚能夠抑制 HaCaT 細(xì)胞分泌 IL-6（P＜0.05）；其它細(xì)胞因子含量較低，未被檢測到。同時，ELISA 結(jié)果顯示，IL-17A 刺激的HaCaT 細(xì)胞分泌IL-23 含量顯著升高，丹皮酚各劑量組對細(xì)胞分泌的炎癥因子IL-23 呈現(xiàn)不同的抑制趨勢，但較模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1。

3 丹皮酚對IL-17A 刺激的HaCaT 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子mRNA表達的影響

與空白對照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)趨化因子CXCL2、CXCL8和CCL20 的mRNA 表達均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，200 mg/L和100 mg/L 丹皮酚對細(xì)胞內(nèi)的上述mRNA 表達均呈現(xiàn)出一定的抑制作用（IL-6 除外），其中，200 mg/L 丹皮酚能夠顯著抑制CXCL2、CXCL8和CCL20的mRNA表達，見圖2。

4 丹皮酚對IL-17A 刺激的HaCaT 細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路STAT3和ERK1/2表達的影響

IL-17A 刺激 HaCaT 細(xì)胞使胞內(nèi) STAT3 的 mRNA水平及磷酸化STAT3（Tyr705）表達顯著增加，100 mg/L 及 200 mg/L 丹皮酚均可抑制 STAT3 mRNA 的表達（P＜0.05），但 僅 200 mg/L丹皮酚對STAT3（Tyr705）磷酸化的抑制具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；IL-17A 刺激后 HaCaT 細(xì)胞 ERK1/2 和磷酸化 ERK1/2（Thr202/Tyr204）蛋白水平均無顯著差異，見圖3、4。

討 論

丹皮是臨床治療銀屑病血熱證的中藥復(fù)方中的主要組成之一，丹皮酚是其主要活性成分，具有抗炎、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫的作用，提示丹皮酚可能對于銀屑病的免疫細(xì)胞浸潤和角質(zhì)形成細(xì)胞增殖有一定的作用。文獻報道，丹皮酚可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）刺激的Ha-CaT細(xì)胞增殖，其機制是通過阻止細(xì)胞向S期和G2/M期轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞生長增殖停滯在G0/G1期，從而抑制銀屑病的發(fā)生［2］。丹皮酚也可通過干預(yù)microRNA-155 調(diào)控細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）/STAT3 途徑來治療銀屑?。?-4］。丹皮酚還可能通過抑制c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）-絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路的活化，下調(diào)人β-防御素 2（human β-defensin 2，HBD-2）的表達治療銀屑?。?］。另有針對樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）的研究顯示，丹皮酚可通過抑制Toll 樣受體7/8（Toll-like receptor 7/8，TLR7/8）通路中的MyD88 和TLR8，從而抑制DCs 細(xì)胞成熟和激活，以減輕咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損［6-7］。

Figure 1.The results of HaCaT cells secreted cytokines inhibited by paeonol.Mean±SD. n=4.#P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs model group.圖1 丹皮酚抑制HaCaT細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子

Figure 2.The mRNA expression of cytokines in the HaCaT cells was inhibited by paeonol.Mean±SD. n=4.#P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs model group.圖2 丹皮酚抑制HaCaT細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的mRNA表達

Figure 3.The mRNA expression of STAT3 in the HaCaT cells was inhibited by paeonol.Mean±SD. n=4.#P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs model group.圖3 丹皮酚抑制HaCaT細(xì)胞內(nèi)STAT3的mRNA表達

Figure 4.The protein levels of STAT3 and ERK1/2 in the HaCaT cells were inhibited by paeonol.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs model group.圖4 丹皮酚抑制HaCaT 細(xì)胞STAT3 和ERK1/2 蛋白水平的比較

銀屑病具有多基因遺傳背景，涉及到免疫、炎癥、細(xì)胞增殖與凋亡、神經(jīng)遞質(zhì)等多方面因素。銀屑病發(fā)病機制尚無定論，目前普遍認(rèn)為其發(fā)生發(fā)展是免疫系統(tǒng)失衡和角質(zhì)形成細(xì)胞異常共同作用的結(jié)果。Th17 細(xì)胞及其分泌的IL-17 在銀屑病發(fā)病中起重要作用。Th17細(xì)胞成熟分化是由STAT3和視黃醇類核內(nèi)受體 γt（RAR-related related orphan receptor γt，RORγt）共同介導(dǎo)的，主要產(chǎn)生IL-17A 和IL-17F，這兩種細(xì)胞因子與自身免疫性和炎癥性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。Th17 細(xì)胞分化由轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）與 IL-6 首先啟動，隨后自分泌產(chǎn)生IL-21 擴大其分化規(guī)模，激活STAT3，IL-23則在分化后期維持Th17細(xì)胞穩(wěn)定和分化成熟，從而誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖和分化，表現(xiàn)出銀屑病的病理特征［8］。IL-23可以介導(dǎo)STAT3磷酸化過程，使STAT3 激活從而促進Th17 類細(xì)胞因子的分泌。IL-17 可以促進角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和IL-23 等細(xì)胞因子［9］，從而再進一步刺激 Th17 細(xì)胞分泌。在銀屑病皮損的角質(zhì)形成細(xì)胞中，STAT3 表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)性激活，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的浸潤和斑塊的形成［10］。

本實驗結(jié)果表明，IL-17A（200 μg/L）刺激體外培養(yǎng)的HaCaT 細(xì)胞24 h 后，能夠增強細(xì)胞的活力，使趨化因子CXCL2、CXCL8和CCL20的分泌增多，并能促進STAT3 磷酸化。丹皮酚為晶體化學(xué)物，水溶性差，用0.1%DMSO 溶解后，加入到正常培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞中，通過實驗證實200 mg/L 濃度以下丹皮酚無細(xì)胞毒作用。丹皮酚（50～200 mg/L）對于IL-17A 刺激的HaCaT 細(xì)胞的活力有一定的抑制作用，且呈劑量依賴性。

采用CBA 方法檢測Th1/Th2/Th17 類細(xì)胞因子，只有IL-6 被檢測到且于IL-17A 刺激后顯著升高，提示IL-17A刺激的HaCaT細(xì)胞分泌的炎癥因子IL-6分泌較多，其它細(xì)胞因子分泌較少，并且丹皮酚能夠抑制IL-6 的分泌，但是，IL-6 的mRNA 表達增加不受影響，即丹皮酚可能在IL-6 轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮作用。文獻報道，IL-6 是IL-17 產(chǎn)生的關(guān)鍵激活劑，在銀屑病患處皮損中mRNA 和蛋白質(zhì)水平上都呈高表達［11］。相反地，由記憶T 細(xì)胞釋放的IL-17 僅減少IL-6 mRNA 的降解，但對IL-6基因的轉(zhuǎn)錄無影響。IL-17 主要對IL-6 進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，增強IL-6 對次級刺激的反應(yīng)，而對于它自身只是一種較弱的促炎反應(yīng)［12］。較高水平的IL-6可能會通過DCs和相關(guān)的Th17細(xì)胞傳遞抗原呈遞信號。由巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生的其它IL-6 增強病變皮損中富含IL-6 的微環(huán)境，從而刺激記憶/效應(yīng)T 細(xì)胞群中STAT3 的磷酸化激活。丹皮酚對IL-6 蛋白水平抑制作用能夠進一步阻止Th17 細(xì)胞分泌IL-17A。丹皮酚對IL-17A 誘導(dǎo)的HaCaT 細(xì)胞分泌的IL-23 mRNA 和蛋白表達均有一定的抑制作用。IL-23是Th17途徑的關(guān)鍵上游因子，在銀屑病皮損中呈高表達，并且是維持Th17 細(xì)胞的重要細(xì)胞因子。盡管IL-23 主要由樹突狀細(xì)胞分泌，但在銀屑病皮損中角質(zhì)形成細(xì)胞也分泌IL-23［13］。IL-17 刺激HaCaT 細(xì)胞分泌IL-23，可以驗證IL-23/Th17 軸在該細(xì)胞模型的環(huán)路形成。由此可見，丹皮酚對IL-23/Th17 軸具有直接作用，并通過抑制IL-23的分泌對銀屑病發(fā)揮治療作用。

IL-17 作用 HaCaT 細(xì)胞 24 h 后，細(xì)胞內(nèi)趨化因子CXCL2、CXCL8和CCL20 mRNA 表達顯著升高，200 mg/L丹皮酚對高表達的趨化因子均有顯著的抑制作用。銀屑病患處皮損中角質(zhì)形成細(xì)胞是CXCL2的主要來源，CXCL2 與主要表達于單核細(xì)胞表面的趨化因子受體CCR2 結(jié)合后，單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化，從血流向炎癥部位遷移。這個過程會導(dǎo)致斑塊的形成［14］。同時，CXCL2 也參與角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和新血管形成。CXCL8或IL-8可維持中性粒細(xì)胞的聚集［15］。促炎細(xì)胞因子如 TNF-α，IL-1，IL-17和IFN-γ能顯著刺激角質(zhì)形成細(xì)胞中CCL20 的產(chǎn)生［16］。CCL20 在正常皮膚的角質(zhì)形成細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中低水平表達，在銀屑病皮損表皮細(xì)胞基底層呈高表達。此外，CCR6+Th17 細(xì)胞可促進CCL20 分泌，引起更多的CCR6+Th17 細(xì)胞募集［17］。由此可見，丹皮酚可通過抑制趨化因子 CXCL2、CXCL8和CCL20 阻止 T 淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的聚集來抑制炎癥。丹皮酚抑制趨化因子的作用可能成為銀屑病治療的一個研究方向。

STAT3 和ERK1/2 作為細(xì)胞增殖的重要細(xì)胞內(nèi)信號通路蛋白，可被IL-17 激活，在銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用［18］。本研究結(jié)果顯示，丹皮酚對HaCaT 細(xì)胞內(nèi)STAT3 mRNA 和蛋白表達有顯著的抑制作用，對STAT3 蛋白磷酸化的抑制作用尤為顯著，與STAT3 抑制劑的作用一致。STAT3 信號通路與細(xì)胞的生長、增殖和凋亡相關(guān)，STAT3 的持續(xù)活化可導(dǎo)致異常的細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化。在銀屑病中STAT3 磷酸化激活是特異性的，磷酸化STAT3 是Th17 細(xì)胞分化和 IL-17 分泌的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［19］。咪喹莫特誘導(dǎo)的STAT3 轉(zhuǎn)基因小鼠銀屑病樣皮損紅斑、鱗屑、浸潤較單純咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠顯著加重，提示STAT3在銀屑病發(fā)病機制中的重要作用［20］。但是，丹皮酚對ERK1/2 和p-ERK1/2 的表達無顯著作用，這表明丹皮酚可能通過STAT3磷酸化途徑-IL-23/Th17軸減輕銀屑病癥狀。

綜上所述，丹皮酚能夠抑制IL-17A 刺激的Ha-CaT 細(xì)胞的活力，抑制細(xì)胞因子IL-23 和IL-6 的分泌和趨化因子CXCL2、CXCL8和CCL20的mRNA 表達，以及STAT3的mRNA和蛋白表達。