游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性子宮內(nèi)膜異位癥的影響及機(jī)制分析*

景彥林， 楊修昭， 白振軍， 賀千里

（1山西大同大學(xué)中醫(yī)藥健康服務(wù)學(xué)院，2大同市第五人民醫(yī)院，山西大同037009）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EM）以子宮腔外子宮內(nèi)膜組織生長(zhǎng)為特征，常見(jiàn)癥狀是痛經(jīng)、性交困難、慢性盆腔疼痛和不孕。證據(jù)表明，子宮膜異位癥是由周期性出血的異位子宮內(nèi)膜植入物導(dǎo)致［1］。因此，免疫因子可能與異位內(nèi)膜細(xì)胞的生長(zhǎng)和著床有關(guān)。而內(nèi)環(huán)境變化可能影響炎癥的發(fā)展和維持，從而與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生過(guò)程相關(guān)［2］；另一方面，體育鍛煉似乎對(duì)涉及炎癥過(guò)程的疾病具有保護(hù)作用，如2型糖尿病和結(jié)腸癌［3］。體育鍛煉也可增加某些激素結(jié)合球蛋白水平，降低雌激素生物利用度，并有益于雌激素依賴性疾病患者，如子宮內(nèi)膜異位癥患者［4］。此外，長(zhǎng)期體育鍛煉可使胰島素抵抗降低，月經(jīng)減少及具有抗炎特性的細(xì)胞因子增加［5］。盡管有證據(jù)表明體育鍛煉對(duì)治療子宮內(nèi)膜異位癥有益處，但迄今為止，文獻(xiàn)中還未報(bào)道游泳運(yùn)動(dòng)能否預(yù)防子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生或發(fā)展。因此，本項(xiàng)工作主要觀察游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性子宮內(nèi)膜異位癥的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討。

材料和方法

1 動(dòng)物

80 只SPF 級(jí)雌性SD 大鼠（4 周）購(gòu)于山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心［SCXK（晉）2015-0001］，體重80～90 g。大鼠存放在12 h 光照和12 h 黑暗清潔環(huán)境中，溫度為（22±1）℃，自由進(jìn)食和飲水。80只大鼠隨機(jī)分為8組：對(duì)照組、模型組（0組）、子宮內(nèi)膜異位癥誘導(dǎo)前輕度運(yùn)動(dòng)（light exercise，L-ex）組（每周游泳1 次）、中度運(yùn)動(dòng)（moderate exercise，M-ex）組（每周游泳3 次）和劇烈運(yùn)動(dòng)（intense exercise，I-ex）組（每周游泳5 次）及子宮內(nèi)膜異位癥誘導(dǎo)后輕度運(yùn)動(dòng)組（每周游泳1次）、中度運(yùn)動(dòng)組（每周游泳3 次）和劇烈運(yùn)動(dòng)組（每周游泳5次），每組均為10只大鼠。

2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

PCR 儀（ABI）；RNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）和增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體（Santa Cruz）；ELISA 檢測(cè)試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；基因特異性引物由上海生工生物科技公司合成。

3 方法

3.1 大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的制備 于造模前24 h，在大鼠皮下注射外源性雌激素乙烯雌酚0.1 mg/kg，促使大鼠子宮內(nèi)膜處于同一變化周期。以戊巴比妥鈉麻醉大鼠，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，沿腹中線剪開(kāi)腹壁和腹膜（切口大約2～3 cm），進(jìn)腹后在膀胱背側(cè)找到大鼠“Y”字型子宮，游離子宮右側(cè)，用絲線在近端離右子宮角1 cm 處結(jié)扎，遠(yuǎn)端離卵巢約2 cm 處結(jié)扎，同時(shí)結(jié)扎兩端間的子宮系膜血管。剪取靠近卵巢處約1.5 cm 子宮置入含生理鹽水培養(yǎng)皿中，肌層與子宮內(nèi)膜層分離后，將內(nèi)膜剪成5 mm×5 mm 大小與腹壁肌肉縫合固定［6］，如圖1 所示。最后向大鼠腹腔撒少許青霉素鈉，分層關(guān)閉腹腔，縫合切口。手術(shù)結(jié)束后每天腹腔注射青霉素，連續(xù)1周。術(shù)中無(wú)異常表現(xiàn)，術(shù)后造模大鼠無(wú)感染及死亡。4 周后再次開(kāi)腹，觀察建模是否成功，成功標(biāo)準(zhǔn)：移植灶體積增大，呈透明結(jié)節(jié)狀或囊狀，移植物被結(jié)締組織覆蓋并有血管形成。造模成功率大約為70.0%。用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植物病灶面積=長(zhǎng)（mm）×寬（mm）。

Figure 1.Preparation of endometriosis model in rats.圖1 大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型制備

3.2 游泳運(yùn)動(dòng) 有氧運(yùn)動(dòng)選擇游泳，因?yàn)榇笫缶哂刑焐挠斡灸芰?，并能很好地適應(yīng)訓(xùn)練，因此游泳對(duì)大鼠來(lái)說(shuō)壓力較小。大鼠造模成功后24 h開(kāi)始游泳適應(yīng)，大鼠首先在0.9 m× 0.9 m×1.2 m 水箱中適應(yīng)5 d。第1 天，將動(dòng)物置于溫度為34℃的5 cm 深水中15 min，然后水位持續(xù)升高，第5 天水位升高至50 cm，均不會(huì)沉底表明適應(yīng)完成。然后開(kāi)始有氧運(yùn)動(dòng)，游泳運(yùn)動(dòng)持續(xù)5 周，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度逐漸增加，從第1 周20 min 開(kāi)始，到第5 周60 min 結(jié)束，運(yùn)動(dòng)后大鼠的主動(dòng)運(yùn)動(dòng)減少。

3.3 樣本收集及病變大小評(píng)估 運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，采用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠，收集5 mL 血液，用于氧化應(yīng)激分析。然后打開(kāi)盆腔，切除子宮內(nèi)膜異位癥病變部位進(jìn)行組織學(xué)和基因表達(dá)分析。對(duì)側(cè)子宮角（左角）也作為對(duì)照切除。樣本固定在10%甲醛中，石蠟包埋處理，蘇木精染色，確認(rèn)異位子宮內(nèi)膜組織的存在。為了計(jì)算病變面積的變化，再次用游標(biāo)卡尺測(cè)量造模后運(yùn)動(dòng)組移植物病灶面積大小。

3.4 RT-qPCR 首先取大鼠異位子宮內(nèi)膜總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使用FAS、PCNA 和MMP9 特異性引物進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增。引物序列如下：FAS的上游引物序列為 5'-CAAGGGACTGATAGCATCTTTGAGG-3'，下游引物序列為5'-TGTGAAAGTCCTGAACCCTAAGG-3'；MMP9 上游引物序列為 5'CCTGGAGACCTGAGAACCAATC-3'，下游引物序列為5'CCACCC GAGTGTAACCATAGC-3'；PCNA 上游引物序列為5'-GGAAATGGAAACATTTTAAATTGTCAC-3'，下游引物序列為5'-GAGTGGCTTTTGTAAAGAAGTTCAG-3'；β-actin 上游引物序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列為5'-AACGCTTOACGAATTTGCGT-3'。通過(guò)分析軟件得到每組的Ct，其中β-actin作為內(nèi)參照；參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法［7］，用 2-ΔΔCt法比較不同處理后基因相對(duì)表達(dá)的含量。

3.5 Western blot 提取各組大鼠異位子宮內(nèi)膜蛋白，取 30 μg 進(jìn)行 SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上。經(jīng)5%牛奶孵育1 h 后，用磷酸鹽緩沖液洗膜3 次，每次 10 min。用兔源 FAS、MMP9和PCNA（1∶1 000）4℃孵育3 h，PBST洗3次，每次10 min。用PBST稀釋山羊抗兔和山羊抗鼠的Ⅱ抗（1∶25 000），室溫孵育1 h。PBST 洗3 次，每次5 min。利用化學(xué)發(fā)光掃描系統(tǒng)檢測(cè)蛋白表達(dá)并攝片，采用Quantity One 圖像分析軟件對(duì)吸光度積值進(jìn)行分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間比較采用單因素方差分析及Tukey's 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠病變大小比較

子宮內(nèi)膜異位病變誘導(dǎo)前的游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥無(wú)預(yù)防作用，而誘導(dǎo)病變后的運(yùn)動(dòng)無(wú)論頻率如何（每周1次或每周5次），均可顯著降低子宮內(nèi)膜異位癥的病變大?。≒＜0.05）；與每周運(yùn)動(dòng)1 次大鼠相比，以中等（每周3次）或劇烈（每周5次）運(yùn)動(dòng)的大鼠病變顯著減?。≒＜0.05），見(jiàn)圖2和表1。

Figure 2.The effect of swimming on endometriosis.圖2 模型制備后游泳對(duì)異位病灶的影響

表1 各組大鼠異位病灶面積比較Table 1.Comparison of total lesion areas in differenr groups（mm2.Mean±SD. n=10）

2 各組大鼠相關(guān)基因mRNA表達(dá)的比較

如表2 所示，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜異位癥后進(jìn)行中度或劇烈游泳運(yùn)動(dòng)的大鼠子宮內(nèi)膜FAS mRNA 表達(dá)均顯著增加（P＜0.05）；而誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜異位癥后進(jìn)行中度或劇烈游泳運(yùn)動(dòng)的大鼠MMP9 mRNA 均顯著降低（P＜0.05）。

表2 各組FAS、MMP9和PCNA mRNA表達(dá)Table 2.The mRNA expression of the FAS，MMP9 and PCNA at the end of the experimental protocol（Mean±SD. n=10）

3 各組大鼠相關(guān)蛋白表達(dá)比較

Western blot 結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜異位癥后進(jìn)行中度或劇烈游泳運(yùn)動(dòng)的大鼠其子宮內(nèi)膜FAS 蛋白顯著增加（P＜0.05）；而誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜異位癥后進(jìn)行中度或劇烈游泳運(yùn)動(dòng)的大鼠其子宮內(nèi)膜MMP9和PCNA 蛋白均顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖 3和表3。

Figure 3.Western blot was used to detected the protein levels of FAS，MMP9 and PCNA at the end of the experimental protocol.圖3 FAS、MMP9和PCNA的Western blot結(jié)果

表3 各組FAS、MMP9和PCNA蛋白表達(dá)Table 3.Expression of the FAS，MMP9 and PCNA proteins at the end of the experimental protocol（Mean±SD. n=5）

討 論

以往研究已經(jīng)證實(shí)，規(guī)律體育鍛煉對(duì)炎癥相關(guān)疾病的患者具有保護(hù)作用［8］。近年研究發(fā)現(xiàn)，橫紋肌具有內(nèi)分泌功能，通過(guò)合成和釋放收縮刺激心肌細(xì)胞因子，從而影響和改變組織和器官中的代謝及細(xì)胞因子產(chǎn)生［9］。對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的分析表明，游泳運(yùn)動(dòng)能否預(yù)防子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生或發(fā)展，以及游泳運(yùn)動(dòng)在多大程度上對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥患者有益，仍不明確。由于對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的研究往往需要采用侵入性方法，這限制了其在臨床上的應(yīng)用，因此必須使用動(dòng)物模型進(jìn)行研究［10］。在此背景下，開(kāi)海麗等［11］提出的大鼠子宮內(nèi)膜異位癥誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛷V泛應(yīng)用于相關(guān)研究，可有效地誘導(dǎo)病變，并具有高度的可重復(fù)性。此外，大鼠具有天生的游泳能力，能很好地適應(yīng)訓(xùn)練［12］?；谶@些原因，因而本研究通過(guò)游泳作為體育鍛煉來(lái)評(píng)估其對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠的影響。本研究結(jié)果表明，誘導(dǎo)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥后，游泳運(yùn)動(dòng)至少在一定程度上有益于子宮內(nèi)膜異位癥的治療，無(wú)論運(yùn)動(dòng)頻率如何（每周1次或每周5 次），而大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型制備前的游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的治療無(wú)任何影響。因而本研究主要關(guān)注的是大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型制備后的游泳運(yùn)動(dòng)。

正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡呈周期性變化。本研究結(jié)果顯示，在子宮內(nèi)膜異位癥誘導(dǎo)后進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng)的大鼠FAS mRNA 水平顯著增加。FAS 屬于腫瘤壞死因子受體和神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體超家族成員之一，是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白。細(xì)胞在接收到經(jīng)FAS 傳遞的凋亡信號(hào)后，主要通過(guò)外源性凋亡途徑和內(nèi)源性凋亡途徑引發(fā)細(xì)胞凋亡［13］。子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜功能活躍，黏附、侵襲、血管增生能力強(qiáng)，使其易于遷徙和種植，而凋亡相關(guān)基因的表達(dá)并不隨月經(jīng)周期出現(xiàn)波動(dòng)，導(dǎo)致患者在位和異位內(nèi)膜細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的敏感性減弱［14］，而游泳運(yùn)動(dòng)可使FAS mRNA 及蛋白水平增加，因而異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡增加，病變減小。本研究結(jié)果也顯示，在子宮內(nèi)膜異位癥誘導(dǎo)后進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng)的大鼠MMP9 和PCNA mRNA 水平顯著降低。此外，Western blot 結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜異位癥后進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng)大鼠的PCNA 和MMP9 蛋白降低。MMP9 是金屬基質(zhì)蛋白酶家族中分子量最大的明膠酶，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞出芽，導(dǎo)致新生血管形成，因而其在子宮內(nèi)膜細(xì)胞的異位勃附、種植和生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用［15］。因而MMP9 蛋白水平降低可使子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞的增殖、遷移和分化減少。PCNA 基因是反應(yīng)細(xì)胞增殖的指標(biāo)。PCNA 存在于細(xì)胞核中，是DNA 聚合酶δ的輔助蛋白，為DNA 復(fù)制所必需，可作為細(xì)胞增殖有效標(biāo)志物［16］。本研究結(jié)果顯示游泳運(yùn)動(dòng)可使PCNA 蛋白表達(dá)降低，可抑制大鼠異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞增生。

總之，本研究結(jié)果表明，造模后游泳運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)調(diào)節(jié)FAS、MMP9 和PCNA 蛋白，從而對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)揮有益作用。