姜黃素通過上調(diào)miR-124抑制牙齦卟啉單胞菌LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞炎癥反應(yīng)*

李坤陽， 陳 棟， 左春然， 劉愛群， 朱蘭省， 牛 兵 △

［1河南省中醫(yī)院（河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院）口腔科，河南鄭州450001；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院（河南省口腔醫(yī)院）口腔科，河南鄭州450052］

牙周病是菌斑微生物引發(fā)的感染性疾病，其中牙周炎是成人失去牙齒主要原因，不僅影響牙周組織健康、引發(fā)神經(jīng)炎癥增加，還與糖尿病、腦血管疾病和阿爾茨海默氏病的關(guān)系密切［1］，影響患者健康。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）作為牙周炎主要致病菌，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是主要毒力因子，可導(dǎo)致牙周組織細胞破壞，加重牙周炎病程［2］。減少Pg LPS 的毒性作用對于緩解牙周炎至關(guān)重要。姜黃素（curcumin，Cur）是從姜黃中提取的酚類色素，具有抗炎和抗氧化等多種作用，在人牙髓干細胞中可促進組織修復(fù)［3］；可緩解LPS誘導(dǎo)成骨細胞線粒體功能改變，并且使細胞凋亡數(shù)目明顯減少［4］。微小 RNA-124（microRNA-124，miR-124）是一個重要的炎癥相關(guān)miRNA，可抑制下游核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）活化發(fā)揮抗炎作用［5］。Cur 是否影響miR-124 的表達進而影響炎癥作用尚未發(fā)現(xiàn)報道。本研究采用Pg LPS誘導(dǎo)人牙齦成纖維細胞（human gingival fibroblasts，HGFs）建立HGFs 炎癥模型，探究Cur對HGFs炎性反應(yīng)的影響。

材料和方法

1 細胞

HGFs購自貝納生物（編號BNCC339845）。

2 藥品、試劑及儀器

Pg LPS和Cur 均購自 R&D Systems（貨號分別為ATCC33277 和C1385G）；免疫細胞化學(xué)染色試劑盒購自Protein（貨號為BPICC30-1KT）；抗波形蛋白、角蛋白、NF-κB p-p65、骨架蛋白（F-actin）、GADPH和lamin B1 抗體，白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒均購自Abcam（貨號分別為ab92547、ab155078、ab222494、ab112127、ab181602、ab220797、ab1793 和ab9722）；CCK-8 試劑盒（貨號為C0037）購自碧云天生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒、miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit和2× SYBR qPCR Mix 均購自天根生化科技（北京）有限公司（貨號分別為 DP405、KR211和KR108）；核蛋白和胞漿提取試劑盒購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司（貨號為KGF1100）。CO2培養(yǎng)箱購自上海精密儀器有限公司（型號為LRH-70F）；酶標儀購自賽默飛世爾科技有限公司（型號為Varioskan LUX）；實時熒光定量PCR 儀購自ABI（型號為7500）；蛋白凝膠成像儀購自BIO-RAD（型號為GelDoc 2000）。

3 方法

3.1 實驗分組 將HGFs 分為對照（control）組、LPS組和 LPS+Cur（20、40 和80 μmol/L）組。除 control 組外，其余各組用 10 mg/L LPS［6］處理，同時各 LPS+Cur組分別添加 20、40和80 μmol/L Cur 置于 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.2 CCK-8法檢測細胞活力 按3.1方法各組細胞置于96孔板中，分別培養(yǎng)24 h，添加CCK-8試劑，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標儀檢測450 nm 處各孔細胞吸光度（A）值。每個樣品做6個重復(fù)。

3.3 ELISA 檢測上清液中炎癥因子 IL-1β和TNF-α水平 按3.1 方法處理各組細胞，置于6 孔板中培養(yǎng)24 h，收集細胞培養(yǎng)液，3 000 r/min離心5 min收集上清，分裝后置于4℃冰箱待用。嚴格按照人IL-1β 和TNF-α ELISA 試劑盒說明書檢測上清液中 IL-1β 和TNF-α水平。

3.4 RT-qPCR 法檢測細胞中miR-124 的水平 收集完細胞培養(yǎng)液后用RNA 提取試劑盒提取細胞的總RNA，miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit 將其逆轉(zhuǎn)錄成第1 鏈cDNA。采用RT-qPCR 實驗對miR-124 和內(nèi)參照 U6 進行擴增，反應(yīng)體系為 10 μL 2×SYBR qPCR Mix、1 μL 40 mg/L cDNA、各0.5 μL 上、下游引物（10 μmol/L）和8 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：95℃ 30 s；95℃ 30 s，62℃ 35 s，45個循環(huán)。miR-124的上游引物序列為5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAG -TACA-3'，下游引物序列為5'-GGTGGCTTATGTTTGTAATCCC-3'；U6 的上游引物序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列為 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。2-ΔΔCt法計算 miR-124 的相對表達水平。

3.5 Western blot 檢測細胞胞漿和胞核中NF-κB pp65 蛋白的水平 按3.1 方法處理各組細胞，置于6孔板中培養(yǎng)24 h，收集細胞置1 mL 離心管中，PBS 重懸清洗細胞，500×g離心5 min，移去上清液，加入預(yù)冷的胞漿提取試劑Ⅰ充分震蕩直至離心管中出現(xiàn)均勻無殘留細胞團塊得到渾濁液體，振蕩器上震蕩15 s 后冰上放置10 min，加入胞漿提取試劑Ⅱ混勻，4℃、16 000×g離心5 min，立即取上清液為胞漿，立即吸出至新的EP 管中保存待用。加入預(yù)冷的核蛋白提取試劑震蕩混勻，振蕩器上震蕩15 s 后冰上放置10 min，重復(fù)4次，4℃、16 000×g離心5 min，立即取上清液為胞核，立即吸出至新的EP 管中保存待用。凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；對應(yīng)加入I 抗［NF-κB p65、內(nèi)參照GADPH（胞漿）和lamin B1（胞核）］，4℃孵育過夜；加入對應(yīng)Ⅱ抗，室溫孵育1 h。DAB 顯色試劑盒避光顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

3.6 激光共聚焦顯微鏡檢測NF-κB p-p65蛋白入核情況 按3.1 處理各組細胞24 h 后的爬片，加入無水乙醇固定 30 min，PBS 清洗，200 μL 4%Triton 靜置15 min，滴加NF-κB p-p65（綠色熒光）和F-actin（紅色熒光）單克隆抗體，室溫孵育1 h，PBS 清洗，加入DAPI后室溫孵育5 min，PBS清洗，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

3.7 過表達miR-124 檢測細胞胞漿和胞核中NF-κB p-p65 蛋白的水平 在上述實驗基礎(chǔ)上添加mimic-NC 組和 miR-124 mimic 組，各組 10 mg/L LPS處理并同時添加mimic-NC 和miR-124 mimic，其余培養(yǎng)條件與3.2 培養(yǎng)過程相同，檢測control 組、LPS 組、mimic-NC 組和 miR-124 mimic 組細胞中 miR-124 的水平，并檢測細胞胞漿和胞核中NF-κB p-p65蛋白的水平，實驗方法同3.4和3.5。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 25.0 和GraphPad 8.0 進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）描述，多組間比較采用方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q法。當P＜0.05 時認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Cur對細胞活力的影響

LPS 組細胞的活力水平低于 control 組（P＜0.05）；LPS+Cur（40和80 μmol/L）組細胞的活力高于LPS組（P＜0.05），見圖1。

Figure 1.Comparison of viability in each group after the cells were treated for 24 h.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖1 各組細胞處理24 h活力的比較

2 Cur 對細胞上清液中 IL-1β和TNF-α 水平的影響

LPS 組細胞上清液的 IL-1β和TNF-α 水平高于control 組（P＜0.05）；LPS+40 μmol/L Cur 組細胞上清液的 TNF-α 及 LPS+80 μmol/L Cur 組細胞上清液的IL-1β和TNF-α水平低于LPS組（P＜0.05），見圖2。

3 Cur對細胞中miR-124水平的影響

LPS 組細胞的 miR-124 水平低于 control 組（P＜0.05）；LPS+Cur（40和80 μmol/L）組細胞的miR-124水平高于LPS組（P＜0.05），見圖3。

4 Cur對細胞中NF-κB p-p65蛋白的影響

LPS組細胞漿的NF-κB p-p65蛋白水平低于control 組（P＜0.05）；LPS+Cur（40和80 μmol/L）組細胞漿的NF-κB p-p65蛋白水平高于LPS 組（P＜0.05），見圖 4。LPS 組細胞核的 NF-κB p-p65 蛋白水平高于control 組（P＜0.05）；LPS+Cur（40 和80 μmol/L）組細胞核的NF-κB p-p65 蛋白水平低于 LPS 組（P＜0.05），見圖5。

Figure 2.Comparison of the IL-1 β and TNF-α levels in the supernatant of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖2 各組細胞上清液的IL-1β和TNF-α水平比較

Figure 3.Comparison of miR-124 levels in the cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖3 各組細胞的miR-124水平的比較

5 Cur對細胞中NF-κB p-p65位置的影響

NF-κB p-p65 顯示為綠色，F(xiàn)-actin 顯示為紅色。圖 6 中 Merged 1 顯示組合的 NF-κB p-p65和F-actin，Merged 2顯示組合的NF-κB p-p65、F-actin和核染色。control 組細胞核的 NF-κB p-p65 較少；LPS 組細胞核的 NF-κB p-p65 明顯高于 control 組；與 LPS 組相比，LPS+Cur（20、40和80 μmol/L）組細胞核的 NF-κB pp65 減少；且隨著 Cur 劑量升高，細胞核的 NF-κB pp65減少，見圖6。

6 過表達miR-124細胞中miR-124表達水平

LPS 組和 mimic-NC 組細胞的 miR-124 水平低于control 組（P＜0.05）；miR-124 mimic 組細胞的 miR-124水平高于LPS 組和mimic-NC 組（P＜0.05），見圖7。

Figure 4.The protein level of NF-κB p-p65 in the cytoplasm of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖4 各組細胞細胞漿的NF-κB p-p65蛋白水平的變化

Figure 5.The protein level of NF-κB p-p65 in the cell nucleus of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖5 各組細胞細胞核的NF-κB p-p65蛋白水平的變化

Figure 6.The changes of NF-κB p-p65 in the cells of each group（DAPI double staining，the scale bar=100 μm）.圖6 各組細胞中NF-κB p-p65的變化

Figure 7.Comparison of miR-124 levels in the cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖7 各組細胞的miR-124水平的比較

7 過表 達 miR-124 細胞的 NF-κB p-p65 蛋白 的影響

LPS 組和 mimic-NC 組細胞漿的 NF-κB p-p65 蛋白水平低于control 組（P＜0.05）；miR-124 mimic 組細胞漿的NF-κB p-p65 蛋白水平高于LPS 組和mimic-NC 組（P＜0.05），見圖 8。LPS 組和 mimic-NC 組細胞核的NF-κB p-p65蛋白水平高于control組（P＜0.05）；miR-124 mimic 組細胞核的 NF-κB p-p65 蛋白水平低于LPS組、mimic-NC組（P＜0.05），見圖9。

討 論

牙周疾病涉及宿主免疫反應(yīng)的激活，不僅充當牙周組織抵抗細菌侵襲的防御者，而且還充當組織破壞的介體，影響機體健康［7］。牙菌斑生物膜中微生物引起的牙周支持組織慢性感染疾病會導(dǎo)致牙周支持組織發(fā)生炎癥和牙周袋形成；進一步導(dǎo)致進行性附著喪失和牙槽骨吸收，牙周骨喪失［8］，影響患者牙齒健康。Cur 具有抗炎和抗腫瘤等作用，同時低毒、安全、耐受性好［9］；在線結(jié)扎誘導(dǎo)大鼠實驗性牙周炎模型中可抑制牙齦炎癥，對牙周組織起保護作用［10］，但在人中尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究。

Figure 8.The protein level of NF-κB p-p65 in the cytoplasm of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖8 各組細胞細胞漿的NF-κB p-p65蛋白水平的變化

Figure 9.The protein level of NF-κB p-p65 in the cell nucleus of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖9 各組細胞細胞核的NF-κB p-p65蛋白水平的變化

IL-1β 屬典型致炎因子，可促進炎癥反應(yīng)，在牙周炎中高表達，可作為治療牙周炎抗炎效果的標志物［11］；TNF-α 參與炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，可激活破骨細胞活性促進牙槽骨吸收從而損害牙周組織［12］。IL-1β和TNF-α 協(xié)同刺激可抑制破骨細胞增殖、分化。本研究發(fā)現(xiàn)LPS 組細胞活力低于control 組，提示Pg LPS 誘導(dǎo)HGFs 后抑制細胞活力，細胞生長受到影響。Pg LPS 誘導(dǎo) HGFs 可使細胞上清液中 IL-1β 和TNF-α 水平升高，提示 IL-1β和TNF-α 可能損害HGFs 導(dǎo)致細胞炎癥嚴重，進而影響細胞生長。Cur處理Pg LPS 誘導(dǎo)的HGFs，隨著劑量增加，細胞活性逐漸恢復(fù)，上清液中 IL-1β和TNF-α 水平逐漸降低，提示 Cur 可以減少 IL-1β和TNF-α 釋放從而緩解炎癥作用，但具體機制尚不清楚。

NF-κB 可參與應(yīng)激反應(yīng)、免疫和炎性疾病等過程，在牙周炎中可誘導(dǎo)炎癥因子表達從而發(fā)揮促炎作用［13］。NF-κB 特異性藥理抑制劑加入變形鏈球菌共培養(yǎng)的HGFs 可促進細胞增殖和膠原合成從而改變細胞活力和黏附性，改善 HGFs 狀態(tài)［14］。IL-1β 和TNF-α 激活表面的細胞因子受體導(dǎo)致NF-κB 從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移向細胞核，從而促進炎癥介質(zhì)表達，促進炎癥反應(yīng)［15］；活化 TNF-α 激活 NF-κB 信號通路進而抑制牙周膜干細胞成骨分化導(dǎo)致組織受損［16］。若將NF-κB 抑制在細胞漿中將會下調(diào)NF-κB 活化水平從而抑制炎癥發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)LPS 組細胞漿中NF-κB p-p65 蛋白水平低于 control 組，細胞核中 NF-κB pp65蛋白水平高于control組，激光共聚焦顯微鏡同樣發(fā)現(xiàn)LPS 組NF-κB p-p65 蛋白向核轉(zhuǎn)移較明顯，提示可能是由于IL-1β 和TNF-α 等促炎因子的刺激導(dǎo)致NF-κB 從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移向細胞核發(fā)揮炎癥作用和抑制HGFs生長。Cur處理Pg LPS 誘導(dǎo)的HGFs，隨著劑量增加，細胞漿中NF-κB p-p65 蛋白水平升高、細胞核中 NF-κB p-p65 蛋白水平降低，NF-κB p-p65 活性被抑制從而減緩炎癥反應(yīng)，緩解疾病。

miRNA 在炎癥中研究廣泛，外傷性腦損傷后小膠質(zhì)外泌體中miR-124 的增加抑制神經(jīng)元炎癥［17］；miR-124 可通過NF-κB 信號通路調(diào)節(jié)鼻咽癌細胞增殖和凋亡［18］；在Amadori糖化白蛋白誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞活化和炎癥中miR-124 表達下調(diào)，下調(diào)miR-124 表達可刺激NF-κB p65 磷酸化并誘導(dǎo)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞釋放TNF-α 從而加重炎癥反應(yīng)［19］。本研究發(fā)現(xiàn)LPS組細胞中miR-124水平低于control 組，提示 miR-124 在 Pg LPS 誘導(dǎo) HGFs 中表達下調(diào)，促進炎癥反應(yīng)，可能是 miR-124 下調(diào)促進 NF-κB p-p65 活化誘導(dǎo)炎癥因子 IL-1β和TNF-α 激活并釋放，IL-1β和TNF-α 激活后進一步促進NF-κB 從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移向細胞核加重炎癥反應(yīng)。Cur處理Pg LPS誘導(dǎo)的HGFs后miR-124 水平升高，且進一步發(fā)現(xiàn)，miR-124 mimic組細胞漿中NF-κB p-p65 蛋白水平高于LPS 組，細胞核中 NF-κB p-p65 蛋白水平低于 LPS 組，Cur 處理與過表達miR-124 功能類似，均可高表達miR-124 從而緩解上述過程從而實現(xiàn)對HGFs的保護。

綜上所述，Cur 可能通過上調(diào)miR-124 進而抑制NF-κB p-p65入核實現(xiàn)對Pg LPS誘導(dǎo)的HGFs炎性反應(yīng)的保護。但Cur 藥理機理復(fù)雜，miR-124 有多個調(diào)控位點，Cur 具體影響miR-124 調(diào)控位點尚未清楚，也是接下來研究重點。