繡球菌母種培養(yǎng)基優(yōu)化

郭 燁，褚潤(rùn)根，王小軍，廉 藺，張曉丹，江 山

（山西省蔬菜產(chǎn)業(yè)管理站，山西 太原 030002）

繡球菌（Sparassis crispa（Wulf.）Fr.）隸屬于非褶菌目、繡球菌科、繡球菌屬，俗稱繡球蕈、對(duì)花菌、干巴菌、椰菜菌、蜂窩菌、白繡球花[1-2]，是一種珍稀名貴的食藥用菌，它在食用菌中僅次于冬蟲夏草、羊肚菌、塊菌等珍品。其香味怡人、肉質(zhì)脆嫩、口感佳美、風(fēng)味獨(dú)特，被國(guó)內(nèi)外美食家公認(rèn)為食用菌珍品[3]。繡球菌中含有大量的蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素及粗纖維等營(yíng)養(yǎng)成分。尤其是β- 葡聚糖含量高達(dá)40%～50%。β- 型葡聚糖是一種生物活性物質(zhì)，經(jīng)醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗輻射、降血糖、降血脂、保肝等多種功能[4-6]。

我國(guó)20 世紀(jì)80 年代開始繡球菌的人工馴化研究，2005年才首次突破瓶頸，實(shí)現(xiàn)繡球菌的人工栽培[7]，成為繼日本、韓國(guó)之后第3 個(gè)實(shí)現(xiàn)繡球菌人工栽培的國(guó)家[8]，但仍處于初級(jí)階段，其菌種制作還是采用原始的制作方法。與常見食用菌種類其母種7 d 就能長(zhǎng)滿試管相比，繡球菌母種至少需要15 d 才能長(zhǎng)滿試管，這與其培養(yǎng)基成分的不合理造成菌絲生長(zhǎng)緩慢有關(guān)[9]。本試驗(yàn)通過測(cè)定菌絲生長(zhǎng)效率對(duì)繡球菌母種培養(yǎng)基中碳氮比、pH、無機(jī)鹽、松木屑浸出液添加量等單因素進(jìn)行了研究，而后通過正交試驗(yàn)確定出其母種培養(yǎng)基最佳配方，為繡球菌生產(chǎn)提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

繡球菌“閩秀1 號(hào)”，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌中心提供。

1.2 培養(yǎng)料配方

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，0.1%蛋白胨，0.1%磷酸二氫鉀，0.05%硫酸鎂。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 碳氮比單因素試驗(yàn)

將活化的繡球菌菌塊（5 mm）分別接種于不同碳氮比培養(yǎng)基中，24℃恒溫暗培養(yǎng)18 d，碳氮比分別為5∶1，10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，其他同供試培養(yǎng)基。用十字交叉劃線法測(cè)定菌絲生長(zhǎng)效率。

1.3.2 pH 單因素試驗(yàn)

按照上述配方配置培養(yǎng)基，用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH，梯度為1，范圍為4～9，測(cè)定繡球菌菌絲在每種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)效率。

1.3.3 無機(jī)鹽單因素試驗(yàn)

按照上述配方配置培養(yǎng)基，分別配置含量為0.1%的不同無機(jī)鹽：硫酸鎂，硫酸銅，硫酸亞鐵，硫酸鈉，硫酸鉀，測(cè)定繡球菌菌絲在每種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)數(shù)率。

1.3.4 松木屑浸出液添加量單因素試驗(yàn)

松木屑煮沸30 min，過濾后按比例10%、20%、30%、40%、50%調(diào)配制成培養(yǎng)基，測(cè)定繡球菌菌絲在每種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)數(shù)率。

1.3.5 正交試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)確定對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響較大的單個(gè)因素進(jìn)行（L934）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[10]，優(yōu)化繡球菌母種培養(yǎng)基參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳氮比對(duì)繡球菌菌絲生長(zhǎng)的影響結(jié)果

由圖1 可知，不同碳氮含量對(duì)繡球菌菌絲生長(zhǎng)影響不同。隨著碳氮比的增加，菌絲生長(zhǎng)效率呈現(xiàn)先增加后下降趨勢(shì)。低碳氮含量或高碳氮含量菌絲均生長(zhǎng)均極為緩慢。在5∶1～15∶1 范圍內(nèi)，隨著碳氮比的增加，菌絲生長(zhǎng)數(shù)率逐漸增加。當(dāng)碳氮比為15∶1 時(shí)，菌絲生長(zhǎng)效率最快，可達(dá)1.23 mm/d，而后開始下降，達(dá)到25∶1 以上時(shí)，菌絲幾乎不生長(zhǎng)。

2.2 不同pH 對(duì)繡球菌菌絲生長(zhǎng)的影響結(jié)果

由圖2 可知，當(dāng)pH 為5 時(shí)，菌絲生長(zhǎng)效率最快，可達(dá)1.25 mm/d。pH 為4 時(shí)，菌絲生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)效率明顯低于pH為5。當(dāng)pH＞5 時(shí)，隨著pH 的增加，菌絲生長(zhǎng)效率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，當(dāng)pH 為9 時(shí)，菌絲基本停止生長(zhǎng)，只在菌種塊上部出現(xiàn)萌發(fā)的氣生菌絲。較高的pH 使得菌絲尖端氫離子含量較少，細(xì)胞內(nèi)氫離子含量高于胞外氫離子含量，造成細(xì)胞內(nèi)外氫離子含量不平衡，菌絲無法分化和生長(zhǎng)[11]。

2.3 不同無機(jī)鹽對(duì)繡球菌菌絲生長(zhǎng)的影響結(jié)果

由圖3 可知，繡球菌菌絲在不同無機(jī)鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)效率不同。當(dāng)以硫酸鎂為無機(jī)鹽時(shí)菌絲生長(zhǎng)較快，其次是硫酸鈉和硫酸鉀。在硫酸亞鐵和硫酸銅培養(yǎng)基中，菌絲基本不生長(zhǎng)。鎂離子可能是繡球菌生長(zhǎng)的最佳無機(jī)鹽離子，亞鐵離子和銅離子對(duì)菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用。

2.4 不同松木屑浸出液對(duì)繡球菌菌絲生長(zhǎng)的影響結(jié)果

由圖4 可知，隨著松木屑浸出液的添加量的增加，繡球菌菌絲生長(zhǎng)數(shù)率呈先增加后下降的趨勢(shì)。當(dāng)添加量達(dá)到40%，菌絲生長(zhǎng)達(dá)到最大值為0.92 mm/d。當(dāng)添加量增加到50%時(shí)，菌絲生長(zhǎng)數(shù)率明顯下降。

2.5 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

基于上述碳氮比、pH、無機(jī)鹽和松木屑浸出液添加量4個(gè)因素對(duì)繡球菌母種生長(zhǎng)數(shù)率的影響結(jié)果，選擇無機(jī)鹽的最優(yōu)條件即磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%預(yù)處理，進(jìn)行碳氮比、pH、松木屑浸出液添加量3 個(gè)因素的正交試驗(yàn)（L934），正交因素水平表見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。

表1 正交試驗(yàn)（L934）因素水平表Tab.1 Orthogonal Test (L934) factor level table

由表2 可知，碳氮比、pH、松木屑浸出液添加量3 個(gè)因素的極差R 值均大于可以代表試驗(yàn)誤差的空列的極差R 值，因此三者在繡球菌母種培養(yǎng)基中有重要的作用；在此工藝中各因素主次順序?yàn)锳＞B＞C，即pH 最大，其次是松木屑浸出液添加量，最后為碳氮比。繡球菌母種培養(yǎng)基最優(yōu)配比是A3B1C3 ，即pH 5.5，松木屑浸出液添加量和碳氮比分別為35%和17/1，而且此最優(yōu)水平組合與正交試驗(yàn)組中得到的第7 組試驗(yàn)是一致的，因此最優(yōu)組合繡球菌母種培養(yǎng)基配比得以確定，此時(shí)繡球菌母種菌絲生長(zhǎng)數(shù)率最快為1.39 mm/d。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果Tab.2 Results of orthogonal design

3 討論

繡球菌的人工栽培在我國(guó)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了工廠化，但是存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)、產(chǎn)率低、栽培技術(shù)不成熟等問題[12-13]。這些問題嚴(yán)重制約其工廠化生產(chǎn)的發(fā)展，菌種生產(chǎn)是食用菌栽培至關(guān)重要的首要環(huán)節(jié)，菌種的生產(chǎn)方式和活性高低是影響食用菌產(chǎn)量和質(zhì)量的首要因素。與林衍銓[14]等研究結(jié)果相比，本試驗(yàn)在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上重點(diǎn)對(duì)影響菌絲生長(zhǎng)的碳氮比、松木屑浸出液、無機(jī)鹽等進(jìn)行了研究，并通過單因素和正交試驗(yàn)對(duì)繡球菌母種培養(yǎng)基配方進(jìn)行了優(yōu)化，以期獲得繡球菌的最佳母種培養(yǎng)基配方，從而為繡球菌的菌種標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)以及菌種擴(kuò)繁與保藏提供參考。

pH 值通過影響細(xì)胞內(nèi)外的氫離子濃度來影響菌絲的生長(zhǎng)，合適的pH 可使細(xì)胞內(nèi)外氫離子濃度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，菌絲加速生長(zhǎng)。偏酸或者偏堿，細(xì)胞內(nèi)外氫離子濃度不平衡，能量供應(yīng)途徑發(fā)生變化，菌絲生長(zhǎng)受阻。本試驗(yàn)中通過單因素試驗(yàn)確定，繡球菌菌絲生長(zhǎng)的最佳pH 值為5，此時(shí)菌絲生長(zhǎng)達(dá)到最佳生長(zhǎng)速度。

無機(jī)鹽是食用菌生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，其主要參與細(xì)胞物質(zhì)的組成及酶的組成、維持酶的作用、控制原生態(tài)膠態(tài)和調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓等[15]。無機(jī)鹽的種類對(duì)于菌絲活性和細(xì)胞生長(zhǎng)至關(guān)重要，本試驗(yàn)選用了5 種無機(jī)鹽，測(cè)定菌絲生長(zhǎng)數(shù)率研究其對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明鎂離子能夠促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)，其他幾種無機(jī)鹽對(duì)菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用。