雞BRD2亞細(xì)胞定位及其組織表達(dá)特性分析

韓一帆　周磊　袁超　高洪波　王燕碧　趙采芹　唐宏　段志強(qiáng)

摘要：【目的】明確含溴結(jié)構(gòu)域蛋白2（BRD2）的亞細(xì)胞定位及其表達(dá)特征，為后續(xù)研究BRD2基因調(diào)控雞組織發(fā)育的作用機(jī)制提供參考依據(jù)。【方法】通過構(gòu)建雞BRD2基因重組真核表達(dá)載體pEGFP-BRD2，轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞（HEK-293T）后檢測重組蛋白EGFP-BRD2的表達(dá)情況及亞細(xì)胞定位;利用實時熒光定量PCR分別檢測雞胚14胚齡（E14 d）、雞出殼后1日齡（1 d）、7日齡（7 d）和14日齡（14 d）4個時間點各組織中BRD2基因的表達(dá)情況。【結(jié)果】重組真核表達(dá)載體pEGFP-C1-BRD2轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞獲得的融合蛋白EGFP-BRD2約115.00 kD，且主要定位在細(xì)胞核。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，雞BRD2基因在E14 d和1 d肌胃中的相對表達(dá)量最高，在7和14 d肺臟中的相對表達(dá)量最高。BRD2基因在各組織的表達(dá)規(guī)律為：在眼球內(nèi)E14 d到14 d的表達(dá)先下降后趨于穩(wěn)定;在腦組織和心臟內(nèi)的表達(dá)在E14 d至14 d間呈先下降后上升的變化趨勢;在肝臟內(nèi)E14 d表達(dá)穩(wěn)定，1 d后開始逐漸增加，至14 d時達(dá)最高值;在肺臟中E14 d的表達(dá)下降，1 d后急劇上升，至14 d時達(dá)最高值;在肌胃和胸肌中，均在7 d時最高，1 d時最低，E14 d和14 d時有較高表達(dá)，整體上呈倒N表達(dá)模式;在腿肌中，從E14 d到1 d表達(dá)減少，而后略有增加，7 d后開始下降，至14 d時降到最低值?！窘Y(jié)論】雞BRD2基因重組真核表達(dá)載體能在HEK-293T細(xì)胞中正確表達(dá)，且融合蛋白主要定位在細(xì)胞核;BRD2基因在雞不同發(fā)育階段的各組織中均有表達(dá)，但其表達(dá)量呈現(xiàn)不同的變化趨勢。

關(guān)鍵詞： 雞;含溴結(jié)構(gòu)域蛋白2（BRD2）;亞細(xì)胞定位;表達(dá)規(guī)律;組織發(fā)育

中圖分類號： S831.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）08-1857-07

Subcellular localization of chicken bromodomain-containing protein 2（BRD2） and its expression characteristics

HAN Yi-fan， ZHOU Lei， YUAN Chao， GAO Hong-bo， WANG Yan-bi，

ZHAO Cai-qin， TANG Hong， DUAN Zhi-qiang*

（College of Animal Sciences， Guizhou University/Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction in the Plateau Mountains Region， Ministry of Education/Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and

Reproduction in Guizhou， Guiyang? 550025， China）

Abstract：【Objective】This study aimed to investigate the subcellular localization of chicken（Gallus gallus） bromodomain-containing protein 2 （BRD2）and analyze its expression characteristics in different tissues of chickens， which could provide the reference for subsequent research on the mechanism of BRD2 gene regulating chicken tissue development.【Method】The recombinant eukaryotic expression vector PEGFP-BRD2 of chicken BRD2 gene was constructed and transfected into human embryonic kidney cells（HEK-293T）. The expression and subcellular localization of the recombinant protein EGFP-BRD2 were examined by Western blot and inverted fluorescence microscope，respectively. In addition，real-time fluorescence quantitative? PCR（qRT-PCR）was used to detect the expression patterns of BRD2 gene in different tissues at chicken embryo 14 days（E14 d），1-day-old（1 d），7-day-old（7 d），and 14-day-old（14 d）. 【Result】The results showed that pEGFP-C1-BRD2 transfected HEK-293T cells，and the obtained fusion protein EGFP-BRD2 was about 115.00 kD and localized mainly in the nucleus. The qRT-PCR results showed that BRD2 gene had the highest relative expression in the stomach of chicken at E14 d and 1 d，and the lung at 7 d and 14 d. The expression pattern of BRD2 gene in various tissues revealed that the expression of BRD2 gene in the eye ball was first decreased and then stabilized from E14 d to 14 d，while in the brain and heart between E14 d to 14 d showed a trend from decline to increase. As for the liver and lung， it showed the stable expression in the liver on E14 d， gradually increased after 1 d and reached the peak on 14 d; it decreased expression in the lung at E14 d，? began to increase sharply after 1 d and reached the highest level at 14 d. In the stomach and pectoral muscle， the expression pattern of BRD2 gene was inverted N，showing that it was the highest at 7 d and the lowest at 1 d，but had? ?high expression at E14 d and 14 d. However，in leg muscles， the expression of BRD2 decreased from the E14 d to 1 d， then increased slightly， and began to decrease at 7 d and reached the lowest level at 14 d.【Conclusion】The chicken BRD2 gene recombinant eukaryotic expression vector is correctly expressed in HEK-293T cells and the fusion protein is mainly located in the nucleus. The qRT-PCR result shows that the chicken BRD2 gene is expressed in various tissues at different stages of chicken development， but its expression level shows different trends.

Key words： chicken; bromodomain-containing protein 2（BRD2）; subcellular localization; expression regulation; tissue development

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31960698，31760732）; Guizhou Science and Technology Planning Project（QKHPTRC〔2017〕5788）

0 引言

【研究意義】含溴結(jié)構(gòu)域蛋白2（Bromodomain-containing protein 2，BRD2）又稱RING3（Really inte-resting new gene 3 protein）（Denis and Green，1996），是一種能特異性識別乙酰化賴氨酸殘基的保守蛋白，具有2個串聯(lián)的N-末端溴結(jié)構(gòu)域（Bromodomain，BD）和1個保守的C-末端外結(jié)構(gòu)域（Extra-terminal domain，ET）。其中，BD結(jié)構(gòu)域是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)模塊，也是唯一可識別和結(jié)合發(fā)生組蛋白乙?；嚢彼釟埢慕Y(jié)構(gòu)域（Sanchez and Zhou，2009）;而ET結(jié)構(gòu)域是轉(zhuǎn)錄復(fù)合物與乙?；M蛋白結(jié)合為基因轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)節(jié)器。BRD2在基因表達(dá)和表觀遺傳方面發(fā)揮重要作用，可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平（Peterson and Laniel，2004），參與細(xì)胞周期過程。因此，對雞BRD2基因進(jìn)行表達(dá)及相關(guān)分析可為后續(xù)研究BRD2基因調(diào)控雞組織發(fā)育的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】BD結(jié)構(gòu)域是一種在物種進(jìn)化上高度保守的結(jié)構(gòu)域，最早由Tamkun等（1992）發(fā)現(xiàn)并定名，一般由60～110個高度保守的氨基酸殘基組成，其中含有4個反向平行的α-螺旋（αZ、αA、αB和αC），通過2個可變?nèi)嵝原h(huán)狀結(jié)構(gòu)（Variable-loop）將這4個α-螺旋兩兩相連，第一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)連接αZ和αA，因此被稱為ZA loop，另一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)連接αB與αC，而被稱為BC loop;ZA loop和BC loop結(jié)合成一個左旋結(jié)構(gòu)域，幾個α-螺旋的末端2個環(huán)狀結(jié)構(gòu)共同組成與核小體組蛋白中乙酰化賴氨酸相互作用的疏水口袋（Filippakopoulos et al.，2012）。由于BD結(jié)構(gòu)域可識別和結(jié)合組蛋白乙酰化的賴氨酸，因此BRD2也是表觀遺傳領(lǐng)域研究的主要方向之一（Ferri et al.，2016）。已有研究表明，BRD2在果蠅（Drosophila melanogaster）、小鼠（Mus musculus）及人類（Homo sapiens）的胚胎生長發(fā)育過程中起重要調(diào)控作用，特別是在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中作用較明顯，如BRD2基因在神經(jīng)系統(tǒng)胚胎早期的發(fā)育過程中呈高度表達(dá)，當(dāng)神經(jīng)元增殖后，BRD2基因能利用基因調(diào)控的方式豐富新生神經(jīng)元細(xì)胞種類（Crowley et al.，2004）。張學(xué)思（2015）對成年小鼠的大腦皮質(zhì)進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)BRD2基因主要表達(dá)于神經(jīng)元中，同樣提示BRD2對成年動物神經(jīng)元發(fā)育起調(diào)控作用。BRD2蛋白參與抗原呈遞加工、調(diào)控免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)免疫反應(yīng)和抑制細(xì)胞活性等免疫調(diào)節(jié)（Taniguchi，2016）。BRD2蛋白可作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子通過調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞周期蛋白，如Cyclin A、Cyclin E和Cyclin D及激活E2F轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)控細(xì)胞周期（Sinha et al.，2005）。此外，BRD2被認(rèn)為與多種疾病有關(guān)，如與青少年肌陣攣性癲癇相關(guān)（Pathak et al.，2018），在慢性炎癥和胰島素抵抗中發(fā)揮作用（Sun et al.，2017），或抑制BRD2表達(dá)可阻止部分腫瘤的發(fā)展（Sherman et al.，2017;周曉和程志祥，2019）。【本研究切入點】雞BRD2基因位于雞16號染色體主要組織相容性復(fù)合體（MHC）中MHC-B的核心區(qū)域（Miller et al.，1996），屬于MHC-Ⅱ類分子，與機(jī)體免疫調(diào)控相關(guān)。目前，有關(guān)BRD2的研究主要集中在人類和小鼠，對果蠅也有一些研究，但雞BRD2基因克隆、亞細(xì)胞定位及其在雞發(fā)育過程不同組織中的表達(dá)特征尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過克隆雞BRD2基因并構(gòu)建其重組真核表達(dá)載體pEGFP-BRD2，轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞（HEK-293T）進(jìn)行表達(dá)與亞細(xì)胞定位分析;并通過實時熒光定量PCR檢測BRD2基因在雞不同發(fā)育階段不同組織中的表達(dá)情況，為后續(xù)研究BRD2基因調(diào)控雞組織發(fā)育的作用機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 供試動物

SPF受精雞蛋購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司，在實驗室自行孵化。在雞胚發(fā)育第14 d（E14 d）及出殼后第1 d（1 d）、第7 d（7 d）和第14 d（14 d）4個時期各隨機(jī)選取3枚雞胚或3只小雞，分別采集眼球、腦組織、心臟、肝臟、肺臟、肌胃、胸肌和腿肌8個組織樣品，保存于-80 ℃用于總RNA提取。

1. 2 細(xì)胞、載體和試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞、真核表達(dá)載體pEGFP-C1、HEK-293T細(xì)胞由貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室保存提供。組織RNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司;2×Realstar Green Fast Mixture、DL5000 DNA Marker和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自Axy-Gen公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒購自QIAGEN公司;限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ及DNA高保真聚合酶購自Thermo Fisher公司;DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司;FuGENE?HD Transfection Rea-gent購自Promega公司;1×RIPA細(xì)胞裂解液（弱）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）、30% Acr-Bis（29∶1）、預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)和超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;HRP標(biāo)記的抗GFP鼠單克隆抗體購自Proteintech公司。

1. 3 引物合成

根據(jù)雞BRD2基因（GenBank登錄號XM_01529 4960）核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計雞BRD2基因的PCR擴(kuò)增引物和實時熒光定量PCR擴(kuò)增引物，以雞GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）基因作為內(nèi)參基因。所有引物（表1）均委托昆泰銳（武漢）生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1. 4 重組真核表達(dá)載體pEGFP-BRD2構(gòu)建

以雞胚成纖維細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，利用特異性引物BRD2-F/BRD2-R擴(kuò)增BRD2基因。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：cDNA模板4.0 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1.0 μL，MgSO4 1.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，Pfu Taq酶（5 U/μL）0.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，加ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 40 s，62 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。膠回收后的PCR產(chǎn)物和真核表達(dá)載體pEGFP-C1分別用XhoⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，膠回收目的片段后進(jìn)行連接，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上。挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，首先采用菌液PCR進(jìn)行鑒定，然后提取疑似陽性菌質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒送至重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。

1. 5 融合蛋白表達(dá)分析

將HEK-293T細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，等待細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右時，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法對pEGFP-BRD2和pEGFP-C1分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。至轉(zhuǎn)染后36 h，用1×RIPA細(xì)胞裂解液對細(xì)胞進(jìn)行裂解，并于4 ℃下離心收集上清液，加入適量蛋白上樣緩沖液處理后進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。PVDF膜在4 ℃下使用5%脫脂乳封閉2 h，加入經(jīng)1∶12000稀釋的HRP標(biāo)記的抗GFP鼠單克隆抗體在4 ℃下孵育過夜，隨后用TBST洗滌3次，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色并拍照。

1. 6 融合蛋白亞細(xì)胞定位分析

將培養(yǎng)的HEK-293T細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)80%左右，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pEGFP-BRD2和pEGFP-C1分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后棄6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS浸洗3次;加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，PBS浸洗3次;加入0.25% TritonX-100室溫破膜5 min，PBS浸洗3次;加入DAPI避光孵育5 min，PBS浸洗3次，最后置于倒置熒光顯微鏡下采集圖片。熒光圖片用Photoshop CS5進(jìn)行Merge處理。

1. 7 總RNA提取及cDNA合成

根據(jù)OMEGA試劑盒說明分別提取4個時期雞眼球、腦組織、心臟、肝臟、肺臟、肌胃、胸肌和腿肌的總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄過程按照北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行操作。反應(yīng)體系20.0 ?L：1000 ng/?L RNA模板1.0 ?L、50 ?mmol/L Oligo dT Primer 1.0 ?L、DEPC-ddH2O 7.0 ?L、2×Reaction Mix 10.0 ?L、StarScript II RT Mix 1.0 ?L。反應(yīng)條件：65 ℃ 5 min;42 ℃ 50 min;85 ℃ 5 min。

1. 8 BRD2基因在雞不同發(fā)育階段各組織中的表達(dá)分析

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，采用實時熒光定量PCR檢測BRD2基因在雞發(fā)育不同階段不同組織中的表達(dá)情況。反應(yīng)體系20.0 ?L：2×Realstar Green Fast Mixture 10.0 ?L，上、下游引物（10 ?mol/L）各0.5 ?L，cDNA模板1.0 ?L，ddH2O 8.0 ?L。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃ 15 s，退火30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)后進(jìn)行熔解曲線分析，溫度以5 ℃/s的速率從65 ℃遞增至95 ℃。

1. 9 統(tǒng)計分析

運(yùn)用2-ΔΔCt法對實時熒光定量PCR檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行計算分析。具體公式為：ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，選取眼球組織為對照，計算各組織樣品的ΔΔCt值，運(yùn)用2-ΔΔCt對目的基因的相對表達(dá)量進(jìn)行計算，并利用SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 重組真核表達(dá)載體pEGFP-BRD2鑒定結(jié)果

以雞胚成纖維細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，利用特異性引物成功擴(kuò)增得到與預(yù)期大小相符的雞BRD2基因條帶（圖1-A）。將PCR產(chǎn)物膠回收后與真核表達(dá)載體pEGFP-C1分別進(jìn)行雙酶切，再次進(jìn)行膠回收、連接和轉(zhuǎn)化，然后在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR鑒定，鑒定正確的菌液提取質(zhì)粒，通過雙酶切鑒定分別得到4700 bp左右的載體條帶和2340 bp的目的基因條帶（圖1-B）。測序結(jié)果顯示，雞BRD2基因正確插入到真核表達(dá)載體pEGFP-C1中，未發(fā)生閱讀框的移碼和基因突變，表明重組真核表達(dá)載體pEGFP-BRD2構(gòu)建成功。

2. 2 融合蛋白表達(dá)分析結(jié)果

為了解融合蛋白EGFP-BRD2在HEK-293T細(xì)胞中是否正確表達(dá)，利用Western blotting對其進(jìn)行檢測。結(jié)果（圖2）顯示，重組真核表達(dá)載體pEGFP-BRD2轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞后可獲得大小為115.00 kD左右的目的蛋白條帶，與預(yù)估結(jié)果（EGFP為28.00 kD，BRD2為85.66 kD）相符合;而空載體pEGFP-C1轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞后獲得的蛋白條帶位于28.00 kD附近，說明融合EGFP-BRD2在HEK-293T細(xì)胞中成功表達(dá)。

2. 3 融合蛋白亞細(xì)胞定位分析結(jié)果

為了解融合蛋白EGFP-BRD2在細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位情況，將重組真核表達(dá)載體pEGFP-BRD2和空載體pEGFP-C1分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，利用倒置熒光顯微鏡觀察融合蛋白的細(xì)胞熒光。結(jié)果（圖3）顯示，EGFP蛋白呈綠色熒光，DAPI染核后呈藍(lán)色熒光，兩者不完全重合;而融合蛋白EGFP-BRD2呈現(xiàn)的綠色熒光與DAPI染核的藍(lán)色熒光完全重組，表明融合蛋白EGFP-BRD2定位在細(xì)胞核。

2. 4 BRD2基因在雞不同發(fā)育階段各組織中的表達(dá)規(guī)律分析結(jié)果

采用實時熒光定量PCR檢測雞BRD2基因在E14、1、7和14 d各組織中的相對表達(dá)量，探究BRD2基因在雞不同發(fā)育階段各組織中的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果（圖4）表明，雞BRD2基因在E14 d的各組織中均有表達(dá)，其中肌胃中的相對表達(dá)量最高，肝臟中的相對表達(dá)量最低，各組織相對表達(dá)量排序為：肌胃>肺臟>眼球>心臟>腿肌>腦組織>胸肌>肝臟;在1 d的各組織中，BRD2基因在肌胃中的相對表達(dá)量最高，胸肌中的相對表達(dá)量最低，各組織相對表達(dá)量排序為：肌胃>眼球>肺臟>肝臟>腿肌>心臟>腦組織>胸肌;在7 d的各組織中，BRD2基因在肺臟中的相對表達(dá)量最高，且顯著高于其他組織（P<0.05，下同），其次是肌胃，在腦組織中的相對表達(dá)量最低，各組織相對表達(dá)量排序為：肺臟>肌胃>肝臟>胸肌>心臟>眼球>腿肌>腦組織;在14 d的各組織中，BRD2基因在肺臟中的相對表達(dá)量最高，顯著高于其他組織，在肝臟中的相對表達(dá)量其次，胸肌中的相對表達(dá)量最低，各組織相對表達(dá)量排序為：肺臟>心臟>肝臟>肌胃>眼球>腦組織>腿肌>胸肌。

對雞BRD2基因在不同發(fā)育階段各組織中的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行分析，結(jié)果（圖5）顯示，從E14 d到14 d，BRD2基因在眼球內(nèi)的表達(dá)先下降后趨于穩(wěn)定;在腦組織和心臟的表達(dá)呈先下降后上升的變化趨勢;在E14 d的肝臟內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定，從1 d開始逐漸增加，至14 d時達(dá)最高值;在肺臟中表現(xiàn)為1 d后急劇上升，至14 d時達(dá)最高值;在肌胃和胸肌中均在7 d時最高，1 d時最低，E14 d和14 d時有較高表達(dá)，整體表達(dá)呈倒N模式;在腿肌中，BRD2基因從E14 d到1 d的表達(dá)減少，而后略有增加，7 d之后開始下降，在14 d時降至最低值。

3 討論

含溴結(jié)構(gòu)域蛋白共分為8個亞族，BRD2是第二亞族（Sub-family II）溴結(jié)構(gòu)域和超末端結(jié)構(gòu)域（Bromodomain and extra-terminal domain，BET）蛋白家族成員（Lloyd and Glass，2018）。作為BET家族成員之一，BRD2蛋白具有2個串聯(lián)的N-末端BD結(jié)構(gòu)域和1個保守的C-末端外ET結(jié)構(gòu)域。BET成員雖具有相似結(jié)構(gòu)，但各成員間的生物學(xué)功能存在一定差異。已有研究表明，BRD2通過在體內(nèi)外與組蛋白H4第12位乙酰化的賴氨酸結(jié)合（Kanno et al.，2004），作為“讀者”（Reader）參與乙?；揎椷^程。乙?；揎椬鳛橐环N翻譯后修飾調(diào)控機(jī)制在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)的亞細(xì)胞器內(nèi)廣泛存在（楊雨薇等，2019）。相關(guān)研究表明，人類的BRD2蛋白存在于細(xì)胞核內(nèi)（Denis and Green，1996），小鼠的BRD2蛋白也位于細(xì)胞核中（Guo et al.，2000）。本研究通過將BRD2基因插入真核表達(dá)載體pEGFP-C1中，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pEGFP-BRD2，并轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)融合蛋白EGFP-BRD2主要定位在細(xì)胞核，而EGFP蛋白定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，表明雞BRD2蛋白存在于細(xì)胞核內(nèi)。此外，通過核定位信號預(yù)測及與已報道的人類BRD2蛋白核定位信號氨基酸序列比對分析，發(fā)現(xiàn)雞BRD2蛋白核定位信號位于500KKKKKKSEKHK510，為后續(xù)研究雞BRD2蛋白細(xì)胞核定位的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

在果蠅、小鼠和人類的生長發(fā)育相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)BRD2同樣發(fā)揮重要的調(diào)控作用，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中BRD2基因會在增殖的神經(jīng)元祖細(xì)胞中表達(dá)，細(xì)胞周期表現(xiàn)刺激活性，過量表達(dá)時會抑制神經(jīng)元的分化（Garcia-gutierrez et al.，2014）。在已分化的神經(jīng)元細(xì)胞中也能檢測到BRD2基因表達(dá)。當(dāng)大腦內(nèi)所需關(guān)鍵神經(jīng)元細(xì)胞減少則會導(dǎo)致BRD2不足（Velí?ek et al.，2011），若BRD2發(fā)生缺失，將會引起神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖變多，嚴(yán)重者會導(dǎo)致神經(jīng)管延遲閉合（Gyuris et al.，2009），甚至是胚胎的早期死亡（Shang et al.，2009）。通過人類、小鼠和斑馬魚的研究發(fā)現(xiàn)，BRD2基因在卵巢、睪丸、卵子、早期胚胎和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育時高度表達(dá)（Rhee et al.，1998;Dibenedetto et al.，2008; Shang et al.，2009），且在體內(nèi)其他組織中也均有表達(dá)（Shang et al.，2009），但表達(dá)量在不同發(fā)育階段有所不同。

本研究通過實時熒光定量PCR檢測BRD2基因在雞生長發(fā)育過程中的表達(dá)規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BRD2基因在眼球內(nèi)的表達(dá)先下降后趨于穩(wěn)定，雞眼球中包括鞏膜、角膜、血管膜、睫狀體、晶狀體、玻璃體、視網(wǎng)膜等，其中視網(wǎng)膜上最后一根神經(jīng)已達(dá)視頂蓋（劉黎和蘇國輝，1988），其后眼部神經(jīng)發(fā)育基本完全，BRD2基因表達(dá)也與這一過程基本一致;BRD2在雞腦組織中的表達(dá)呈先下降后上升的變化趨勢，但其變化幅度不明顯，可能與腦組織神經(jīng)的發(fā)育有關(guān)，E14 d后大腦皮質(zhì)功能就已出現(xiàn)分區(qū)、小腦溝回增多，E20 d時大腦組織發(fā)育較快（阿依木古麗等，2011），BRD2基因表達(dá)處于較穩(wěn)定的狀態(tài);E8 d時雞胚的心臟已基本發(fā)育完成（張月娟，2004），BRD2基因在心臟的表達(dá)與在腦組織的表達(dá)規(guī)律基本一致;1 d前BRD2基因在肝臟的表達(dá)較穩(wěn)定，1 d后開始逐漸增加，可能是由于肝臟可再生，BRD2蛋白可調(diào)節(jié)肝細(xì)胞再生過程（Russell et al.，2018）;BRD2基因在肺臟中1 d前表達(dá)逐漸下降，1 d后急劇上升，在肌胃中BRD2基因表達(dá)整體上呈倒N表達(dá)模式，雖未有相關(guān)研究證實BRD2與二者生長發(fā)育有相關(guān)聯(lián)系，但有研究表明BRD2與肺癌、胃癌有聯(lián)系（Riveiro et al.，2016;Chen et al.，2019）;在胸肌中的表達(dá)亦呈倒N模式，BRD2基因在腿肌中的表達(dá)呈先下降后上升再下降的模式，二者雖未有相關(guān)研究表明與BRD2的相關(guān)性，但從相關(guān)表現(xiàn)上來看1 d后有一定程度的上升可能與免疫調(diào)控相關(guān)。可見，本研究為后續(xù)揭示BRD2基因調(diào)控雞相關(guān)組織發(fā)育的作用機(jī)制打下了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 王 暉）

收稿日期：2020-02-19

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31960698，31760732）;貴州省科技計劃項目（黔科合平臺人才〔2017〕5788號）

作者簡介：*為通訊作者，段志強(qiáng)（1985-），博士，副教授，主要從事家禽抗病育種與疫病防控研究工作，E-mail：zqduan@gzu.edu.cn。韓一帆（1996-），研究方向為動物遺傳育種與繁殖，E-mail：715709631@qq.com